生物化學(xué)與分子生物學(xué)：第三章 酶

1、第 三 章酶(Enzyme)公元前兩千多年，我國已有釀酒記載酶學(xué)研究簡史1857年，Pasteur認(rèn)為發(fā)酵需要活的酵母細(xì)胞1878年 酶被定名為enzyme (in yeast” 希臘文 en = in ， zyme = yeast)1894年 “鎖-匙”學(xué)說，解釋酶作用的專一性1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵。1903年 酶與底物作用的中間復(fù)合物學(xué)說1913年 米氏方程 解釋酶反應(yīng)機(jī)制酶學(xué)研究簡史巴斯德：發(fā)酵需要活的酵母細(xì)胞（1857）布希奈：不含細(xì)胞的酵母提取液可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵酶學(xué)研究簡史1926年，Sumner首次從刀豆中提純出脲酶結(jié)晶，并指出酶是蛋白質(zhì) 。19

2、82年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。1995年，Jack W.Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme酶學(xué)研究簡史1982年， Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶的概念。1995年， Jack W.Szostak 實(shí)驗(yàn)室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段,即脫氧核酶。 1926年，Sumner從刀豆中提取出脲酶結(jié)晶，并證明是蛋白質(zhì)。酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)經(jīng)酸堿水解終產(chǎn)物是AA能被蛋白酶水解而失活酶可變性失活酶是兩性電解質(zhì)具有不能通過半透膜等膠體性質(zhì)具有蛋白質(zhì)的化學(xué)

3、呈色反應(yīng) 酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的、對特異底物起高效催化作用的蛋白質(zhì)。 酶催化進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)：酶促反應(yīng)S(substrate)P(product)底物產(chǎn)物E(enzyme)酶 酶在機(jī)體中十分溫和的條件下有高效率催化作用；并在多種因素的影響下對代謝發(fā)揮著巧妙的調(diào)節(jié)作用，使得生物體內(nèi)的物質(zhì)代謝有條不紊地進(jìn)行 。酶的生物學(xué)意義：酶學(xué)概論1酶活性的調(diào)節(jié)及測定4酶促反應(yīng)動力學(xué)3酶促反應(yīng)的特點(diǎn)及機(jī)制2本 章 內(nèi) 容5酶與醫(yī)學(xué)的關(guān)系第一節(jié)酶 學(xué) 概 論An Introduction to Enzymes1.氧化還原酶類(oxidoreductases)2.轉(zhuǎn)移酶類 (transferases )3.水解酶類 (hy

4、drolases)4.裂合酶類 (lyases)5.異構(gòu)酶類( isomerases)6.合成酶類 (ligases, synthetases)（一）酶的分類1961年國際酶學(xué)委員會（Enzyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類：一、 酶的分類與命名催化氧化-還原反應(yīng)，催化氫的轉(zhuǎn)移或電子傳遞以及需氧參加的反應(yīng)。 B-H2 + 1/2 O2 B + H2O主要包括脫氫酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。例如：乳酸脫氫酶催化乳酸的脫氫反應(yīng)。1、氧化還原酶 OxidoreductaseAH2 + BA + BH2（1）脫氫酶類：催化直

5、接從底物上脫氫的反應(yīng)AH2 +BA +BH2（需輔酶或輔酶）（2）氧化酶類 催化底物脫氫，氧化生成H2O2：AH2 + O2A + H2O2（需FAD或FMN） 催化底物脫氫，氧化生成H2O：2AH2 + O22A + 2H2O（4）加氧酶（雙加氧酶和加單氧酶）O2 +OHOHC=OC=OOHOH（順，順-已二烯二酸）RH + O2 + 還原型輔助因子ROH + H2O + 氧化型輔助因子（又稱羥化酶）（3）過氧化物酶ROO + H2O2RO + H2O + O2催化基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，即將一個底物分子的基團(tuán)或原子轉(zhuǎn)移到另一個底物的分子上。根據(jù)X分類：轉(zhuǎn)移酮基、醛基、?；?、糖基、烴基、含氮基、含磷基

6、和含硫基的酶。例如：谷丙轉(zhuǎn)氨酶催化的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)。2、轉(zhuǎn)移酶 TransferaseAX + BA +BX催化底物的加水分解反應(yīng)。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反應(yīng)：3、水解酶 hydrolaseAB + H2OAOH + BH水解酶類（hydrolases） 按其所水解的底物不同 根據(jù)它們的作用部位 蛋白酶、酯酶、磷酸酶、糖苷酶、核酸酶 外切酶、內(nèi)切酶 催化從底物分子中移去一個基團(tuán)或原子形成雙鍵的反應(yīng)及其逆反應(yīng)。主要包括脫水酶、脫羧酶及醛縮酶等。例如，延胡索酸酶催化的反應(yīng)。4、裂合酶 Lyase合酶（synthases） 催化反應(yīng)方向相反，

7、一個底物去掉雙鍵，并與另一底物結(jié)合形成一個分子的酶。催化分子異構(gòu)體的互變：分子內(nèi)部基團(tuán)的位置互變、幾何或光學(xué)異構(gòu)體互變、以及醛酮互變包括：變位酶、表構(gòu)酶、異構(gòu)酶例如，6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶催化的反應(yīng)5、異構(gòu)酶 IsomeraseAB又稱為合成酶（Synthetase ）催化兩分子結(jié)合成一分子并偶聯(lián)有高能鍵的水解供能包括： DNA連接酶、氨基酰-tRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶等例如：丙酮酸羧化酶催化的反應(yīng) 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸6、連接酶 LigaseA + B + ATPAB + ADP +Pi(二) 酶的命名1. 習(xí)慣命名法推薦名稱2. 系統(tǒng)命名法系統(tǒng)名稱1、底物酶：如淀粉酶、蛋白酶、

