工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)(52)(1)ppt課件

1、第九節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) 在消費(fèi)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的某一等待代謝產(chǎn)物主才干的微生物菌種的保管和長(zhǎng)期保藏，對(duì)于一勝利的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件(1) 經(jīng)長(zhǎng)期保藏后菌種存活健在；(2)保證高產(chǎn)突變株不改動(dòng)表型和基因型，特別是不改動(dòng)初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物消費(fèi)的高產(chǎn)才干。(3)菌種保藏的根本措施是低溫、枯燥、真空。一、微生物菌種保藏在一定時(shí)間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂根本要求：根本方法：生活態(tài)休眠態(tài)培育基傳代培育寄主傳代培育冷凍枯燥斜面、平板液氮、低溫冰箱沙土管、冷凍真空枯燥 由于微生物的多樣性，不同的微生物往往對(duì)不同的保藏方法有不同的順應(yīng)性，因此，

2、在詳細(xì)選擇保藏方法時(shí)必需對(duì)被保藏菌株的特性、保藏物的運(yùn)用特點(diǎn)及現(xiàn)有條件等進(jìn)展綜合思索。 對(duì)于一些比較重要的微生物菌株，那么要盡能夠多的采用各種不同的手段進(jìn)展保藏，以免因某種方法的失敗而導(dǎo)致菌種的喪失。國際重要菌種保藏機(jī)構(gòu).中國菌種保藏單位.二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) (1)超低溫或在液氮中冷凍保藏；(2)冷凍枯燥或真空枯燥保藏； (3)轉(zhuǎn)接培育或斜面?zhèn)鞔２兀?(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。菌種保藏方法 暫時(shí)保藏法 斜面?zhèn)鞔?穿刺法 長(zhǎng)期保藏法 液體石蠟法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 濾紙片保藏法 冷凍枯燥保藏法 液氮冷凍法 .2.1 冷凍保藏 冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡(jiǎn)單而

3、有效的方法。經(jīng)過冷凍，使微生物代謝活動(dòng)停頓。普通而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得稱心的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培育物中參與一定的冷凍維護(hù)劑。冷凍保藏時(shí)溫度要求在-20以下，同時(shí)應(yīng)仔細(xì)掌握好冷凍速度和解凍速變。冷凍深藏的缺陷之一是培育物運(yùn)輸較困難。冷凍保藏種類 一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80)三、液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù)(-20)將液體培育物或從瓊脂斜面培育物收獲的細(xì)胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，將菌種培育在小的試管或培育瓶斜面上，待生長(zhǎng)適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yán)厲封好，

4、同上置于冰箱中保管。用此方法可以維持假設(shè)干微生物的活力12年。應(yīng)留意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培育物不宜再用來保藏。保藏過程中應(yīng)留意控制保藏溫度，培育瓶或試管應(yīng)嚴(yán)厲密封。這一方法雖簡(jiǎn)便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長(zhǎng)期保藏。二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80)要求長(zhǎng)期保藏的微生物菌種，普通都要求在-60以下進(jìn)展保藏。在超低溫冷藏柜中保藏菌種的普通方法是： 1離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期至后期的微生物細(xì)胞； 2用新穎培育基重新懸浮所收獲的細(xì)胞； 3參與等體積的20甘油或10二甲亞砜； 4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低溫冰箱中保藏。 假設(shè)待保藏菌種生長(zhǎng)在斜面上，那么可用含10甘油的新配制液體培育基

5、洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度普通控制在1-2min。假設(shè)干細(xì)菌和真菌菌種可經(jīng)過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。三、液氮冷凍保藏技術(shù) (一)冷凍維護(hù)劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍維護(hù)劑是二甲亞砜和甘油，最終運(yùn)用濃度普通為甘油10、二甲亞砜5。所運(yùn)用的甘油般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。 (二)液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟 1待冷凍保藏菌種懸液的制備 (1)從生長(zhǎng)斜面制備菌懸液：每一斜面參與5ml含10甘油的營養(yǎng)液體培育；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌體細(xì)胞懸液；0.5lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏公用塑料瓶。 (2)從浸沒培育物制備菌懸液： 在浸沒培育液中參與等體積20%無菌甘

