菟箭合劑含藥血清對(duì)高糖條件培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞磷酸化Akt和PTE

1、菟箭合劑含藥血清對(duì)高糖條件培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞磷酸化Akt和PTE摘要】目的觀察中藥菟箭合劑含藥血清對(duì)高糖條件培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞()磷酸化akt和pten的作用。方法將大鼠腎小球系膜細(xì)胞分為正常對(duì)照組、高糖條件培養(yǎng)組和高糖條件培養(yǎng)+4個(gè)不同濃度菟箭合劑含藥血清組,不同條件培養(yǎng)液培養(yǎng)72h后用雙夾心elisa法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)磷酸化akt(thr308)和磷酸化pten(ser380)含量。結(jié)果高糖組磷酸化akt(thr308)程度顯著高于正常對(duì)照組(p0.01),菟箭合劑含藥血清干預(yù)的磷酸化akt程度顯著低于高糖組(p0.01),且有明顯的量效關(guān)系。高糖組磷酸化pten(ser380)程度顯著低于正

2、常組(p0.01),各種濃度菟箭合劑含藥血清組pten程度均高于高糖組,且呈現(xiàn)量效關(guān)系。結(jié)論中藥菟箭合劑具有進(jìn)步高糖培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)pten程度,抑制akt激活的作用?！娟P(guān)鍵詞】菟箭合劑;腎小球系膜細(xì)胞;糖尿病腎病;磷脂酰肌醇3-激酶-akt信號(hào)通路;ptenserpharalgialeffetftujianixturenphsph-aktandptenfglerularesangialellulturedinhighnentratinsfgluseyinde-hai1,liangxia-hun1,zhanghng2,etal(1.pekinguninedialllegehspital,beiji

3、ng100730,hina;2.institutefbasiedialsiene,hineseaadeyfedialsienes,beijing100730,hina)abstrat：bjetivetbservetheeffetsfseruntainingtheediineftujianixturenphsph-aktandphsph-ptenfglerularesangialell()ulturedinhighnentratinsfgluse.ethdtheglerularesangialellsfrsdrateredividedintsixgrups：thenralntrlgrup,the

4、grupfulturedinhighnentratinsfgluse,andfurthergrupsulturedinhighnentratinsfgluse+differentnentratinsfratsseruntainingtujianixture.after72hurs,thententlevelfphsph-akt(thr308)andphsph-pten(ser380)inasdetetedbyusingsandihelisa.resultsthelevelfphsph-akt(thr308)inthegrupfulturedinhighnentratinsfgluseassig

5、nifianthigherthanthatinthenralntrlgrup(p0.01).thelevelfphsph-akt(thr308)inthegrupsithseruntainingtujianixtureassignifiantlerthanthatinthegrupfulturedinhighnentratinsfgluse(p0.01).theeffetsindiatedarearkablehangeithdifferentdsageftujianixture.furtherre,thelevelfphsphatedpten(ser380)inthegrupfulturedi

6、nhighnentratinsfgluseassignifiantlerthanthatinthenralntrlgrup(p0.01).thelevelfphsphatedpteninthegrupsithseruntainingtujianixtureassignifianthigherthanthatinthegrupfulturedinhighnentratinsfgluse(p0.01).theeffetsalsindiatedarelatinshipiththedsageftujianixture.nlusinhineseherbalediinetujianixtureaninre

7、asethelevelfphsphatedptenandinhibitativatinfaktinulturedinhighnentratinsfgluse.keyrds：tujianixture;glerularesangialell;diabetinephrpathy;pi3k-aktsignalingpathyay;pten糖尿病腎病最為關(guān)鍵的病理改變是腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(e)的逐漸堆積,最終導(dǎo)致腎小球的硬化。腎小球系膜細(xì)胞()發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,由靜止表型轉(zhuǎn)化為增殖/分泌表型,細(xì)胞肥大,大量分泌e,同時(shí)基質(zhì)蛋白的降解減少是造成腎小球e堆積的原因。我們既往的研究發(fā)現(xiàn),中藥菟箭合劑可以減少糖尿病大