8、脂肪酶等；2、反應(yīng)的性質(zhì)酶：如脫氫酶、脫羧酶、水解酶等；3、底物反應(yīng)的性質(zhì)酶：乳酸脫氫酶4、來源底物酶等：如細(xì)菌淀粉酶、胃蛋白酶等。習(xí)慣命名法優(yōu)點(diǎn) 命名簡單應(yīng)用歷史較長，使用方便缺點(diǎn) 一名數(shù)酶、一酶數(shù)名為了適應(yīng)酶學(xué)發(fā)展的新情況，國際酶學(xué)會議于1961年提出一個新的系統(tǒng)命名法及分類原則，已被國際生化協(xié)會采用。 國際生物化學(xué)會酶學(xué)委員會提出的系統(tǒng)命名法的原則是以酶催化的整體反應(yīng)為基礎(chǔ)的。命名時應(yīng)明確每種酶的底物及催化反應(yīng)的性質(zhì)，若有多個底物都要寫明，其間用冒號（）隔開。 系統(tǒng)命名法習(xí)慣命名法： 乙醇脫氫酶 系統(tǒng)名稱： 乙醇：NAD+氧化還原酶 催化反應(yīng) 乙醇 + NAD+ 乙醛 + NADH系統(tǒng)命

9、名：每個酶都有一個名稱和一個編號酶的分類催化的化學(xué)反應(yīng)舉例系統(tǒng)名稱EC編號推薦名稱氧化還原酶類乙醛 + NADH + H+乙醇：NAD+ 氧化還原酶EC 乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)移酶類草酰乙酸 +L-谷氨酸L-天冬氨酸：-酮戊二酸 氨基轉(zhuǎn)移酶EC 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶水解酶類 D-葡萄糖 + H3PO4D-葡糖-6-磷酸水解酶EC 葡糖6-磷酸酶 裂解酶類 磷酸二羥丙酮 + 醛酮糖-1-磷酸裂解酶EC 醛縮酶 異構(gòu)酶類D-果糖-6-磷酸D-葡糖-6-磷酸 酮-醇異構(gòu)酶EC 磷酸果糖異構(gòu)酶連接酶類L-谷氨酰胺 + ADP + 磷酸L-谷氨酸：氨連接酶EC 谷氨酰胺合成酶酶的分類與命名舉例寡聚酶 由多個相同或不同亞

10、基以非共價鍵連接組成的酶。單體酶 僅具有三級結(jié)構(gòu)的酶。二、 酶的不同結(jié)構(gòu)形式HSCoANAD+丙酮酸脫氫酶復(fù)合體多酶體系 由幾種不同功能的酶彼此聚合形成的多酶復(fù)合物。多功能酶或串聯(lián)酶 多種不同催化功能存在于一條多肽鏈中，這類酶稱為多功能酶。 結(jié)合酶 ：由蛋白質(zhì)部分和非蛋白質(zhì)部分組成。 單純酶 ：僅由氨基酸構(gòu)成的酶。三、 酶的分子組成蛋白質(zhì)部分：酶蛋白（apoenzyme)非蛋白質(zhì)部分：輔助因子(cofactor)全 酶holoenzyme全酶的結(jié)構(gòu)與分子組成（無催化活性）（無催化活性）（有催化活性）酶蛋白 輔助因子 全 酶 對于結(jié)合酶來說，單獨(dú)酶蛋白或輔助因子沒有催化活性，只有全酶才有催化作用

11、。 結(jié)合酶各部分在催化反應(yīng)中的作用酶蛋白決定反應(yīng)的特異性輔助因子決定反應(yīng)的種類與性質(zhì)例： 脫氫酶(NADH ) 蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶. 一種酶蛋白一般只與一種輔助因子結(jié)合 同種輔助因子可與不同的酶蛋白結(jié)合1. 金屬離子：最多見的輔助因子，常見的金屬離子為 K+、Na+、Mg2+、Cu2+、 Cu+、 Zn2+、Fe2+、Fe3+等。輔助因子分類1（按其化學(xué)本質(zhì)） 金屬離子對酶的作用穩(wěn)定酶的構(gòu)象； 參與催化反應(yīng)，傳遞電子；在酶與底物間起橋梁作用；中和陰離子，降低反應(yīng)中的靜電斥力等。金屬酶金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。 金屬激活酶 金屬離子為酶的活性所必需，但與酶的結(jié)合不甚緊密

12、。一些金屬酶和金屬激活酶類 金屬酶 金屬離子 金屬激活酶 金屬離子 碳酸酐酶 Zn2+ 檸檬酸合成酶 K+ 羧基肽酶 Zn2+ 丙酮酸激酶 K+ Mg2+ 過氧化物酶 Fe2+ 丙酮酸羧化酶 Mn2+ Zn2+過氧化氫酶 Fe2+ 精氨酸酶 Mn2+ 己糖激酶 Mg2+ 磷酸水解酶類 Mg2+磷酸轉(zhuǎn)移酶 Mg2+ 蛋白激酶 Mg2+，Mn2+ 錳超氧化物歧化酶 Mn2+ 磷脂酶C Ca2+谷胱甘肽過氧化物酶 Se 磷脂酶A2 Ca2+ 小分子有機(jī)化合物對酶的作用在反應(yīng)中起運(yùn)載體的作用，傳遞電子、質(zhì)子或其它基團(tuán)。2. 小分子有機(jī)化合物：種類不多，常含有維生素或維生素類物質(zhì)，尤其是B族維生素。名稱

