腫瘤的分子生物學(xué)檢驗最新）

1、腫瘤的分子生物學(xué)檢驗 2021/4/261專業(yè) 課件腫瘤標(biāo)志物的研究歷史第1階段（1963-1978）：癌胚性抗原1963年 Abelev AFP1965年 Gold & Freeman CEA第2階段（1979-1989）：糖鏈抗原為主1980年 Koprowski CA19-9（1116-NS-19-9）1981年 Bast CA125（OC125）第3階段（1990以后）：基因標(biāo)志腫瘤基因標(biāo)志2021/4/262專業(yè) 課件一、原癌基因(oncogene，onc)及其表達(dá)產(chǎn)物的作用1、定義： 原癌基因是指人類或其他動物細(xì)胞（以及致癌病毒）固有的一類基因，能誘導(dǎo)細(xì)胞正常轉(zhuǎn)化并使之獲得新生物特

2、征的基因總稱。原癌基因包括病毒癌基因（v-onc）和細(xì)胞癌基因（c-onc）兩種，它們在正常情況下以非激活的形式存在，故稱原癌基因。負(fù)責(zé)調(diào)控正常細(xì)胞的生命活動，包括細(xì)胞增生、生長因子信號傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。一旦這類基因發(fā)生某些錯誤或功能喪失時，極易導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒拐＜?xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤的轉(zhuǎn)化基因或癌基因。2021/4/263專業(yè) 課件2、特點(diǎn)：（1）v-onc是病毒基因組中特殊的核苷酸序列，能 引起細(xì)胞轉(zhuǎn)化（2）c-onc是存在于正常細(xì)胞基因組中的癌基因， 在正常情況下處于靜止或低表達(dá)的狀態(tài)，不 僅對細(xì)胞無害，而且對維持細(xì)胞正常功能具 有重要作用，但在異常表達(dá)時，其

3、產(chǎn)物可使 細(xì)胞無限制分裂 2021/4/264專業(yè) 課件細(xì)胞癌基因與病毒癌基因核酸序列有同源性即它們的DNA序列是相對應(yīng)的，表達(dá)產(chǎn)物也基本相同 2021/4/265專業(yè) 課件細(xì)胞癌基因的作用：通過其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)來體現(xiàn)的，負(fù)責(zé)調(diào)控正常細(xì)胞的生命活動，包括細(xì)胞增生、生長因子信號傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。 2021/4/266專業(yè) 課件二、癌基因定義：原癌基因在進(jìn)化上高度保守，負(fù)責(zé)調(diào)控正常細(xì)胞的生命活動，包括細(xì)胞增生、生長因子信號傳遞、細(xì)胞周期進(jìn)展、細(xì)胞存活以及DNA轉(zhuǎn)錄等。一旦這類基因發(fā)生某些錯誤或功能喪失時，極易導(dǎo)致原癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榭墒拐＜?xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤的轉(zhuǎn)化基因或癌基因20

4、21/4/267專業(yè) 課件三、原癌基因的激活機(jī)制 原癌基因具有正常的生理功能，被激活時又具有致癌能力，因此研究原癌基因如何被激活是很重要的。 現(xiàn)已證實(shí) 射線輻射 化學(xué)致癌劑 病毒感染 2021/4/268專業(yè) 課件(一)原癌基因點(diǎn)突變(point mutation) 癌基因在編碼順序的特定位置上的某一個核苷酸發(fā)生突變，使其表達(dá)蛋白質(zhì)中相應(yīng)的氨基酸發(fā)生變化，從而獲得了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的活性 mutation2021/4/269專業(yè) 課件(二)原癌基因獲得外源啟動子而激活 腫瘤細(xì)胞中原癌基因的表達(dá)水平可以其轉(zhuǎn)錄的mRNA或翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)的含量來表示 在原癌基因的上游插入外源性啟動子或增強(qiáng)子可激活原癌基因，

5、使其表達(dá)產(chǎn)物增多 病毒的增強(qiáng)子常位于5端的長末端重復(fù)序列(1ong terminal repeat，LTR)內(nèi)。如果增強(qiáng)子插入到原癌基因的附近或遠(yuǎn)處，均使之激活，促使癌基因的表達(dá)比正常表達(dá)增高幾十甚至上百倍 2021/4/2610專業(yè) 課件9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。2022/7/52022/7/5Tuesday, July 5, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。2022/7/52022/7/52022/7/57/5/2022 9:00:36 PM11、人總是珍惜為得到。2022/7/52022/7/52022/7/5Jul-2205-Jul-2212、人亂于心，不寬余

6、請。2022/7/52022/7/52022/7/5Tuesday, July 5, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。2022/7/52022/7/52022/7/52022/7/57/5/202214、抱最大的希望，作最大的努力。05 七月 20222022/7/52022/7/52022/7/515、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。七月 222022/7/52022/7/52022/7/57/5/202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2022/7/52022/7/505 July 202217、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。2022/7/52022/7/520

