分子生物學(xué)：第十二章 功能基因組學(xué)

1、第十二章 功能基因組學(xué) 關(guān)于基因組學(xué)的研究,越來越多地放在對(duì)系統(tǒng)和整體的功能把握上，而信息技術(shù)的支持，使高通量的研究成為可能。本章介紹了功能基因組學(xué)研究中對(duì)生物大分子和生物活性小分子分析的相關(guān)技術(shù)，以及功能基因組學(xué)的部分分支領(lǐng)域：藥物基因組學(xué)、中藥基因組學(xué)、疾病基因組學(xué)、化學(xué)基因組學(xué)和元基因組學(xué)的有關(guān)知識(shí)，還介紹了化學(xué)生物學(xué)與功能基因組學(xué)的關(guān)系。 第一節(jié) 功能基因組學(xué)的內(nèi)涵 第二節(jié) 功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù)第三節(jié) 功能基因組學(xué)的分支領(lǐng)域 第四節(jié) 中藥基因組學(xué)與中藥化學(xué)組學(xué) 第一節(jié) 功能基因組學(xué)的內(nèi)涵 功能基因組學(xué)（functional genomics）是以全面研究所有基因的功能為中心，并結(jié)合基因

2、功能解決生物醫(yī)學(xué)中的基礎(chǔ)和應(yīng)用問題的學(xué)科。 后基因組學(xué)時(shí)代九大變化趨勢(shì), （1）由結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)轉(zhuǎn)變；（2）由基因組學(xué)向蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)變；（3）由以作圖為基礎(chǔ)的基因鑒定向以序列為基礎(chǔ)的基因鑒定轉(zhuǎn)變；（4）由單基因病研究向多基因病研究轉(zhuǎn)變；（5）由對(duì)疾病的特異性診斷向疾病易感性監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)變；（6）由分析單個(gè)基因向分析基因家族、生化通路和系統(tǒng)中的多基因組合轉(zhuǎn)變；（7）由研究基因的作用向研究基因作用的調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)變；（8）由研究疾病的病因（特異性突變）向研究疾病的病理發(fā)生（機(jī)制）轉(zhuǎn)變；（9）由研究單一種屬向研究多種種屬轉(zhuǎn)變。功能基因組研究?jī)?nèi)容包括 以模式生物體作為功能基因組學(xué)的工具 基因組的表達(dá)

3、調(diào)控研究 基因組多樣性的研究 第二節(jié) 功能基因組學(xué)相關(guān)技術(shù) 2.1 基因打靶和基因敲除 基因打靶是指外源DNA分子與受體細(xì)胞染色體上的同源序列之間發(fā)生重組，并整合到預(yù)定位點(diǎn)，從而改變細(xì)胞遺傳特性的方法?；虼虬屑夹g(shù)能把外源基因引入到染色體DNA的特定片斷上，除了基因敲除的效果外，還可對(duì)宿主細(xì)胞染色體的基因進(jìn)行精細(xì)的改造，還可以進(jìn)行基因敲入。 2.2基因表達(dá)譜系分析 表達(dá)譜差異分析，主要包括基因表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)譜。 芯片（微陣列）技術(shù)是研究基因組織表達(dá)譜的利器。 2.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片檢測(cè)基因突變，主要應(yīng)用于與腫瘤和遺傳疾病相關(guān)的基因多態(tài)性?；蚨鄳B(tài)性研究雖屬于結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的范疇，但與

4、功能基因組學(xué)密不可分。其重點(diǎn)是研究基因多態(tài)性與表型的關(guān)系。 2.4 蛋白互作功能鑒定技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng) ，免疫共沉淀，表面等離子共振技術(shù)(SPR) ，酵母雙雜交系統(tǒng)的工作原理 2.5細(xì)胞篩選技術(shù) 包括高通量細(xì)胞篩選技術(shù)和高內(nèi)涵細(xì)胞表型篩選技術(shù) 2.5.1高通量細(xì)胞篩選技術(shù) 除了與細(xì)胞表型或形態(tài)學(xué)相關(guān)的檢測(cè)指標(biāo)外，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、糖代謝、能量產(chǎn)生和代謝產(chǎn)物分析等也是基因功能重要的研究?jī)?nèi)容。 2.5.2 高內(nèi)涵細(xì)胞表型篩選技術(shù) 高內(nèi)涵技術(shù)建立在自動(dòng)高解析度光學(xué)/熒光顯微圖像獲取技術(shù)（硬件）和后續(xù)的自動(dòng)數(shù)字圖像分析處理儲(chǔ)存技術(shù)（軟件）整合基礎(chǔ)之上。這種技術(shù)主要是用于各種細(xì)胞表型的篩選，如增殖、凋