13、 縮寫名轉(zhuǎn)移基團(tuán) 所含維生素輔酶/輔酶 NAD+/NADP+H+、電子 尼克酰胺（PP,B3）黃素腺嘌呤二核苷酸 FAD氫原子 B2焦磷酸硫胺素 TPP醛基 B1磷酸吡哆醛氨基 B6輔酶A CoASH酰基 泛酸（B5）生物素CO2 生物素（B7, H）四氫葉酸 FH4 一碳單位 葉酸（B9）輔酶B12 氫原子、烷基 B12小分子有機(jī)化合物在催化中的作用 輔助因子分類2（按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度） 輔酶 (coenzyme):與酶蛋白結(jié)合疏松(不形成共價鍵)，可用透析或超濾的方法除去。 輔基 (prosthetic group):與酶蛋白結(jié)合緊密(形成共價鍵) ，不能用透析或超濾的方法除去。*

14、 定義同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。四、 同工酶特點(diǎn)： 1、都是寡聚酶 2、不同的亞基組成 3、不同亞基的活性中心非常相似 4、組織分布部位不同 5、所催化的反應(yīng)有側(cè)重點(diǎn)* 舉例：乳酸脫氫酶(LDH1 LDH5)乳酸+NAD+ 丙酮酸+NADH+H+ LDH人體各組織器官中LDH同工酶的分布 組織器官 LDH1 LDH2 LDH3 LDH4 LDH5 （ 占總 LDH活性的百分比） 心 67 29 4 1 1 腎 52 28 16 4 1 肝 2 4 11 27 56 骨骼肌 4 7 21 27 41 紅細(xì)胞 42

15、36 15 5 2舉例 : 肌酸激酶 (CK1 CK3)BBBMMM CK1(BB) CK2(MB) CK3(MM)腦 心肌 骨骼肌肌酸+ATP 磷酸肌酸+ADP CK同工酶存在于同一種屬或同一個體的不同組織或同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中，它使不同的組織、器官和不同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有不同的代謝特征。這為同工酶用來診斷不同器官的疾病提供了理論依據(jù)。 臨床意義心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶譜的變化1酶活性心肌梗死酶譜正常酶譜肝病酶譜2345同工酶的生理意義1. 是體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)的一種方式2. 同工酶譜的改變有助于疾病的診斷小 結(jié)概念： 同工酶 全酶 寡聚酶 多功能酶小分子酶輔助因子（B族維生素為主）

16、酶的國際系統(tǒng)分類：六大類第二節(jié) 酶的作用機(jī)制 The Mechanism of Enzyme Action酶與一般催化劑的共同點(diǎn)在反應(yīng)前后沒有質(zhì)和量的變化；只能催化熱力學(xué)允許的化學(xué)反應(yīng)；只能加速可逆反應(yīng)的進(jìn)程，而不改變反應(yīng)的平衡點(diǎn)。（一）酶促反應(yīng)具有極高的效率 酶的催化效率通常比非催化反應(yīng)高1081020倍，比一般催化劑高1071013倍。一、 酶促反應(yīng)的特點(diǎn)底物 催化劑 反應(yīng)溫度 反應(yīng)速度常數(shù)尿素 H + 62 7.4 10-7 脲酶 21 5.0 106過氧化氫 Fe 2+ 22 6.0 10-4 過氧化氫酶 22 5.0 106酶的催化效率可用酶的轉(zhuǎn)換數(shù) (turnover number

17、) 來表示。酶的轉(zhuǎn)換數(shù)是指在酶被底物飽和的條件下，每個酶分子每秒鐘將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的分子數(shù)。反應(yīng)總能量改變 非催化反應(yīng)活化能 酶促反應(yīng) 活化能 一般催化劑催化反應(yīng)的活化能 能量 反 應(yīng) 過 程 底物 產(chǎn)物 酶能大幅降低活化能（ activation energy) 活化態(tài)活化態(tài)活化態(tài)一種酶只能作用于一種或一類化合物，或一定的化學(xué)鍵，催化一定的化學(xué)反應(yīng)并生成一定的產(chǎn)物。酶的這種特性稱為酶的特異性或?qū)Ｒ恍浴? 酶的特異性(specificity)（二）酶促反應(yīng)具有高度的特異性根據(jù)酶對其底物結(jié)構(gòu)選擇的嚴(yán)格程度不同，酶的特異性可大致分為以下3種類型：絕對特異性(absolute specificity

18、) 相對特異性(relative specificity)立體結(jié)構(gòu)特異性(stereo specificity)絕對特異性酶只作用于一種底物，進(jìn)行一種專一的反應(yīng)，生成一種特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。相對特異性酶只作用于一類化合物或一種化學(xué)鍵。立體結(jié)構(gòu)特異性酶僅作用于立體異構(gòu)體中的一種。例： L-乳酸脫氫酶，作用于L-乳酸（三）酶促反應(yīng)的可調(diào)節(jié)性對酶生成與降解量的調(diào)節(jié)酶催化效力的調(diào)節(jié)（活性的調(diào)節(jié)）酶促反應(yīng)受多種因素的調(diào)控，以適應(yīng)機(jī)體對不斷變化的內(nèi)外環(huán)境和生命活動的需要。某些理化因素作用下，酶會變性而失活（四）酶具有不穩(wěn)定性酶分子中能與底物特異結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的部位稱為酶的活性中心或稱活性部位(acti