7、22/7/52022/7/5 (三)原癌基因甲基化程度降低而激活 DNA分子中的甲基化(methylation)對阻抑基因的轉(zhuǎn)錄具有重要作用 2021/4/2612專業(yè) 課件現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸腺癌和小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞中，ras基因的DNA甲基化水平比其鄰近的正常細(xì)胞明顯偏低，提示某些原癌基因是由于甲基化程度降低而激活 2021/4/2613專業(yè) 課件 (四)原癌基因的拷貝數(shù)增加基因擴(kuò)增(amplification)： 某些癌基因通過一些機(jī)制在原來的染色體上復(fù)制多個拷貝，超出了正常細(xì)胞的癌基因劑量，導(dǎo)致基因產(chǎn)物的增加，從而使細(xì)胞正常功能紊亂 例如： 人視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：N-myc擴(kuò)增了10-200倍，相

8、應(yīng)的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物也都大量增加 2021/4/2614專業(yè) 課件 (五)基因易位或重排使原癌基因激活 基因易位（translocation）基因重排（rearrangemant）： 有些癌基因從其染色體的正常位置轉(zhuǎn)移到另一染色體的某個位置，由于調(diào)控環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致從相對靜止?fàn)顟B(tài)變成激活狀態(tài)，使原癌基因表達(dá)產(chǎn)物顯著增加而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 2021/4/2615專業(yè) 課件 染色體易位使位于9q34的c-abl基因轉(zhuǎn)移到第22對染色體上，重排形成bcr-abl融合基因，使表達(dá)增高，蛋白質(zhì)產(chǎn)物也由p145變成p210，其酪氨酸蛋白激酶活性大為增加，導(dǎo)致慢性粒細(xì)胞白血病的發(fā)生 2021/4/261

9、6專業(yè) 課件 四、抑癌基因 抑癌基因(suppresser gene)又稱抗癌基因(anti-onc)，是存在于正常細(xì)胞內(nèi)的一類可抑制細(xì)胞生長的基因，并有潛在抑癌作用。當(dāng)這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時，可引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生 2021/4/2617專業(yè) 課件（一）抑癌基因及其表達(dá)產(chǎn)物 抑癌基因與調(diào)控細(xì)胞分裂和分化過程相關(guān)，可能與生長因子、某些蛋白激酶類活性密切相關(guān)，只是抑癌基因給予細(xì)胞的信號與原癌基因相反 2021/4/2618專業(yè) 課件（二）抑癌基因失活機(jī)理1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retino-blastoma，Rb)（1）特點(diǎn)：基因組成：27個外顯子，3-17外顯子區(qū)域是基 因重組

10、和突變的熱點(diǎn) 編碼：p105的蛋白質(zhì)，其有結(jié)合DNA的活性， 可受多種激酶系統(tǒng)催化而發(fā)生磷酸化 2021/4/2619專業(yè) 課件 （2）作用： 不同程度磷酸化后，都可使p105活性缺乏或完全消失。非磷酸化的Rb可防止細(xì)胞增殖，當(dāng)DNA腫瘤病毒抗原結(jié)合了非磷酸化的Rb時，Rb的活性就受到抑制，使細(xì)胞轉(zhuǎn)化為無限增殖狀態(tài)，形成腫瘤 2021/4/2620專業(yè) 課件對于大量來自視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的Rb基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Rb基因完全或部分發(fā)生缺失；另一些Rb腫瘤中，基因完整，但序列分析顯示有一個突變，它常發(fā)生于剪接點(diǎn)上，由于這一變異導(dǎo)致Rb mRNA組裝時有外顯子被漏掉，因而產(chǎn)生異常Rb蛋白質(zhì) 2021

11、/4/2621專業(yè) 課件 抑癌基因又稱為隱性癌基因 基因1 基因2原癌基因 M W 腫瘤抑癌基因 M W M M 腫瘤2021/4/2622專業(yè) 課件（2）p53基因特點(diǎn)：17p13，11個外顯子，10個內(nèi)含子編碼：393個氨基酸，p532021/4/2623專業(yè) 課件作用：產(chǎn)物能結(jié)合DNA和被磷酸化。（1）抑制腫瘤細(xì)胞停滯在修復(fù)前期不能進(jìn)入S期復(fù)制DNA而促使細(xì)胞凋亡 2021/4/2624專業(yè) 課件野生型p53的蛋白質(zhì) p53下調(diào)bcl-2而上調(diào)bax，促進(jìn)細(xì)胞凋亡過程。向丟失p53等位基因的腫瘤細(xì)胞中導(dǎo)入野生型p53就會使腫瘤細(xì)胞凋亡2021/4/2625專業(yè) 課件 正常細(xì)胞的生長增殖由