5、亡、分化、衰老、細(xì)胞周期、黏附等細(xì)胞表型的變化等。 2.6 細(xì)胞芯片技術(shù) 通過基因轉(zhuǎn)染將候選基因?qū)爰?xì)胞，或直接將基因表達(dá)產(chǎn)物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。然后篩選有相應(yīng)變化的細(xì)胞。細(xì)胞芯片技術(shù)最初在2001年發(fā)明。將表達(dá)質(zhì)粒、凝膠核轉(zhuǎn)染試劑混合物，以點(diǎn)陣形式點(diǎn)樣到經(jīng)過包被的玻片上。再把細(xì)胞以鋪片方法覆蓋在點(diǎn)樣的玻片上。細(xì)胞可以攝取并表達(dá)點(diǎn)在玻片上的質(zhì)粒，結(jié)果一個(gè)質(zhì)粒DNA點(diǎn)僅僅轉(zhuǎn)染覆蓋在它上面的細(xì)胞，使得被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和DNA序列點(diǎn)陣以同樣形式排列在玻片上。 用于單細(xì)胞檢測(cè)和篩選的芯片 2.7 硅片基因克隆技術(shù) 不經(jīng)過有化學(xué)藥品的實(shí)驗(yàn)室工作，將網(wǎng)絡(luò)中的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行整理、分析和拼接，得到新基因全長(zhǎng)序列，并對(duì)

6、其推導(dǎo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能作初步預(yù)測(cè)，是一種高效多產(chǎn)的基因克隆方法，又稱硅片克隆。 硅片克隆的序列分析和基因定位 基因定位用電子PCR方法 2.8 功能基因組研究策略存在的問題 前提是細(xì)胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達(dá)的水平，但事實(shí)并不完全如此，從DNA到mRNA再到蛋白質(zhì)，至少存在三個(gè)層次的調(diào)控。組織中mRNA豐度與蛋白質(zhì)豐度的相關(guān)性并不好，尤其對(duì)于低豐度蛋白質(zhì)來說，相關(guān)性更差。蛋白質(zhì)復(fù)雜的翻譯后修飾、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位或遷移、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用等，則幾乎無法從mRNA水平來判斷。 第三節(jié) 功能基因組學(xué)的分支領(lǐng)域 3.1 藥物基因組學(xué)3.1.1 藥物基因組學(xué)的定義藥物基因組學(xué)（phamaco

7、genomics），是一門利用HGP對(duì)基因結(jié)構(gòu)與功能研究的成就，來研究藥物對(duì)基因結(jié)構(gòu)和功能的影響,也即研究藥物與基因組的相互作用及其作用規(guī)律的學(xué)科 (也有譯為藥理基因?qū)W)。它是功能基因組學(xué)與分子藥理學(xué)的有機(jī)結(jié)合 。藥物基因組學(xué)不是發(fā)現(xiàn)新的基因，不是探明疾病的發(fā)生機(jī)理，不是預(yù)見發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及診斷疾病，而是研究遺傳因素對(duì)藥物效應(yīng)的影響，確定藥物作用的靶點(diǎn)，即從表型到基因型的藥物反應(yīng)的個(gè)體多樣性的研究。 3.1.2 基于基因型的個(gè)體化治療 HGP測(cè)序研究結(jié)果表明，全人類各個(gè)個(gè)體之間有99.9%以上的基因堿基順序是相同的，各個(gè)體之間的差別僅僅在于基因中這不足0.1%的序列上。藥理基因組學(xué)就是要研究個(gè)體之間