8、鼠的表型轉(zhuǎn)化,減輕腎小球系膜區(qū)e的堆積,顯著降低糖尿病大鼠尿蛋白的排泄量1。有研究發(fā)現(xiàn),磷脂酰肌醇3-激酶(pi3k)-akt信號(hào)通路異常激活是糖尿病腎病細(xì)胞肥大、e異常分泌重要機(jī)制2,本研究觀察了菟箭合劑含藥血清對(duì)高糖條件培養(yǎng)的磷酸化akt和pi3k/akt的抑制物類(lèi)脂磷酸酶pten影響。1材料與方法1.1菟箭合劑含藥血清的制備正常sd大鼠,體重250280g,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部,答應(yīng)證號(hào)：skxk(京)2022-0008。適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后按每100g體重2l的劑量灌胃菟箭合劑口服液(菟絲子、鬼箭羽和漢防己,三藥比例為131,中藥飲片購(gòu)自北京同仁堂藥店,水煎制成口服液,每1l含

9、原藥材1g),每日灌胃2次,連續(xù)3d,末次灌胃后2h進(jìn)展麻醉(12%烏拉坦,每100g體重1l腹膜內(nèi)注射),頸動(dòng)脈插管取血,3000r/in離心10in取血清,5l分裝,-20保存待用。正常sd大鼠血清的制備除按每100g體重灌胃自來(lái)水2l外,其余同含藥血清的制備。1.2大鼠系膜細(xì)胞的培養(yǎng)及分組sd大鼠(體重100120g)按經(jīng)典方法培養(yǎng)、鑒定大鼠腎小球3。取第4代細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。從培養(yǎng)瓶中消化,制成1106/l濃度的細(xì)胞懸液,接種于10直徑的培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿接種5l細(xì)胞懸液,加完全rpi1640培養(yǎng)液(含20%胎牛血清,l-谷氨酰胺2l/l,青霉素100u/l,鏈霉素100u/l,丙酮酸

10、鈉2l/l,胰島素0.6u/l,hepes12.5l/l)至15l/皿,置培養(yǎng)箱中(37、5%2)孵育,24h細(xì)胞貼壁良好后換不含胎牛血清的培養(yǎng)液靜置24h。將培養(yǎng)液中胎牛血清換為不同條件大鼠血清,分為6組：正常對(duì)照組(5l/l葡萄糖,20%正常大鼠血清),高糖組(30l/l葡萄糖,20%正常大鼠血清),高糖+1倍含藥血清組(30l/l葡萄糖,20%含藥大鼠血清),高糖+4倍稀釋含藥血清組(30l/l葡萄糖,20%用4倍正常大鼠血清稀釋的含藥大鼠血清),高糖+8倍稀釋含藥血清組(30l/l葡萄糖,20%用8倍正常大鼠血清稀釋的含藥大鼠血清),高糖+16倍稀釋含藥血清組(30l/l葡萄糖,20%

11、用16倍正常大鼠血清稀釋的含藥大鼠血清)。1.3系膜細(xì)胞磷酸化akt和pten的檢測(cè)使用ellsignaling公司的磷酸化akt(thr308)和磷酸化pten(ser380)雙夾心elisa試劑盒檢測(cè)。按其操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)展：參加不同處理因素培養(yǎng)液培養(yǎng)大鼠72h后,棄培養(yǎng)液,4下pbs沖洗細(xì)胞,每一培養(yǎng)皿(10直徑)加0.5l細(xì)胞溶解液,刮下細(xì)胞,移至試管中,4微量離心取上清液即是細(xì)胞溶解液,以一次使用的樣品量?jī)?chǔ)存于-80待用。檢測(cè)時(shí)用樣品稀釋液稀釋細(xì)胞溶解液至合適的倍數(shù),根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終樣品稀釋倍數(shù)磷酸化akt為1倍稀釋液稀釋、磷酸化pten為8倍稀釋液稀釋。加100l稀釋后的細(xì)胞溶液至相

