實驗九水中總大腸菌群的測定

1、實驗九實驗九 水中總大腸菌群的測定水中總大腸菌群的測定一一 實驗器材實驗器材1 1 培養(yǎng)基培養(yǎng)基乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管）培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂平板乳糖蛋白胨發(fā)酵管（內(nèi)有倒置小套管）培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂平板2 2 溶液和試劑溶液和試劑革蘭氏染色液革蘭氏染色液3 3 儀器和其他用品儀器和其他用品高壓濕熱滅菌器、顯微鏡、載玻片、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌吸管、試管、三角高壓濕熱滅菌器、顯微鏡、載玻片、滅菌培養(yǎng)皿、滅菌吸管、試管、三角瓶、接種環(huán)瓶、接種環(huán)二二 目的要求目的要求1 1 學習檢測水中總大腸菌群的方法。學習檢測水中總大腸菌群的方法。2 2 了解檢測水中總大腸菌群各種方法的原理及其應用中的優(yōu)、缺

2、點。了解檢測水中總大腸菌群各種方法的原理及其應用中的優(yōu)、缺點。3 3 了解水質(zhì)評價的微生物學衛(wèi)生標準，明白其應用的重要性。了解水質(zhì)評價的微生物學衛(wèi)生標準，明白其應用的重要性。實驗八實驗八 水中總大腸菌群的測定水中總大腸菌群的測定三三 基本原理基本原理 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致

3、病菌的可能?？偞竽c菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗?？偞竽c菌群可用多管發(fā)酵法或濾膜法檢驗。 多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具多管發(fā)酵法的原理是根據(jù)大腸菌群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，以及具備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個步驟進行檢備革蘭氏染色陰性，無芽孢，呈桿狀等有關(guān)特性，通過三個步驟進行檢驗求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗結(jié)果以最可能數(shù)簡稱驗求得水樣中的總大腸菌群數(shù)。試驗結(jié)果以最可能數(shù)簡稱MPN表示。食表示。食品中大腸菌群數(shù)系以品中大腸菌群數(shù)系以100mL(g)檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（most probable number,

4、MPN)表示。表示。四四 培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制（1）乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按照說明稱取適量培養(yǎng)基，溶于蒸餾水中，分）乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按照說明稱取適量培養(yǎng)基，溶于蒸餾水中，分裝于試管中，每個試管裝于試管中，每個試管10ml，倒置一德漢氏小管，于，倒置一德漢氏小管，于115高壓滅菌器中高壓滅菌器中滅菌滅菌20min，貯存于冷暗處備用。，貯存于冷暗處備用。（2） 三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述制備方法配制，除蒸餾水外，三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：按上述制備方法配制，除蒸餾水外，培養(yǎng)基用量增加至三倍，分裝于試管中，每個試管培養(yǎng)基用量增加至三倍，分裝于試管中，每個試管5ml 。（3） 伊紅美培養(yǎng)基：按

5、照說明稱取適量培養(yǎng)基，置于三角瓶中，加蒸餾伊紅美培養(yǎng)基：按照說明稱取適量培養(yǎng)基，置于三角瓶中，加蒸餾水溶解，水溶解， 115高壓滅菌高壓滅菌15min，待冷卻至，待冷卻至4550 ，倒平板待用。，倒平板待用。 培養(yǎng)基配制操作圖示：培養(yǎng)基配制操作圖示：用漏斗分裝培養(yǎng)基及擺斜面用漏斗分裝培養(yǎng)基及擺斜面培養(yǎng)基的分裝：培養(yǎng)基的分裝：一般制作斜面培養(yǎng)基時，每只一般制作斜面培養(yǎng)基時，每只1515150150毫米的試管，約裝毫米的試管，約裝3 34 4毫升（毫升（1/41/41/31/3試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只試管高度），如制作深層培養(yǎng)基，每只2020220220毫米毫米的試管約裝的試管約裝121