6、油；悄然振蕩混勻培育液，假設(shè)菌體絮凝較緊，那么需先用玻璃珠打散；0.5-lml分裝玻璃安瓿或液氮冷藏公用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口；將一切封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使細(xì)胞和懸浮培育基之間到達(dá)平衡。 2控速冷凍 (1)將安瓿或液氮瓶置于鋁盒或布袋中，然后置于一較大的金屬容器中；(2)將此金屬容器置于控速冷凍機(jī)的冷凍室中；(3)以1-2/min的致冷速度降溫，直到溫度到達(dá)相對(duì)溫度之上幾度的細(xì)胞凍結(jié)點(diǎn)(通常為-30)；(4)補(bǔ)加一定量的液氮至系統(tǒng)中，使細(xì)胞在凍結(jié)點(diǎn)時(shí)盡能夠快地發(fā)生相變；(5)細(xì)胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1/min，直到溫度達(dá)-50；(6)將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-19

7、6)或 氣相(-156)中保管。 假設(shè)無控速冷凍機(jī)，那么普通可將安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保管。(三)復(fù)蘇 1從液氮罐中取出所需的安瓿，立刻置于冰浴中；2迅速將安瓿置于37-40水浴中，并悄然搖動(dòng)以加速解；3用巴氏吸管將安瓿中儲(chǔ)存培育物移接入含有2m1無菌液體培育基的試管中，用同一支吸管反復(fù)抽吸數(shù)次，然后取0.1-0.2ml (約4、8滴)轉(zhuǎn)接入瓊脂斜面上。2.2 凍干保藏 冷凍枯燥的根本方法：是經(jīng)過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華，使培育物枯燥。此法是微生物菌種長(zhǎng)期保藏的最為有效的方法之一。冷凍枯燥過程中必需運(yùn)用冷凍維護(hù)劑，目前國內(nèi)常用脫脂乳和蔗糖，國

8、外尚有運(yùn)用動(dòng)物血清等的。 大部分微生物菌種可以在凍干形狀下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進(jìn)展冷凍保藏，便于運(yùn)輸。培育物的凍干過程冷凍真空枯燥操作流程安培瓶配制維護(hù)劑滅菌菌種培育制備菌懸液分裝安培瓶洗凈烘干裝標(biāo)簽加棉塞預(yù)凍真空枯燥測(cè)定水分熔封管口檢查真空度包藏.(三)凍干菌種的保藏與再生1保藏：冷凍枯燥后的培育物在低于5下保藏。較低的保藏溫度(-20-70)對(duì)于培育物的長(zhǎng)期穩(wěn)定更好。2復(fù)蘇：(1)在超凈任務(wù)臺(tái)中用70酒精棉球擦洗安瓿，然后用砂輪在安瓿中銼一道溝。(2)用無菌紗布或無菌毛巾包好安瓿，然后用手掰開安瓿。(3)在安瓿中參與0.51ml營養(yǎng)液體培育基，漸漸旋轉(zhuǎn)安瓿，使

9、凍干菌種復(fù)水。然后將此轉(zhuǎn)接到一含有再生培育基的無菌試管中，或直接接種瓊脂斜面或涂布平板。(4)在指管中凍干的菌種通常為絮粉狀，可以將此直接振落入盛有l(wèi)2ml液體培育基的試管中，悄然振蕩5l0min，然后用此懸液接種適宜的再生培育基。2.3傳代保藏將菌種定期在新穎瓊脂培育基上傳代，然后在一定的生長(zhǎng)溫度下生長(zhǎng)和保管的傳代保藏方法?？捎糜趯?shí)驗(yàn)室中假設(shè)干菌種的保藏。此法最為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培育基干枯、菌體自溶、基因突變。2.3 傳代培育法實(shí)驗(yàn)原理：保藏的菌種經(jīng)過斜面、穿刺或皰肉培育基用于 厭氧細(xì)菌培育好后，置4C冰箱中存放，定期 進(jìn)展傳代培育、再存放。 可用膠塞替代棉

10、塞或在斜面上覆蓋一層無菌液體 石蠟來進(jìn)一步延伸保管期。操作方法 1、斜面保藏法 將菌種轉(zhuǎn)接在適宜固體斜面培育基上，待其充分生長(zhǎng)后，用牛皮紙將棉塞部分包扎好棉塞換成膠塞效果更好，置4C冰箱中包藏。 保藏時(shí)間依微生物的種類而定。霉菌、放線菌及芽孢菌保管24個(gè)月移種一次，酵母菌間隔兩個(gè)月，普通細(xì)菌一個(gè)月，假單胞菌兩周傳代一次。 此法優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、運(yùn)用方便，缺陷是保藏時(shí)間短、易被污染。2、液體石蠟保藏法 將無菌石蠟加在已長(zhǎng)好菌的斜面上，其用量以高出斜面頂端1CM為準(zhǔn)，使菌種與空氣隔絕。 將試管直立，置低溫或室溫下保管。 此法適用且效果較好。霉菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏12年，普通