8、在藥物代謝和效應(yīng)方面發(fā)生差別的遺傳基礎(chǔ)。 3.1.3 多態(tài)性與藥效的關(guān)系 基因多態(tài)性及表達(dá)水平的多態(tài)性與藥效的關(guān)系，可以有如下三類關(guān)系：（1） 基因多態(tài)性；（2） 表達(dá)水平多態(tài)性；（3） 基因多態(tài)性和微生物的抗藥性。 3.2 疾病基因組學(xué) 3.2.1 疾病基因組學(xué)的定義 疾病基因組學(xué)（也叫醫(yī)學(xué)基因組學(xué)）就是研究人類疾病在基因水平上的發(fā)病機(jī)制。 3.2.2 單核苷酸多態(tài)性與疾病基因組學(xué) 在反義序列和已公布的250萬(wàn)SNPs的基因組之間進(jìn)行比較，這些SNP中可能僅僅一個(gè)部分證明與藥物反應(yīng)和疾病過程有關(guān)，由此可確定所有功能性重要變異。 與疾病有關(guān)的一定的SNPs并不一定預(yù)示著必然發(fā)病。 3.2.3

9、定位候選基因 由于人類基因很快地被精確定位于染色體的不同區(qū)域，因此一旦某個(gè)疾病位點(diǎn)被定位（通過正?；蛐蛄泻图膊』蛐蛄袑?duì)比就可確定），就可從局部序列圖中挑選出結(jié)構(gòu)與功能相關(guān)的基因，并對(duì)比加以分析，采用這種“定位候選基因”策略，就可在分子水平上找到治療的準(zhǔn)確方法。 疾病基因型與表型存在多因素致病、多基因調(diào)控、涉及多個(gè)層次、臨床表形復(fù)雜等特征。 3.2.4 系統(tǒng)生物學(xué)思想 運(yùn)用“序列結(jié)構(gòu)功能”的生物學(xué)觀點(diǎn)是疾病機(jī)制研究的基礎(chǔ)。當(dāng)前從“相互作用網(wǎng)絡(luò)功能”的模式出發(fā)，在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組層次研究基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的豐富信息成為后基因組學(xué)、生物信息學(xué)的前沿和熱點(diǎn)。功能基因組研究也開始朝復(fù)雜

10、系統(tǒng)的方向發(fā)展。這為復(fù)雜性疾病在大量已有數(shù)據(jù)資料的分析處理基礎(chǔ)上，由局部朝向整體，由孤立朝向系統(tǒng)提供了可能。 3.3 比較基因組學(xué) 來自不同生物的同源基因的相似性，可以提供未知基因的功能信息。通過一種生物的基因組信息，有助于了解另一種生物的基因組。 3.4 元基因組學(xué) 3.4.1 元基因組學(xué)的定義 把多種微生物聚居在一起形成的系統(tǒng)叫做“微生物群落”，也稱菌群。微生物生態(tài)群落中的所有微生物基因組的總和稱為“元基因組”。 分析菌群中微生物基因組序列和功能, 可以發(fā)現(xiàn)大量新的基因。這個(gè)方法，就是元基因組學(xué)。 3.4.2 人類元基因組計(jì)劃 人體內(nèi)生活著大量的“親密的陌生者”，它們的組成和活動(dòng)與人的生長(zhǎng)

11、發(fā)育、生老病死息息相關(guān)，是我們離不了的“另一半”。它們就是人體內(nèi)的共生菌群。 人類元基因組是對(duì)生活在人體內(nèi)微生物基因組的統(tǒng)稱。 3.5化學(xué)基因組學(xué) 3.5.1 化學(xué)基因組學(xué)與化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)化學(xué)基因組學(xué)的研究，主要是在化學(xué)配基的合成、篩選和確認(rèn)的精密技術(shù)快速發(fā)展的背景下產(chǎn)生的,整合了組合化學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)、藥物學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù),采用具有生物活性的化學(xué)小分子配體作為探針,研究與人類疾病密切相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)的生物功能,同時(shí)為新藥開發(fā)提供具有高親和性的藥物先導(dǎo)化合物。3.5.2 靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的意義 藥物作用靶點(diǎn)的探測(cè)與驗(yàn)證，是新藥發(fā)現(xiàn)階段中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，成為制約新藥開發(fā)速度的瓶頸。