19、ve site) 。二、酶的活性中心酶的活性中心必需基團(tuán)(essential group)酶分子氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)中，一些與酶活性密切相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)?；钚灾行某Ｒ姳匦杌鶊F(tuán)：Ser殘基的羥基Cys殘基的巰基His殘基的咪唑基Glu殘基的-羧基一些酶活性中心的必需基團(tuán) 名 稱 活性中心的必需基團(tuán)胰蛋白酶 His42 Ser180 Asp87彈性蛋白酶 His57 Asp102 Ser195 Asp194 Ile16 羧基肽酶 Arg145 Tyr248 Glu270 溶菌酶 Glu35 Asp52乳酸脫氫酶 Asp30 Asp53 Lys58 Tyr85 Arg101 Glu140 Arg1

20、71 His195 Lys250胰糜蛋白酶 His57 Asp102 Asp194 Ser195 Ile16溶菌酶的活性中心 組成酶活性中心的必需基團(tuán)在一級結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，但在形成三級結(jié)構(gòu)時相互接近，形成具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域。63活性中心內(nèi)的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)(binding group)與底物相結(jié)合催化基團(tuán)(catalytic group)催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物 位于活性中心以外，維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。活性中心以外的必需基團(tuán)底 物 活性中心以外的必需基團(tuán)結(jié)合基團(tuán)催化基團(tuán) 活性中心 活性中心的構(gòu)象特點(diǎn)：在酶分子整個體積中只占比較小的一部分，是一個三維實(shí)體，或?yàn)榱芽p，或?yàn)榘枷?。多為氨?/p>

21、酸殘基的疏水基團(tuán)組成的疏水環(huán)境，形成疏水“口袋”。 酶活性中心的特點(diǎn)1、幾個殘基+輔助因子（單純/結(jié)合）2、在空間構(gòu)象上集中到一起（單體/寡聚）3、疏水空穴5、通過次級鍵與底物結(jié)合7、活性中心構(gòu)象具有柔韌性和可塑性6、與底物誘導(dǎo)契合4、在酶分子整個體積中只占比較小的一部分，是一個三維實(shí)體，或?yàn)榱芽p，或?yàn)榘枷?。溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心是一裂隙，可以容納肽多糖的6個單糖基（A，B，C，D，E，F(xiàn)），并與之形成氫鍵和van derwaals力。三、酶的作用機(jī)制酶-底物復(fù)合物的形成和誘導(dǎo)契合學(xué)說鄰近效應(yīng)與定向排列表面效應(yīng)多元催化E + S k1k2k3 ESE + PES:酶-底物復(fù)合物過渡態(tài)

22、中間復(fù)合物（一）酶與底物結(jié)合有利于底物形成過渡態(tài)鎖-匙學(xué)說Lock and key model 1890 by Emil FischerInduced fit model 1958 by Daniel Koshland 誘導(dǎo)契合作用酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合*誘導(dǎo)契合假說(induced-fit hypothesis)酶分子構(gòu)象與作用物結(jié)構(gòu)并不一定完全吻合，而是當(dāng)兩者在相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。這一過程稱為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說。酶高度特異性機(jī)制（二）鄰近效應(yīng)與定向排列鄰近效應(yīng)（proximity effect）：

23、是指酶與底物在一個有限的區(qū)域內(nèi)互相接近結(jié)合，使底物在此特定區(qū)域的局部濃度得以極大的升高，從而大大增加底物互相碰撞的機(jī)會，使反應(yīng)速率顯著提高的一種效應(yīng)。 定向排列（orientation arrange）：是指底物的反應(yīng)基團(tuán)之間，以及酶的催化基團(tuán)與底物的反應(yīng)基團(tuán)之間的正確取位產(chǎn)生的效應(yīng)。（三）表面效應(yīng)酶的活性中心多位于其分子內(nèi)部的疏水“口袋”中，反應(yīng)在酶分子內(nèi)部的疏水環(huán)境中進(jìn)行。疏水環(huán)境可使底物分子脫溶劑化（desolvation），排除周圍大量水分子對酶和底物分子中功能基團(tuán)的干擾性吸引或排斥，防止二者之間形成水化膜，利于底物和酶分子之間的直接密切接觸和相互結(jié)合。 （四）多元催化1.酸堿催化2.

24、共價催化3.親核催化4.金屬離子催化酸堿催化第三節(jié)酶促反應(yīng)動力學(xué)Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction 影響因素包括有：酶促反應(yīng)動力學(xué)研究各種因素對酶促反應(yīng)速度的影響底物濃度酶濃度pH溫度抑制劑激活劑酶促反應(yīng)速度的測定：用單位時間內(nèi)底物(substrate)減少或產(chǎn)物增加的量來表示。反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以內(nèi)）時的反應(yīng)速度。 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。VmaxVSKmVmax/2 矩形雙曲線關(guān)系一、底物濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時反應(yīng)速度與底物濃度成正比VS Vmax隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速V

25、S Vmax當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度VS Vmax1913年Michaelis和Menten推導(dǎo)出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米曼氏方程式，簡稱米氏方程式。（一）米曼氏方程式S：底物濃度V：不同S時的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximum velocity) m：米氏常數(shù)(Michaelis constant) VmaxS Km + S K1 ES生成的反應(yīng)速度常數(shù)K2 ES分解為E+S的反應(yīng)速度常數(shù)K3 ES分解為E+ P的反應(yīng)速度常數(shù)E + S k1k2k3 ESE + P酶促反應(yīng)模式中間產(chǎn)物學(xué)說反應(yīng)是單底物反應(yīng)E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平