6、21515毫升。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基，一般以其容積的一毫升。每只錐形瓶裝入的培養(yǎng)基，一般以其容積的一半為宜。半為宜。 包扎1培養(yǎng)皿：以舊報紙密密包緊，一般以培養(yǎng)皿：以舊報紙密密包緊，一般以6套做一包，待滅菌。套做一包，待滅菌。2吸管：在距其粗頭頂端約吸管：在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段處，塞一小段1.5cm長的棉花。棉長的棉花。棉花要塞得松緊恰當（過緊，吹吸液體太費勁；過松，吹氣時棉花會花要塞得松緊恰當（過緊，吹吸液體太費勁；過松，吹氣時棉花會下滑），然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙條的的近左端，與下滑），然后分別將每支吸管尖端斜放在舊報紙條的的近左端，與報紙約呈報紙約呈60角，并

7、將右端多余的報紙打一小結(jié)。角，并將右端多余的報紙打一小結(jié)。3三角玻扒：跟包扎吸管相似，將三角部分斜放在報紙條的近左端，三角玻扒：跟包扎吸管相似，將三角部分斜放在報紙條的近左端，與報紙約呈與報紙約呈45角，并將右端多余的報紙打一小結(jié)。角，并將右端多余的報紙打一小結(jié)。4. 玻璃器皿、金屬器械包扎完畢后置干燥箱玻璃器皿、金屬器械包扎完畢后置干燥箱160170滅菌滅菌2 h. 1.1.滅菌器內(nèi)加入一定量的水，將用滅菌器內(nèi)加入一定量的水，將用防水紙包扎防水紙包扎好的物品放入其中。好的物品放入其中。 2.2.接通電源，進行加熱。接通電源，進行加熱。 3. 3. 排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排出

8、大氣后關(guān)閉排氣閥；排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm0.5kg/cm2 2時再打開排氣閥，待壓力回復到時再打開排氣閥，待壓力回復到0 0時時再關(guān)閉排氣閥。再關(guān)閉排氣閥。 4.4.當壓力達當壓力達15bl/in15bl/in2 2（即（即1.05kg/cm1.05kg/cm2 2）時，此時滅菌器內(nèi)的溫度為）時，此時滅菌器內(nèi)的溫度為1211210 0C C，維持維持30min30min。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應適當降。對熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時，應適當降低壓力，

9、延長時間。低壓力，延長時間。 5.5.滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打滅菌時間一到，切斷電源，待壓力降至零時，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。開滅菌器蓋，取出物品。滅菌高壓蒸汽自動高壓蒸汽自動滅菌鍋滅菌鍋手提式高壓蒸手提式高壓蒸汽滅菌鍋汽滅菌鍋倒平板操作法示意圖倒平板操作法示意圖斜面擺放與冷凝斜面擺放與冷凝五五 操作步驟操作步驟1 水樣的采取水樣的采?。?）檢測自來水）檢測自來水 先將自來水龍頭用火焰燒灼先將自來水龍頭用火焰燒灼3 min滅菌，再開放水龍頭使水流滅菌，再開放水龍頭使水流5 min后，后，在火焰旁打開滅菌三角瓶塞，以其接取水樣，迅速地進行

10、分析。在火焰旁打開滅菌三角瓶塞，以其接取水樣，迅速地進行分析。 （2 2）檢測池水、河水或湖水）檢測池水、河水或湖水 應取距水面應取距水面101015cm15cm的深層水樣，先將滅菌帶玻璃塞的空瓶瓶口向下的深層水樣，先將滅菌帶玻璃塞的空瓶瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，撥開玻璃塞，水即流入瓶中，滿后將玻璃塞塞浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來，撥開玻璃塞，水即流入瓶中，滿后將玻璃塞塞好，再從水中取出。有時需用特制的采樣器取水樣。采取的水樣最好立即好，再從水中取出。有時需用特制的采樣器取水樣。采取的水樣最好立即檢測，否則需放入冰箱中保存。檢測，否則需放入冰箱中保存。3 初發(fā)酵試驗初發(fā)酵試驗 （1）生活飲用水