12、人類基因組計(jì)劃初步完成后，人體中可以做為潛在藥物作用的靶點(diǎn)，是人類過去100年中發(fā)現(xiàn)的靶點(diǎn)的20倍。大量潛在靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)成為新藥研究的突破口。3.5.3 組合化學(xué) 組合化學(xué), 亦稱同步多重合成化學(xué)，或組合合成化學(xué), 是一種將化學(xué)合成、組合理論、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和機(jī)械手結(jié)為一體的技術(shù)。藥物化學(xué)家可在短時(shí)間內(nèi)將購(gòu)買的或自己合成的不同結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)模塊, 通過化學(xué)合成或生物合成，以共價(jià)鍵系統(tǒng)地、反復(fù)地進(jìn)行連接, 從而產(chǎn)生大批相關(guān)的化合物, 總稱為化合物庫(kù)。 合成的化合物庫(kù)提供給藥理學(xué)家進(jìn)行藥理篩選,試驗(yàn)它們的生物活性, 分離鑒定出活性化合物的結(jié)構(gòu),并且作為深入開發(fā)的目的物。如此就免除了單個(gè)化合物的單獨(dú)合成及

13、結(jié)構(gòu)測(cè)定, 大大簡(jiǎn)化了藥物的發(fā)現(xiàn)過程。組合化學(xué)使短時(shí)間大量合成不同化合物成為可能。 3.5.4 化學(xué)基因組學(xué)的技術(shù)平臺(tái)（一） 用于小分子測(cè)定的質(zhì)譜技術(shù) （二） 核磁共振技術(shù) （三） 其他新技術(shù)如毛細(xì)管電泳技術(shù)、原子力顯微鏡技術(shù)、差式掃描量熱技術(shù)等等。 3.5.5 化學(xué)基因組學(xué)藥物發(fā)現(xiàn)模式 靶標(biāo)的確認(rèn) 高通量篩選 組合化學(xué)合成生物學(xué)功能測(cè)試等 3.5.6 化學(xué)基因組學(xué)的應(yīng)用 化學(xué)基因組學(xué)是以小分子配基的合成為背景產(chǎn)生的。小分子配體由于分子體積小可以自由進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并與靶蛋白具有特異性的親和作用，這些特點(diǎn)使得小分子配體廣泛應(yīng)用于與藥物靶點(diǎn)相關(guān)的基因表達(dá)譜、蛋白質(zhì)表達(dá)譜和基因相互作用的全功能分析等

14、。 3.5.7化學(xué)基因組學(xué)的發(fā)展前景 哈佛大學(xué)Schreiber教授提出的化學(xué)基因組學(xué)的“一個(gè)基因一個(gè)化合物（one gene one compound）”計(jì)劃，即為每一個(gè)基因發(fā)現(xiàn)一個(gè)調(diào)控其功能的小分子化合物，用于功能基因組研究和藥物開發(fā)。 化學(xué)基因組學(xué)的目的，是為基因組中的每一個(gè)生物大分子（主要是蛋白質(zhì)）尋找一類特異性結(jié)合小分子化合物（天然產(chǎn)物或合成化合物），再用這些化合物為探針研究基因組的功能以及發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶標(biāo)、途徑和網(wǎng)絡(luò) 3.6 化學(xué)生物學(xué) 化學(xué)生物學(xué)是一門運(yùn)用小分子化合物作為探針，研究基因組的功能、發(fā)現(xiàn)能夠調(diào)控基因功能的活性化合物的科學(xué) 。3.6.1由化學(xué)生物學(xué)驅(qū)動(dòng)的功能基因組/