26、衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速率取決于慢反應(yīng)即 V = k3ES。S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度可認(rèn)為不變。反應(yīng)初始，產(chǎn)物P的量很少，E+P生成ES的反應(yīng)可忽略米曼氏方程式推導(dǎo)基于幾個假設(shè)：E + S k1k2k3 ESE + P米曼氏方程式推導(dǎo)過程：ES的生成速率 = ES的分解速率(1)=(EtES)Sk2+k3ES k1整理得：k1 (EtES) S = k2 ES + k3 ES當(dāng)反應(yīng)處于穩(wěn)態(tài)時：k1 游離酶 S = k2 ES + k3 ESk2+k3= Km （米氏常數(shù)） k1令：則(1)變?yōu)? (EtES) S = Km ESk2+

27、k3= Km （米氏常數(shù)） k1令：k2+k3= Km （米氏常數(shù)） k1令：當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時，即Et =ES，反應(yīng)達(dá)最大速率Vmax = k3ES = k3Et (4)ES = EtSKm + S(2) 整理得:將(4)代入(3)得米氏方程式：Vmax S Km + S V = V = k3ES得k3EtS Km + S (3) V = 當(dāng)S Km時，V Vmax，反應(yīng)速度達(dá)最大速度， S再增高也不影響反應(yīng)速度。VmaxVSVmaxS Km + S Km值的意義 Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時的底物濃度，單位是mol/L 。 當(dāng)反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時V

28、maxVSKmVmax/2 2Km + S Vmax VmaxSKmS（二）Km與Vmax的意義 Km值是酶的特征性常數(shù)之一 a) 只與酶的性質(zhì)、反應(yīng)環(huán)境有關(guān)，與其濃度無關(guān) b) 不同的酶，其Km值不同，測定Km可以 作為鑒別酶的一種手段 c) Km值：10-610-2mol/L Km可反應(yīng)酶對底物的親和力Km= k2 + k3 k1Kmk2（解離能力）/k1（親和能力）E + S ES P + Ek1k2k3Km越小，親和力越強(qiáng)。底物濃度很小時，反應(yīng)速度就能達(dá)到很大，性能優(yōu)，代謝中這類酶更為重要。當(dāng)k2k3時 一種酶有幾種不同的Km值時， Km值最小的底物是天然底物或是最適底物。某些酶的Km

29、值 酶名稱 底物 Km（mmol/L） 過氧化氫酶 H2O2 25碳酸酐酶H2CO3 9胰糜蛋白酶甘氨酰酪氨酰甘氨酸108半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0己糖激酶 D-果糖1.5 D-葡萄糖 0.015 Km可用于判定酶催化的優(yōu)勢方向及代謝過程的限速步驟 催化可逆反應(yīng)的酶對正反應(yīng)和逆反應(yīng)兩向底物的Km值不同，Km較小者為酶催化的優(yōu)勢方向 代謝途徑連鎖反應(yīng)中各酶的Km值不同，Km較大者為限速酶Vmax的意義定義：Vmax是酶完全被底物飽和時的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。 Vmax =k3 E意義： 如果酶的總濃度已知，可從Vmax計(jì)算酶的轉(zhuǎn)換數(shù)(turnover number) ，即動力學(xué)常數(shù)k3。意

30、義 可用來比較每單位酶的催化能力。 酶的轉(zhuǎn)換數(shù)定義 當(dāng)酶被底物充分飽和時，單位時間內(nèi)每個酶分子催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。 酶底 物轉(zhuǎn)換數(shù) （s1）過氧化氫酶H2O240 000 000碳酸酐酶HCO3400 000乙酰膽堿酯酶乙酰膽堿14 000-內(nèi)酰胺酶芐青霉素2 000延胡索酸酶延胡索酸800Rec A蛋白ATP0.4一些酶的轉(zhuǎn)換數(shù) Km值與米氏方程的應(yīng)用 計(jì)算底物濃度和相對速度可由所要求的反應(yīng)速度(應(yīng)到達(dá)Vmax的百分?jǐn)?shù))，求出應(yīng)當(dāng)加入底物的合理濃度。反過來，也可以根據(jù)已知的底物濃度，求出該條件下的反應(yīng)速度。0.04mol/L0.05mol/L0.1mol/L0.2mol/L0.8mo

31、l/L已知某酶Km值為0.05mol/L，欲使其所催化的反應(yīng)速率達(dá)最大反應(yīng)速率的80%時，底物濃度應(yīng)是多少？ 1.林-貝氏方程及雙倒數(shù)作圖法(double reciprocal plot) VmaxS Km+SV = （林貝氏方程） + 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S 兩邊同取倒數(shù) 1VmaxKmVmax斜率1Km01 V1 S（三）m值與max值的測定-1/Km1/Vmax Km /Vmax2. Hanes-Woolf方程及其作圖法S S/V -Km 1/Vmax (斜率） 在林貝氏方程基礎(chǔ)上，兩邊同乘S+ 1/V=KmVmax 1/Vmax 1/S S/V =Km/Vmax +

32、 S/Vmax 兩邊同乘S3. Eadie-Hofstee作圖法當(dāng)SE，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：Vmax = K3 E0 V E 酶濃度對反應(yīng)速度的影響 二、酶濃度對反應(yīng)速度的影響雙重影響最適溫度 (optimum temperature)：酶促反應(yīng)速度最快時的環(huán)境溫度。低溫的應(yīng)用: 臨床低溫麻醉 低溫保存菌種酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 溫度 C 溫度對淀粉酶活性的影響 三、溫度對反應(yīng)速度的影響最適pH (optimum pH)：酶催化活性最大時的環(huán)境pH。 6 10pH最適pH酶活性 pH與酶活性的關(guān)系四、 pH對反