11、生活飲用水 在兩個裝有已滅菌的在兩個裝有已滅菌的50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的大試管或燒瓶中（內(nèi)有倒管），以無菌操作各加入已充分混勻的水樣倒管），以無菌操作各加入已充分混勻的水樣100mL。在。在10支裝有已滅菌的支裝有已滅菌的5mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無菌操作加入充分混三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒管），以無菌操作加入充分混勻的水樣勻的水樣10mL，混勻后置于，混勻后置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。 （2）水源水水源水在裝有在裝有5ml 3倍濃度濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)基的試管中加入倍濃度濃縮乳糖蛋白胨

12、培養(yǎng)基的試管中加入10ml水樣品；水樣品；于各裝有于各裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL水樣；再于各水樣；再于各裝有裝有10mL乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的5個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入個試管中（內(nèi)有倒管），分別加入1mL 1：10稀釋的水樣。共計稀釋的水樣。共計15管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于管，三個稀釋度。將各管充分混勻，置于37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48h。 （可以根據(jù)水的污染程度選擇（可以根據(jù)水的污染程度選擇3個稀釋度）個稀釋度） 4 分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 將初發(fā)酵的陽性管將初發(fā)酵的陽性管

13、(產(chǎn)酸產(chǎn)氣產(chǎn)酸產(chǎn)氣)的菌液分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂培的菌液分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基平板。置養(yǎng)基平板。置361溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)1824h，然后取出，觀察菌落形態(tài)。，然后取出，觀察菌落形態(tài)。選擇符合大腸菌群菌落特征的菌落選擇符合大腸菌群菌落特征的菌落: 深紫黑色，有金屬光澤；深紫黑色，有金屬光澤； 紫黑色，紫黑色，不帶或略帶金屬光澤；不帶或略帶金屬光澤； 淡紫紅色，中心顏色較深淡紫紅色，中心顏色較深, 挑取一部分，進行革挑取一部分，進行革蘭氏染色。蘭氏染色。 平板劃線分離操作法示意圖5 復發(fā)酵試驗復發(fā)酵試驗 上述涂片鏡檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另上述涂片鏡

14、檢的菌落如為革蘭氏陰性無芽孢的桿菌，則挑選該菌落的另一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒置管），每一部分接種于裝有普通濃度乳糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管中（內(nèi)有倒置管），每管可接種分離自同一初發(fā)酵管的最典型菌落管可接種分離自同一初發(fā)酵管的最典型菌落13個，然后置于個，然后置于37恒溫箱中恒溫箱中培養(yǎng)培養(yǎng)24h，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者，即證實有大腸菌群存在。根據(jù)證實有大腸菌群，有產(chǎn)酸、產(chǎn)氣者，即證實有大腸菌群存在。根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表存在的陽性管（瓶）數(shù)查附表1“大腸菌群檢數(shù)表大腸菌群檢數(shù)表”，報告每升水樣中的大腸，報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)。菌群數(shù)。每組：每組：三倍濃縮乳糖蛋白胨（三倍濃縮乳糖蛋白胨（5 ml）15管管 普通濃度乳糖蛋白胨（普通濃度乳糖蛋白胨（10 ml）15管管伊紅美蘭培養(yǎng)基伊紅美蘭培養(yǎng)基 150 ml (5個平板個平板)三角瓶三角瓶1個（裝個（裝27mL蒸餾水滅菌）、蒸餾水滅菌）、 10ml吸管吸管 2支、支、1ml吸管吸管2支包扎滅菌支包扎滅菌表表2 最可能數(shù)最可能數(shù)(MPN)表表 （接種（接種5份份10mL水樣、水樣、5份份1mL水水樣、樣、5份份0