15、化學(xué)基因組學(xué)研究 系統(tǒng)生物學(xué)是系統(tǒng)性地研究一個(gè)生物系統(tǒng)中所有組成成分(基因、mRNA、蛋白質(zhì)、小分子代謝產(chǎn)物等)的構(gòu)成，以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系。 3.6.2 由化學(xué)生物學(xué)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡和信號(hào)傳導(dǎo)通路功能基因組研究 美國(guó)Harvard大學(xué)袁鈞瑛教授“化學(xué)生物學(xué)中的細(xì)胞水平篩選(Cell Based Screen in Chemical Biology)”的工作，發(fā)現(xiàn)可以選擇性抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力應(yīng)急導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的小分子的作用機(jī)制，利用正向化學(xué)生物學(xué)的方式來研究細(xì)胞凋亡過程信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制，是新思路。 3.6.3 發(fā)展藥物作用新靶標(biāo)、通路和網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)生物學(xué)方法 用化學(xué)生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)和確證藥

16、物作用新靶標(biāo)的策略和方法，證明小分子化合物作為探針發(fā)現(xiàn)藥物靶標(biāo)具有優(yōu)勢(shì)?；瘜W(xué)生物學(xué)方法，是計(jì)算化學(xué)與化學(xué)基因組學(xué)的整合。計(jì)算化學(xué)在功能基因組研究中具有應(yīng)用價(jià)值，生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的計(jì)算模擬方法和策略也與計(jì)算化學(xué)相關(guān)。 3.6.4研究化學(xué)探針分子的設(shè)計(jì)、合成和生物轉(zhuǎn)化 多維特征化學(xué)庫(kù)的構(gòu)建，具有必要性。化合物探針庫(kù)結(jié)構(gòu)多樣性對(duì)于研究基因功能和發(fā)現(xiàn)新化合物實(shí)體十分重要。多維特征化合物庫(kù)是化合物多樣性的重要來源，必將在化學(xué)生物學(xué)及創(chuàng)新藥物研究中發(fā)揮重要作用。 第四節(jié) 中藥基因組學(xué)與中藥化學(xué)組學(xué) 中藥，指在中國(guó)的生物資源以及少量礦物資源基礎(chǔ)上，經(jīng)過長(zhǎng)期實(shí)踐，被證明有疾病治療效果的天然藥物，其中的生物材料，是

17、以組織水平甚至是個(gè)體水平出現(xiàn)的。各國(guó)都有類似的天然藥物。 4.1 傳統(tǒng)的中藥藥性理論體系 中藥經(jīng)歷了幾千年的實(shí)踐，已證明是行之有效的疾病治療物質(zhì)，并形成了一套完整的藥性理論體系，是祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論體系中的重要組成部分，是指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥的重要依據(jù)。 一系列中藥有效成分的發(fā)現(xiàn)及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，證明中藥理論及療效的確具有其物質(zhì)基礎(chǔ)。然而這些研究并沒有給中藥理論帶來應(yīng)有的繁榮，相反，甚至引起了中藥學(xué)研究和應(yīng)用危機(jī)。其原因是多方面的 。4.2 “中藥基因組學(xué)”與“中藥化學(xué)組學(xué)”的含義 “中藥基因組學(xué)”的含義，是通過現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)手段，結(jié)合傳統(tǒng)中藥理論和現(xiàn)代科學(xué)理論，將中藥的藥性、功能及主治，與其對(duì)特定疾病相關(guān)基因群表達(dá)和調(diào)控的影響關(guān)聯(lián)起來，在分子水平上用現(xiàn)代基因組學(xué)，特別是功能或疾病基因組學(xué)的理論，來詮釋傳統(tǒng)中藥理論及作用機(jī)理。 “中藥化學(xué)組學(xué)”的含義，是通過現(xiàn)代技術(shù)手段結(jié)合傳統(tǒng)中藥理論和現(xiàn)代科學(xué)理論，闡明與中藥藥性、功能及主治有關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)，即藥效成分的組成、結(jié)構(gòu)、含量、相互作用及性質(zhì)等。 “中藥基因組學(xué)與化學(xué)組學(xué)”的理論依據(jù) (1)中藥的有效性 (2)基因功能異常引起疾病 (3)藥物有其相應(yīng)的作用靶標(biāo) (4)中藥有其作用的物質(zhì)基礎(chǔ) 4.3 研究的策略 研究策略是“翻譯”，即采用現(xiàn)代技術(shù)手