33、應(yīng)速度的影響0酶活性 pH pH對某些酶活性的影響 胃蛋白酶 淀粉酶 膽堿酯酶 246810人體部分酶的最適 pH 值 酶 最適 pH胃蛋白酶 1.8過氧化氫酶 7.6胰蛋白酶 7.7延胡索酸酶 7.8核糖核酸酶 7.8精氨酸酶 9.8酶的抑制劑(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降或喪失而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑。 區(qū)別于酶的變性 抑制劑對酶有一定選擇性 變性劑對酶沒有選擇性五、抑制劑對反應(yīng)速度的影響 抑制作用的類型不可逆性抑制 (irreversible inhibition):抑制劑通常以共價鍵與酶活性中心的必需基團(tuán)相結(jié)合，使酶失活；抑制劑不能用透析、超濾等方法除去。可

34、逆性抑制 (reversible inhibition)：抑制劑通常以非共價鍵與酶或酶-底物復(fù)合物可逆性結(jié)合，使酶的活性降低或喪失；抑制劑可用透析、超濾等方法除去。非專一性不可逆抑制劑（重金屬離子及砷化合物） 此類抑制劑可與酶分子中的一類或幾類基團(tuán)反應(yīng)，不局限于必需基團(tuán)專一性不可逆抑制劑（有機(jī)磷化合物） 能專一地與活性中心的必需基團(tuán)結(jié)合(一) 不可逆性抑制作用有機(jī)磷化合物對羥基酶的抑制DFP(二異丙基氟磷酸）、沙林、有機(jī)磷農(nóng)藥（1605、1059、敵敵畏、敵百蟲）專一性不可逆抑制劑舉例1：有機(jī)磷中毒 機(jī)理：抑制乙酰膽堿酯酶 乙酰膽堿蓄積 膽堿能神經(jīng)受到持續(xù)沖動，導(dǎo)致先興奮后衰竭的一系列癥狀。臨

35、床表現(xiàn)：毒蕈堿樣（副交感神經(jīng)末梢興奮 ）：平滑肌痙攣和腺體分泌增加 煙堿樣（橫紋?。好?、眼瞼、舌、四肢和全身）中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀嚴(yán)重患者可因昏迷和呼吸衰竭而死亡 診斷：中毒史、中毒表現(xiàn)、全血膽堿酯酶測定 、有機(jī)磷測定 、阿托品試驗(yàn) 抑制乙酰膽堿酯酶（羥基酶）乙酰膽堿蓄積 膽堿能神經(jīng)受到持續(xù)沖動，導(dǎo)致先興奮后衰竭的一系列癥狀: 心跳變慢、瞳孔縮小、流口水、多汗和呼吸困難，進(jìn)而影響神經(jīng)傳導(dǎo)，失去知覺而死亡。有機(jī)磷中毒機(jī)理 如何緊急救治呢？排毒洗胃導(dǎo)泄、利尿血液灌流（“大換血”）血液透析（清除游離狀態(tài)毒物）解毒藥：膽堿酯酶復(fù)活 抗膽堿藥：阿托品 （阻斷乙酰膽堿對副交感神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒蕈堿受體的作用

36、）有機(jī)磷中毒的解毒- 解磷定(PAM)重金屬離子（非專一性不可逆抑制劑） Ag+ 、 Cu2+ 、 Hg2+ 、 Pb2+ 、 Fe3+ 高濃度時可使酶蛋白變性失活； 低濃度時對酶活性產(chǎn)生抑制。 通過加入EDTA解除 舉例:2：路易士氣失活的酶巰基酶失活的酶酸BAL巰基酶BAL與砷劑結(jié)合物舉例3：據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)侵華戰(zhàn)爭時期的日本在中國共發(fā)動毒氣戰(zhàn)1312次，傷害了36968人（其中2086人死亡）包括毒氣DFP 、路易士氣、二苯氰砷、三氰化砷等等.（二） 可逆性抑制作用別構(gòu)抑制：不遵循米氏方程遵循米氏方程的可逆性抑制競爭性抑制 (competitive inhibition)非競爭性抑制 (no

37、n-competitive inhibition)反競爭性抑制 (uncompetitive inhibition)定義抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶-底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。. 競爭性抑制作用+EESIESEIE P+IEIE + SE + PES* 反應(yīng)模式從中間產(chǎn)物學(xué)說出發(fā),推出有競爭性抑制劑時的米-曼方程：Ki為EI的解離常數(shù)ki = EI/EI競爭性抑制劑存在時的米氏方程作圖 抑制劑 無抑制劑 1/V 1/S 競爭性抑制雙倒數(shù)曲線有競爭性抑制劑時，雙倒數(shù)作圖法 * 特點(diǎn)抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及底物濃度；I與S結(jié)構(gòu)類似，競爭酶的活性