11、細(xì)菌也可保藏1年左右。3、穿刺保藏法 按穿刺接種方式培育菌種，菌種長(zhǎng)好后用膠塞封嚴(yán)，置4冰箱存放。礦物油中浸沒保藏將瓊脂斜面或液體培育物浸入礦物油中于室溫下保藏，此方法簡(jiǎn)便有效。可用于絲狀真菌、酵母、細(xì)菌和放線菌的保藏。特別對(duì)難于冷凍枯燥的絲狀真菌和難以在固體培育基上構(gòu)成孢子的擔(dān)子菌等的保藏更為有效。浸沒保藏的操作要點(diǎn)是首先讓待保藏菌種在適宜的培育基上生長(zhǎng)，然后注入經(jīng)170下滅菌1-2h的礦物油，礦物油的用量以高出培育物1cm為宜。以液體石蠟作為保藏方法時(shí)，應(yīng)對(duì)需保藏的菌株預(yù)先作實(shí)驗(yàn)。由于某些菌株在液體石蠟下生長(zhǎng)還十清楚顯，有些菌株如某些假絲酵母還會(huì)同化液體石蠟，也有的對(duì)液體石蠟保藏敏感。一切

12、這些菌株都不能用液體石蠟保藏。為了預(yù)防不測(cè)，普通保藏株23年也應(yīng)做一次存活實(shí)驗(yàn)。2.4 載體法實(shí)驗(yàn)原理：使生長(zhǎng)適宜的微生物吸附在一定的載體上進(jìn)展枯燥。 常用的載體有土壤、砂土、硅膠、明膠、麩皮、磁珠和濾 紙片等。操作方法砂土管保藏法 1河砂處置 取河砂假設(shè)干參與鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機(jī)機(jī)質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。土壤處置 取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。 (3)砂土混合 處置妥當(dāng)?shù)暮由芭c土壤按3：1的比例摻合(或根據(jù)需求

13、而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻后，裝入10 x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進(jìn)展滅菌(通常采用間歇滅菌2-3次)，最后烘干。2.4 基因工程菌的保藏由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易喪失其外源質(zhì)粒復(fù)制子。質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷?xì)胞生長(zhǎng)非必需。普通情況下當(dāng)細(xì)胞喪失這些質(zhì)粒時(shí)，生長(zhǎng)速度會(huì)加快。當(dāng)培育基中參與抗生素時(shí)，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞群體的極有用的生長(zhǎng)選擇壓。而且在運(yùn)用基因工程菌進(jìn)展發(fā)酵時(shí)，抗生素的參與可協(xié)助維持質(zhì)粒復(fù)制與染色體復(fù)制的協(xié)調(diào)。 我們建議基因工程菌應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培育基中。不同菌種保藏方法比較細(xì)菌的保藏.放

14、線菌菌種的保藏保藏方法主要有：沙土管法、冷凍枯燥法、液氮冷凍法 放線菌菌種的長(zhǎng)期保藏依保藏放線菌的分生孢子為主要方式。.2.5 微生物活力和穩(wěn)定性測(cè)定 一切保藏菌種的方法都必需是長(zhǎng)期可靠地堅(jiān)持菌種的優(yōu)良性狀不變。在保藏時(shí)定期檢測(cè)菌種活力，以確定保藏培育物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及確定在實(shí)踐保藏過程中出現(xiàn)的細(xì)胞死亡程度和遺傳穩(wěn)定性。對(duì)工業(yè)微生物消費(fèi)菌種來說，建議保藏菌種的形狀學(xué)和生化特征(如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、酶活力、遺傳特征及生化目的)應(yīng)在保藏后加以檢測(cè)和確定。 加速保藏實(shí)驗(yàn)可用于預(yù)測(cè)保藏過程中保藏培育物的穩(wěn)定性。在一給定溫度下經(jīng)過對(duì)高溫下短期活力喪失程度檢測(cè)，可以用來預(yù)測(cè)嗜酸乳桿菌的穩(wěn)定

