轉(zhuǎn)錄基本知識003 精簡

1、第三章 生物信息的傳遞（上 ）RNA的生物合成RNA Biosynthesis, Transcription1遺傳信息傳遞的 中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物的遺傳信息以密碼的形式儲存在DNA分子上，表現(xiàn)為特定的核苷酸排列順序。在細(xì)胞分裂的過程中，通過DNA復(fù)制把親代細(xì)胞所含的遺傳信息忠實(shí)地傳遞給兩個子代細(xì)胞。在子代細(xì)胞的生長發(fā)育過程中，這些遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄傳遞給RNA，再由RNA通過翻譯轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的蛋白質(zhì)多肽鏈上的氨基酸排列順序，由蛋白質(zhì)執(zhí)行各種各樣的生物學(xué)功能，使后代表現(xiàn)出與親代相似的遺傳特征。后來人們又發(fā)現(xiàn)，在宿主細(xì)胞中一些RNA病毒能以自己的RNA為模板復(fù)制出新的病

2、毒RNA，還有一些RNA病毒能以其RNA為模板合成DNA，稱為逆轉(zhuǎn)錄這是中心法則的補(bǔ)充。 中心法則總結(jié)了生物體內(nèi)遺傳信息的流動規(guī)律，揭示遺傳的分子基礎(chǔ)，不僅使人們對細(xì)胞的生長、發(fā)育、遺傳、變異等生命現(xiàn)象有了更深刻的認(rèn)識，而且以這方面的理論和技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展了基因工程，給人類的生產(chǎn)和生活帶來了深刻的革命。2 RNA /DNA Structure3RNA的分子結(jié)構(gòu)RNA為單鏈結(jié)構(gòu)，局部可因堿基互補(bǔ)配對(A-U，C-G)以氫鍵相連形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。不參加配對的堿基所形成的單鏈則被排斥在雙鏈外，形成環(huán)狀突起。這就是RNA的二級結(jié)構(gòu)。RNA按功能不同分為三類，即信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)

3、及核蛋白體RNA(rRNA)。每三個堿基對應(yīng)一種氨基酸，因此其堿基排列順序決定了由它指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)多肽鏈的氨基酸排列順序。4RNA含有四種基本堿基，即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶。此外還有幾十種稀有堿基。 RNA的一級結(jié)構(gòu)主要是由AMP、GMP、CMP和UMP四種核糖核苷酸通過3，5磷酸二酯鍵相連而成的多聚核苷酸鏈。天然RNA的二級結(jié)構(gòu)，一般并不像DNA那樣都是雙螺旋結(jié)構(gòu)，只有在許多區(qū)段可發(fā)生自身回折，使部分A-U、G-C堿基配對，從而形成短的不規(guī)則的螺旋區(qū)。不配對的堿基區(qū)膨出形成環(huán)，被排斥在雙螺旋之外。RNA中雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素，也主要是堿基的堆砌力，其次才是氫鍵。每一段雙螺旋區(qū)至少需

4、要46對堿基對才能保持穩(wěn)定。在不同的RNA中，雙螺旋區(qū)所占比例不同。細(xì)胞內(nèi)有三類主要的核糖核酸，即：mRNA、rRNA、tRNA。它們各有特點(diǎn)。在大多數(shù)細(xì)胞中RNA的含量比DNA多58倍。5RNA與DNA最重要的區(qū)別一是RNA只有一條鏈，二是它的堿基組成與DNA的不同，RNA沒有堿基T（胸腺嘧啶），而有堿基U（尿嘧啶）。所以導(dǎo)致他們有以下性質(zhì)上的不同。1.兩性解離：DNA無，只有酸解離，堿基被屏蔽（在分子內(nèi)部形成了H鍵）。RNA有，有PI。 2.粘度大：DNA;RNA，粘度由分子長度/直徑?jīng)Q定，DNA為線狀分子，RNA為線團(tuán)。 3.堿的作用：DNA耐堿RNA易被堿水解。 4.顯色反應(yīng)： 鑒別D

5、NA和RNA+濃HCl RNA - 綠色化合物 DNA - 藍(lán)紫色化合物苔黑酚 二苯胺啡啶溴紅（熒光染料）和溴嘧啶都可對DNA染色，原理是卡在分子中，DNA的離心和電泳顯色可用它們。 65.溶解性：都溶于水而不溶于乙醇，因此，常用乙醇來沉淀溶液中的DNA和RNA。DNA溶于苯酚而RNA不溶，故可用苯酚來沉淀RNA。 6.紫外吸收：核酸的m260nm，堿基展開程度越大，紫外吸收就越厲害。當(dāng)A1時，DNA：50ug/ml，RNA和單鏈DNA：40ug/ml，寡核苷酸：20ug/ml。用A260/A280還可來表示核酸的純度。 7.沉降速度：對于拓?fù)洚悩?gòu)體（核苷酸數(shù)目相同的核酸），其沉降速度從達(dá)到小