38、中心；c) 動力學(xué)特點(diǎn)：Vmax不變，表觀Km增大* 舉例 丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶琥珀酸琥珀酸脫氫酶FADFADH2延胡索酸 一些藥物如抗菌素、抗腫瘤藥物等是通過競爭性抑制機(jī)理發(fā)揮作用的。競爭性抑制在醫(yī)學(xué)臨床中的應(yīng)用： 磺胺類藥物的抑菌機(jī)制與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶二氫蝶呤啶 對氨基苯甲酸 谷氨酸二氫葉酸合成酶 二氫葉酸磺胺類藥抗菌機(jī)理： 磺胺類藥物與對氨基苯甲酸化學(xué)結(jié)構(gòu)相似. 對氨基苯甲酸競爭與二氫葉酸合成酶的活 性中心結(jié)合. 抑制酶的活性，使FH4 合成受阻 ，導(dǎo)致 DNA不能合成，使細(xì)菌繁殖停止，起到抑 菌作用。人通過食物中的葉酸直接補(bǔ)充，對人無毒害。反應(yīng)模式+ S S+

39、S S+ESIEIEESEPE+SESE+P+IEI+S EIS +I2. 非競爭性抑制作用* 特點(diǎn)抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，底物與抑制劑之間無競爭關(guān)系；抑制程度取決于抑制劑的濃度；動力學(xué)特點(diǎn)：Vmax降低，表觀Km不變。 抑制劑 1 / V 1/S 無抑制劑 非競爭性抑制雙倒數(shù)曲線. 反競爭性抑制抑制劑僅與酶和底物形成的中間產(chǎn)物(ES)結(jié)合反應(yīng)模式E+SE+P ES+IESI+ESESESIEP* 特點(diǎn)：抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合；抑制程度取決與抑制劑的濃度及底物的濃度；動力學(xué)特點(diǎn)：Vmax降低，表觀Km降低。 抑制劑 1/V 1/S 無抑制劑 反競爭性抑制雙倒數(shù)曲線酶的抑制機(jī)制

40、競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制EE另一結(jié)合區(qū)競爭結(jié)合區(qū)抑制劑底物圖解抑制機(jī)理及說明I 只與自由的 E 結(jié)合，會與 S 競爭；S可克服 I 的抑制。I 可與自由的 E 或已占據(jù)有 S 的 ES 結(jié)合， S不能克服 I 的抑制。I 只能與 ES 結(jié)合， S反而有利 I 的抑制。E + S ES E + P + IEI E + S ES E + P + + I I EI + S EIS E + S ES E + P + I EIS XJuang RH (2004) BCbasicsKm酶的抑制機(jī)制（作圖）競爭性抑制非競爭性抑制 反競爭性抑制直接作圖雙倒數(shù)作圖VmaxVmaxKmKmS, mMvS

41、, mMvIIKmS, mMVmaxIKmVmaxVmaxVmax 不變；Km 變大Vmax 變小；Km 不變Vmax 及 Km 均變小I1/S1/Km1/v1/ VmaxI兩條平行線I交于X軸1/v1/ Vmax1/S1/Km1/S1/Km1/ Vmax1/v交于 Y 軸= KmJuang RH (2004) BCbasics各種可逆性抑制作用的比較 作用特征競爭性抑制非競爭性抑制反競爭性抑制與I結(jié)合的組分EE、ESES表觀Km增大不變減小Vmax不變降低降低 抑制劑 1/V 1/S 無抑制劑 1 / V 1/S 無抑制劑 抑制劑 無抑制劑 1/V 1/S 非競爭性抑制抑制劑1/V 1/S

42、無抑制劑 反競爭性抑制競爭性抑制非競爭性抑制劑存在時，酶促反應(yīng)動力學(xué)的特點(diǎn)是：Km值增大，Vmax不變Km值降低，Vmax不變Km值不變，Vmax增大Km值不變，Vmax降低Km值和Vmax均降低激活劑(activator) 使酶由無活性變?yōu)橛谢钚曰蚴姑富钚栽黾拥奈镔|(zhì) 必需激活劑 (essential activator) Mg2+ 對于已糖激酶 非必需激活劑 (non-essential activator) Cl- 對于唾液淀粉酶六、激活劑對反應(yīng)速度的影響第三節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué)底物濃度酶濃度溫度pH抑制劑激活劑VmaxVSKmVmax/2 0 V E 6 10pH最適pH酶活性 pH與酶活

43、性的關(guān)系酶活性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 溫度與酶活性的關(guān)系第 四 節(jié) 酶活性的測定及調(diào)節(jié) Measurement and Regulation of Enzyme Activity酶的活性： 也稱酶活力， 是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力 酶活力用酶的活性單位來表示。酶的活性單位： 在規(guī)定條件下，酶促反應(yīng)在單位時間內(nèi)生成一定量產(chǎn)物或消耗一定量底物所需要的酶量。一、酶的活性、比活性及測定在特定的條件下，每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為一個國際單位。 催量(kat)是指在特定條件下，每秒鐘使mol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。 kat與IU的換算： 1 IU=

44、16.6710-9 kat國際單位(IU)催量單位(katal)酶活性單位酶的比活性：每毫克酶蛋白所含的酶活力單位 用來衡量酶的純度。酶活性測定的最適條件：足量底物:20100Km最適pH最適溫度合適的緩沖溶液必要的輔因子或輔酶、激活劑避免抑制劑污染直接測定法間接測定法酶偶聯(lián)測定法 常用指示酶有脫氫酶、過氧化物酶、熒光素酶酶活性測定方法 調(diào)節(jié)對象：關(guān)鍵酶代謝途徑實(shí)質(zhì)上是一系列酶催化的化學(xué)反應(yīng)，其速度和方向不是由這條途徑中每一個酶而是其中一個或幾個具有調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵酶的活性所決定能影響和調(diào)節(jié)反應(yīng)途徑反應(yīng)速率的酶稱為關(guān)鍵酶(key enzymes)。二、酶的調(diào)節(jié) 關(guān)鍵酶的特點(diǎn)一般位于代謝途徑的起始