12、兩大基因調(diào)控 正調(diào)控信號：促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖，并且阻止 其發(fā)生終末分化癌基因 負(fù)調(diào)控信號：促進(jìn)細(xì)胞成熟，向終末分化，最 后凋亡（apoptosis）抑癌基因 兩種信號保持著動態(tài)平衡，對正常細(xì)胞的生長、增殖、死亡精確地調(diào)控，當(dāng)平衡被破壞，正調(diào)控信號基因功能過盛或負(fù)調(diào)控信號基因失活，導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)控的混亂而使細(xì)胞惡變 2021/4/2626專業(yè) 課件 原癌基因的激活1、ras基因的變異2myc基因的變異抑癌基因的失活1、Rb基因的失活2、p53基因的失活 3、其他： BRCA1和BRCA2：與遺傳性高發(fā)乳腺癌相關(guān)的基因，與卵巢癌的發(fā)生也緊密相關(guān) 2021/4/2627專業(yè) 課件五、檢測方法：1、P

13、CRASO探針法(PCR-allele-specific oligonucleotide） 被檢基因片段經(jīng)PCR擴(kuò)增并經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，分別與經(jīng)標(biāo)記的野生型和突變型靶基因序列的寡核苷酸探針雜交。由于長度為20個堿基左右的探針中僅1個堿基的差異便會使其Tm值下降5.07.5，因此通過嚴(yán)格控制雜交條件，可以使PCR產(chǎn)物與完全互補(bǔ)的探針進(jìn)行雜交，也即野生型序列的產(chǎn)物僅與野生型探針雜交，含突變序列的產(chǎn)物僅與突變探針雜交。根據(jù)有無雜交信號可判斷被檢擴(kuò)增片段中是否帶有突變點(diǎn)。 2021/4/2628專業(yè) 課件2、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長度多態(tài)（PCR RFLP）

14、分析技術(shù)是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。DNA堿基置換正好發(fā)生在某種限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)上，使酶切位點(diǎn)增加或者消失，利用這一酶切性質(zhì)的改變，PCR特異擴(kuò)增包含堿基置換的這段DNA，經(jīng)某一限制酶切割，再利用瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，與正常比較來確定是否變異。應(yīng)用PCR RFLP，可檢測某一致病基因已知的點(diǎn)突變，進(jìn)行直接基因診斷，也可以此為遺傳標(biāo)記進(jìn)行連鎖分析進(jìn)行間接基因診斷。2021/4/2629專業(yè) 課件3、PCR-SSCP、測序等單鏈DNA分子具有特定的二級空間構(gòu)象，取決于該分子本身的堿基組成突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時

15、，不同構(gòu)象的單鏈片段具有不同的電泳遷移率，從而能區(qū)別正常與突變的DNA2021/4/2630專業(yè) 課件4、變性梯度凝膠電泳 (DGGE)在設(shè)計引物時應(yīng)使被擴(kuò)增的靶基因片段的兩端含有不同的Tm值，一端較高，另一端相對較低。將PCR產(chǎn)物在含有梯度濃度變性劑的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行分離，當(dāng)泳動至變性劑相應(yīng)濃度的位置時，產(chǎn)物片段中Tm值較低一端的雙鏈被部分變性而解鏈，這種部分解鏈的構(gòu)象致使該片段的電泳遷移率大大降低。由于野生序列與突變序列的PCR產(chǎn)物片段的Tm不同，它們在電泳過程中被部分解鏈的先后不同，經(jīng)過一定時間的電泳，可以發(fā)現(xiàn)這些產(chǎn)物片段在凝膠中所處的位置也不同，據(jù)此，可以區(qū)別野生序列片段還是突變序

16、列片段。2021/4/2631專業(yè) 課件5、Southern Blot具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則特異性地雜交形成雙鏈。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色。2021/4/2632專業(yè) 課件6、基因芯片 集成化的核酸分子雜交技術(shù)2021/4/2633專業(yè) 課件謝 謝2021/4/2634專業(yè) 課件9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。05-7月-2205-7月-22Tuesday

17、, July 5, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*7/5/2022 9:00:37 PM11、人總是珍惜為得到。05-7月-22*Jul-2205-Jul-2212、人亂于心，不寬余請。*Tuesday, July 5, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。05-7月-2205-7月-22*05 July 202214、抱最大的希望，作最大的努力。05 七月 2022*05-7月-2215、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。七月 22*05-7月-22*05 July 202216、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。*7/5/202217、一個人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不

18、息。*05-7月-22謝謝大家2021/4/2635專業(yè) 課件9、 人的價值，在招收誘惑的一瞬間被決定。05-7月-2205-7月-22Tuesday, July 5, 202210、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。*7/5/2022 9:00:37 PM11、人總是珍惜為得到。05-7月-22*Jul-2205-Jul-2212、人亂于心，不寬余請。*Tuesday, July 5, 202213、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。05-7月-2205-7月-22*05 July 202214、抱最大的希望，作最大的努力。05 七月 2022*05-7月-2215、一個人炫耀什么，說明他內(nèi)心缺少什么。七月 22*0