15、性。 勝利的菌種長(zhǎng)期保藏方法之有價(jià)值的目的包括在保藏6個(gè)月、1年或更長(zhǎng)時(shí)間后存活百分率(或存活單位)。細(xì)胞群體的形狀學(xué)特征或一些特別的生化特征應(yīng)在菌種保藏前后堅(jiān)持同一性，以及實(shí)驗(yàn)室中、中試車間中和消費(fèi)發(fā)酵中產(chǎn)品滴度的穩(wěn)定性，后者極為重要。第十節(jié) 菌種的衰退與復(fù)壯 在生物進(jìn)化的歷史長(zhǎng)河中，遺傳性的變異是絕對(duì)的，而它的穩(wěn)定性反而是相對(duì)的；退化性的變異是大量的，而進(jìn)化性的變異卻是個(gè)別的。在自然情況下，個(gè)別的順應(yīng)性變異經(jīng)過自然選擇就可保管和開展，最后成為進(jìn)化的方向；在人為條件下，人們也可以經(jīng)過人工選擇法去有認(rèn)識(shí)地挑選出個(gè)別的正變體用于消費(fèi)實(shí)際中。相反，如不自覺、仔細(xì)地去進(jìn)展人工選擇，大量的自發(fā)突變菌株

16、就會(huì)趁機(jī)泛濫，最后導(dǎo)致菌種的衰退degeneration。 在長(zhǎng)期接觸菌種的實(shí)踐任務(wù)人員中，都有這樣的領(lǐng)會(huì)，即假設(shè)對(duì)菌種任務(wù)長(zhǎng)期放任自流，不搞純化、復(fù)壯rejuve-nation和育種，那么菌種就會(huì)對(duì)他進(jìn)展“懲罰，反映到消費(fèi)上就會(huì)出現(xiàn)繼續(xù)的低產(chǎn)、不穩(wěn)產(chǎn)。這闡明菌種的消費(fèi)性狀也是不進(jìn)那么退的。菌種衰退的表現(xiàn)對(duì)產(chǎn)量性狀來說，菌種的負(fù)變就是衰退。其他原有的典型性狀變得不典型時(shí)，也是衰退。最易覺察到的是菌落和細(xì)胞形狀的改動(dòng)。生長(zhǎng)速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少。代謝產(chǎn)物消費(fèi)才干或其對(duì)宿主寄生才干的下降。衰退還表如今抗不良環(huán)境條件抗噬菌體、抗低溫等才干的減弱等。 菌種衰退的本質(zhì)菌種的衰退是發(fā)生在細(xì)胞群體中的一個(gè)

17、由量變到量變的逐漸演化過程。開場(chǎng)時(shí)，在一個(gè)大群體中僅個(gè)別細(xì)胞發(fā)生負(fù)變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效措施，而一味移種傳代，那么群體中這種負(fù)變個(gè)體的比例逐漸增大，最后讓它們占了優(yōu)勢(shì)，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)出嚴(yán)重的衰退。所以，在開場(chǎng)時(shí)所謂“純的菌株，實(shí)踐上其中已包含著一定程度的不純要素；同樣，到了后來，整個(gè)菌種雖已“衰退了，但也是不純的，即其中還有少數(shù)尚未衰退的個(gè)體存在著。復(fù)壯的概念狹義的復(fù)壯僅是一種消極的措施，它指的是在菌種已發(fā)生衰退的情況下，經(jīng)過純種分別和測(cè)定消費(fèi)性能等方法，從衰退的群體中找出少數(shù)尚未衰退的個(gè)體，以到達(dá)恢復(fù)該菌原有典型性狀的一種措施；而廣義的復(fù)壯那么應(yīng)是一項(xiàng)積極的措施，即在菌種的消費(fèi)性能尚未衰退前就經(jīng)常有認(rèn)識(shí)地進(jìn)展純種分別和消費(fèi)性能的測(cè)定任務(wù)，以期菌種的消費(fèi)性能逐漸有所提高。所以，這實(shí)踐上是一種利用自發(fā)突變正變不斷從消費(fèi)中進(jìn)展選種的任務(wù)。 二、菌種的衰退與復(fù)壯1從衰退的菌種群體中把少數(shù)個(gè)體再找出來，重新獲得具有原有典型性狀的菌種。2有認(rèn)識(shí)地利用微生物會(huì)發(fā)生自發(fā)突變的特性，在日常的菌種 維護(hù)任務(wù)中不斷挑選“正變個(gè)體。大量群體中的自發(fā)突變菌種的復(fù)壯：a純種分別；b經(jīng)過寄主體進(jìn)展復(fù)壯；菌種衰退的特點(diǎn)：實(shí)際中關(guān)于防止菌種衰退和進(jìn)展復(fù)壯的閱歷 一衰退的防止 1控制傳代次數(shù) 2發(fā)明良好的培育條件 在實(shí)際中，有人發(fā)現(xiàn)如發(fā)明一個(gè)適宜原種的