12、應(yīng)的微孔中,按操作說(shuō)明書(shū)依次完成加一抗、hrp連接二抗、tb底物、終止液等操作步驟,最后用酶標(biāo)儀以450n波長(zhǎng)讀取樣品吸光值。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組間均數(shù)比擬采用方差分析。2結(jié)果(見(jiàn)表1)表1各組磷酸化akt和磷酸化pten的比擬注：與正常對(duì)照組比擬,p0.01;與高糖組比擬,*p0.05,*p0.013討論腎小球的肥大和e合成的增多等細(xì)胞表型和功能的改變是糖尿病腎病病理變化的根底4,導(dǎo)致表型和功能改變的機(jī)制目前并不完全清楚,可能是多種因素共同作用的結(jié)果。pi3k-akt信號(hào)通路在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中起關(guān)鍵作用,pi3k-akt通路由胰島素和多

13、種細(xì)胞因子受體激活,引發(fā)在pi3k作用下的第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(pip3)的堆積,進(jìn)而引發(fā)akt在308位蘇氨酸和407位絲氨酸的磷酸化,磷酸化akt進(jìn)而誘發(fā)一系列細(xì)胞下游事件,促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖與分化,阻斷細(xì)胞的凋亡。pten是細(xì)胞內(nèi)pi3k/akt信號(hào)通路的主要負(fù)調(diào)節(jié)物,通過(guò)催化pip3的3位磷酸基團(tuán)脫磷酸,使pip3形成pip2,降低了pip3程度,從而阻斷pi3k/akt信號(hào)通路。有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病大鼠腎小球內(nèi)pten表達(dá)顯著減少、akt活性升高,通過(guò)重組pten腺病毒轉(zhuǎn)染腎小球使其過(guò)度表達(dá)pten,可抑制高糖誘導(dǎo)的肥大2,提示糖尿病腎病時(shí)表型和功能的改變可能與pi3k-akt信

14、號(hào)通路的異常(pten表達(dá)的降低、akt的異常激活)有關(guān)。pi3k-akt信號(hào)通路的調(diào)控是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程,包括胰島素受體、受體酪氨酸激酶、整合素受體、多種細(xì)胞因子受體、g蛋白耦聯(lián)受體均與pi3k-akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。糖尿病腎病時(shí)存在多種以上受體激活的因素,因此可造成pi3k-akt異常激活,從而可能造成的肥大和e異常分泌等細(xì)胞表型和功能的改變。然而,糖尿病腎病時(shí)更為重要的pi3k-akt信號(hào)通路的異常改變使pten活性降低,pten活性的降低使pi3k-akt信號(hào)通路持續(xù)處于激活狀態(tài),可能是糖尿病腎病時(shí)肥大和大量分泌e的重要機(jī)制,進(jìn)步pten活性可能是治療糖尿病腎病的重要靶點(diǎn)。我們既

15、往的研究發(fā)現(xiàn),中藥菟箭合劑可以減少糖尿病大鼠的表型轉(zhuǎn)化,減輕腎小球系膜區(qū)e的堆積1。為了進(jìn)一步研究菟箭合劑的作用機(jī)制,我們觀察了菟箭合劑對(duì)高糖條件培養(yǎng)的磷酸化pten和akt的作用。結(jié)果說(shuō)明,高糖條件培養(yǎng)的磷酸化pten程度顯著降低,而磷酸化akt程度顯著升高,菟箭合劑含藥血清那么可顯著升高細(xì)胞內(nèi)磷酸化pten程度,同時(shí)顯著降低磷酸化akt程度。本實(shí)驗(yàn)中我們采用將所有組別大鼠培養(yǎng)液中的胎牛血清用大鼠血清交換的方法,藥物干預(yù)組與對(duì)照組之間的差異僅為是否為含藥血清和含藥血清稀釋濃度的差異,從而排除了由于血清種類(lèi)不同對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1尹德海,梁曉春,鄭法雷,等.糖尿病大鼠腎小球表型轉(zhuǎn)化及菟箭合劑的作用j.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2022,23(10)：772-776.2ahiainathanl,dasf,v