生物制藥工藝學實驗課件3 超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶

1、蛋清中提取溶菌酶實驗三 超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶實驗目的掌握超濾分離技術的原理和操作；掌握鹽析的原理和操作。實驗流程超濾法進一步分離溶菌酶透過液鹽析法沉淀溶菌酶透析法除鹽實驗材料溶液：0.5M NaOH溶液透析緩沖液：0.1M磷酸鈉緩沖液（pH7.0）其他材料：透析袋（800010000Da），超濾膜（30kD），固體硫酸銨，研缽，搗杵等。實驗原理超濾分離技術原理：它是一種膜分離技術，它的特點是使用不對稱多孔膜，根據(jù)分子的大小來分離溶液中的大分子物質與小分子物質。它是一種流體切向流動和壓力驅動的過濾過程。2、分離方式：切向流過濾切向流過濾：溶液沿與超濾膜平行的方向流動，可避免濃差極化，

2、提高超濾速度。 封頭過濾：溶液流動方向與過濾方向一致，隨著過濾的進行，膜表面形成的濾餅層厚度逐漸增大，流速逐漸降低。3、超濾分離過程示意圖4、選擇超濾膜截留分子量：阻留率達90%以上的最小被截留物質的分子量。膜的材質：非特異性吸附低，耐酸堿性好。 Hydrosart膜：纖維素衍生膜，對蛋白質非特異性吸附低，在pH2-14酸堿度范圍內使用，可以用1N NaOH 清洗再生多次，流量恢復率高。 5、超濾的基本流程選擇合適的膜包（考察膜的截留分子量等）；將膜包固定在夾具中（不超過膜的耐受壓力）；選擇合適的切向流速率（不超過膜包的最大允許背壓）；超濾結束后要沖洗膜包；觀察回流液速率，確定是否預過濾溶液。

3、觀察水透過通量，適時清洗膜包；膜包需保存在含防腐劑的溶液中。鹽析沉淀蛋白質原理：大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使蛋白質分子周圍的水化膜層減弱乃至消失，蛋白質相互聚集而沉淀。大量的鹽離子能夠中和蛋白質表面的電荷，使蛋白質之間的靜電斥力降低，導致蛋白質相互聚集而沉淀。由于蛋白質分子的水化膜被破壞，暴露出其疏水區(qū)域，蛋白質的疏水區(qū)域越多，越易沉淀。2、優(yōu)點：較少引起蛋白質變性；3、缺點：在鹽析過程中，易產生共沉現(xiàn)象，故分辨率不高；鹽析后需進行脫鹽步驟。4、注意事項：蛋白質濃度可適當降低，以減少共沉；pH值一般選擇在蛋白質的等電點附近，鹽析效率高；在高鹽下，蛋白質的溶解度一般隨溫度的升高

4、而降低，因此，通常鹽析在室溫下進行鹽析。透析除鹽1、原理：在常壓下，依靠小分子物質的擴散運動將兩類分子量差別較大的物質分離開來。2、注意事項透析袋要留一定空間，以防透析袋脹裂，和因透析袋膨脹引起膜孔徑的變化；透析裝置常加上攪拌系統(tǒng)，并定期或連續(xù)更換新鮮的溶劑，以提高透析效率。3、透析袋：一般是再生纖維素，具有親水性、惰性和良好的物理性能，可再生。4、透析袋的預處理：50乙醇煮沸1h，再分別用50乙醇、0.01mol/L NaHCO3 和0.001mol/L EDTA溶液依次洗滌，最后用蒸餾水浸洗，存放與70乙醇溶液中。透析示意圖實驗步驟超濾分離（四組同學的溶菌酶洗脫液合并超濾）：將溶菌酶洗脫液

5、以合適的流速經過超濾膜（進口壓力不超過 2.0bar ），收集透過液，回流液（吸取 200L于dorf管中，標記為“6”），當透過液與回流液體積比約為3:1時，超濾可結束。超濾結束后，需要用50mM 磷酸緩沖液沖洗膜包；當透過液與回流液體積比約為1:1時，沖洗即可結束。 如果透過液流速減慢，需要用0.5M NaOH溶液清洗膜包，然后再用蒸餾水將堿液沖洗干凈。2、鹽析：在透過液中加入研細的固體硫酸銨粉末（邊攪拌邊加入），硫酸銨的終濃度為35（即100mL 溶液中 35g 硫酸銨），室溫下靜置約2030min，4度、10000rpm、20min。3、透析除鹽：取少量 0.1M 磷酸鈉緩沖液（pH7.0）溶解沉淀，裝入透析袋中，置于適量的0.1M 磷酸鈉緩沖液室溫下攪拌透析過夜，次