45、或分支處催化單向不可逆反應(yīng)活性較低可受多種因素調(diào)節(jié)酶活性的調(diào)節(jié)（快速調(diào)節(jié)）酶含量的調(diào)節(jié)（緩慢調(diào)節(jié)） 調(diào)節(jié)方式1. 酶原與酶原的激活酶原 (zymogen，proenzyme)有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，此前體物質(zhì)稱為酶原。 酶原的激活在一定條件下，酶原向有活性的酶轉(zhuǎn)化的過程。（一 ）酶活性的調(diào)節(jié)賴?yán)i天天天天甘異賴?yán)i天天天天纈組絲SSSS46183甘異纈組絲SSSS腸激酶胰蛋白酶活性中心胰蛋白酶原的激活過程胰蛋白酶的結(jié)構(gòu)2013.092013.09 酶原激活的機(jī)理酶 原分子構(gòu)象發(fā)生改變形成或暴露出酶的活性中心 一個或幾個特定的肽鍵斷裂，水解掉一個或幾個短肽在特定條件下某些酶原

46、的激活過程酶原激活條件活化的酶水解掉的肽段胃蛋白酶原H+或胃蛋白酶胃蛋白酶44aa胰蛋白酶原腸激酶或胰蛋白酶胰蛋白酶六肽糜蛋白酶原A胰蛋白酶或糜蛋白酶-糜蛋白酶兩個二肽羧基肽酶原A胰蛋白酶羧基肽酶A幾個碎片彈性蛋白酶原胰蛋白酶彈性蛋白酶幾個碎片 酶原激活的生理意義避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。急性胰腺炎有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。2. 變構(gòu)調(diào)節(jié)(allosteric regulation)變構(gòu)效應(yīng)劑 (allosteric effector)變構(gòu)激活劑變構(gòu)抑制劑 變構(gòu)酶 (a

47、llosteric enzyme) 變構(gòu)部位 (allosteric site)一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部位可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱變構(gòu)調(diào)節(jié)。變構(gòu)酶的特點(diǎn)變構(gòu)酶常為多個亞基構(gòu)成的寡聚體； 含有催化亞基和調(diào)節(jié)亞基（或催化部位和調(diào)節(jié)部位）； 具有協(xié)同效應(yīng) ，S-v關(guān)系曲線為S形或表觀雙曲線。 調(diào)節(jié)亞基催化亞基變構(gòu)酶結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：多亞基構(gòu)成催化亞基有活性中心調(diào)節(jié)亞基有變構(gòu)部位天冬氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶 變構(gòu)調(diào)節(jié)類型同促協(xié)同效應(yīng): 效應(yīng)劑是底物本身同促正協(xié)同效應(yīng)： “S”型曲線 （多見）正協(xié)同效應(yīng)多數(shù)屬于同促正協(xié)同效應(yīng)。同促負(fù)協(xié)同效應(yīng)： 表觀雙曲線動力學(xué)特性

48、（少見）異促協(xié)同效應(yīng)：效應(yīng)劑非底物異促正協(xié)同效應(yīng)：效應(yīng)劑稱變構(gòu)激活劑異促負(fù)協(xié)同效應(yīng)：效應(yīng)劑稱變構(gòu)抑制劑不論是同促協(xié)同（底物本身）或異促協(xié)同（效應(yīng)劑）效應(yīng)，底物或效應(yīng)劑的影響主要出現(xiàn)在曲線中段。別構(gòu)激活劑別構(gòu)抑制劑變構(gòu)酶存在協(xié)同效應(yīng)變構(gòu)調(diào)節(jié)舉例蛋白激酶A的激活變構(gòu)效應(yīng)劑 + 酶的調(diào)節(jié)亞基酶的構(gòu)象改變酶的活性改變（激活或抑制 ）疏松亞基聚合緊密亞基解聚酶分子多聚化變構(gòu)調(diào)節(jié)原理共價修飾(covalent modification)在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽鏈上的一些基團(tuán)可與某種化學(xué)基團(tuán)發(fā)生可逆的共價結(jié)合，從而改變酶的活性，此過程稱為共價修飾。 常見類型磷酸化與脫磷酸化（最常見）乙?；兔撘阴?/p>

49、化甲基化和脫甲基化腺苷化和脫腺苷化SH與SS互變3. 酶的共價修飾調(diào)節(jié) 酶的磷酸化與脫磷酸化 -OHThrSerTyr酶蛋白H2OPi磷蛋白磷酸酶 ATPADP蛋白激酶ThrSerTyr-O-PO32-酶蛋白酶促共價修飾對酶活性的調(diào)節(jié) 酶共價修飾類型酶活性改變糖原磷酸化酶磷酸化酶b激酶糖原合成酶丙酮酸脫羧酶磷酸果糖激酶丙酮酸脫氫酶HMG-CoA還原酶HMG-CoA還原酶激酶乙酰CoA羧化酶脂肪細(xì)胞甘油三脂脂肪酶磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化磷酸化/脫磷酸化激活/抑制激活/抑制抑制/激活抑制/激活抑制/激活抑制/激活抑制/激活激活/抑制抑制/激活激活/抑制共價修飾調(diào)節(jié)的特點(diǎn)受共價修飾的酶存在有（高）活性和無（低）活性兩種形式；受激素的調(diào)節(jié)；具有瀑布效應(yīng)（級聯(lián)效應(yīng)） 。瀑布效應(yīng)（級聯(lián)放大效應(yīng)）1. 酶蛋白合成的誘導(dǎo)和阻遏 誘導(dǎo)