6、依次為：RNA ; 超螺旋DNA 解鏈環(huán)狀DNA ; 松弛環(huán)狀DNA ; 線形DNA也就是在離心管中最上層是線形DNA，最下面是RNA。 8.電泳：核苷酸、核酸均可以進(jìn)行電泳，泳動速度主要由分子大小來決定，因此，電泳是測定核酸分子量的好方法。 9.DNA分子量測定最直接的方法：用適當(dāng)濃度的EB（溴嘧啶）染色DNA，可以將其他形式的DNA變成線形DNA，用電鏡測出其長度，按B-DNA模型算出bp數(shù)，根據(jù)核苷酸的平均分子量就可計(jì)算出DNA的分子量。 7紫外分光光度計(jì) A260/A280和A260/A230的含義A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波長，最佳測量值的范圍為0.1至1.0。A280nm

7、是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。如果比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當(dāng)于50蛋白質(zhì)/DNA溶液A230nm ，是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評估：純DNA和 RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。 A260/A280和A260/A230 ：是核酸純度的指示值，純度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值應(yīng)該在2.0 或2.5，A260 / A280的比值

8、， 用于評估樣品的純度， 因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80 nm。 純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230是多肽、芳香基團(tuán)、苯酚和一些碳?xì)浠衔锏奈舛?，A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0 。8在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄（transcription）。經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA(small nuclear R

9、NA和HnRNA等。轉(zhuǎn)錄RNADNA 9mRNA攜帶了DNA的遺傳信息，在蛋白質(zhì)合成中作為合成蛋白質(zhì)的模板起傳遞遺傳信息的作用。tRNA的二級結(jié)構(gòu)最具特色，呈三葉草型。其主要功能部位有二個，一是氨基酸臂的 3末端為-CCA-OH，起特異結(jié)合氨基酸作用；二是有一個反密碼環(huán)，環(huán)上有反密碼子，與mRNA上的密碼子反向互補(bǔ)，于是由tRNA攜帶的氨基酸可被轉(zhuǎn)運(yùn)到與密碼子對應(yīng)的部位，因此tRNA具有攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。tRNA的三級結(jié)構(gòu)為倒“L”型，是天然狀態(tài)下的構(gòu)象。 rRNA不單獨(dú)存在，它與蛋白質(zhì)結(jié)合為核蛋白體，分為大小亞基，存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞漿中。核蛋白體是蛋白質(zhì)生物合成的場所。snRNA 參與

10、RNA 剪輯10復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別 11轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的中心環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)錄是以 DNA為模板合成RNA, 并且只是以單股DNA 為模板，因此具有不對稱性；用以轉(zhuǎn)錄的單鏈DNA, 稱為模板鏈, 與復(fù)制不同，轉(zhuǎn)錄是局部的,從啟動子開始到終止子結(jié)束,為一個轉(zhuǎn)錄單位;轉(zhuǎn)錄不需要引物；轉(zhuǎn)錄的忠實(shí)性相對弱；轉(zhuǎn)錄首先得到RNA前體，然后再進(jìn)行加工轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腞NA.12第一節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄合成的特點(diǎn)Characters of RNA Biosynthesis13轉(zhuǎn)錄（transcription）的不對稱性就是指以雙鏈DNA中的一條鏈作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。對于不同的基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息可

11、以存在于兩條不同的DNA鏈上。一、轉(zhuǎn)錄的不對稱性14能夠轉(zhuǎn)錄RNA的那條DNA鏈稱為模板鏈(template strand) ，也稱作反義鏈。 與模板鏈互補(bǔ)的另一條DNA鏈稱為編碼鏈(coding strand)，也稱為有意義鏈。 模板鏈編碼鏈553355155335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈轉(zhuǎn)錄方向轉(zhuǎn)錄方向模板鏈和編碼鏈的相對性165GCAGTACATGTC 33 c g t g a t g t a c a g 5編碼鏈模板鏈mRNA5GCAGUACAUGUC 3轉(zhuǎn)錄NAla Val His Val C蛋白質(zhì)翻譯模板鏈、編碼鏈與轉(zhuǎn)錄及翻譯的關(guān)系17RNA轉(zhuǎn)錄合成時，以DNA作為模板，在RNA聚

12、合酶的催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進(jìn)行連接。二、轉(zhuǎn)錄的連續(xù)性18RNA轉(zhuǎn)錄合成時，只能向一個方向進(jìn)行聚合，所依賴的模板DNA鏈的方向?yàn)?5，而RNA鏈的合成方向?yàn)?3。 三、轉(zhuǎn)錄的單向性19RNA轉(zhuǎn)錄合成時，只能以DNA分子中的某一段作為模板，故存在特定的起始位點(diǎn)和特定的終止位點(diǎn)。特定起始點(diǎn)和特定終止點(diǎn)之間的DNA鏈構(gòu)成一個轉(zhuǎn)錄單位，通常由轉(zhuǎn)錄區(qū)和有關(guān)的調(diào)節(jié)順序構(gòu)成。 四、有特定的起始和終止位點(diǎn)20第二節(jié) 參與轉(zhuǎn)錄合成的酶和蛋白因子Enzymes and Protein Factors for RNA Biosynthesis21原料：NTP （ATP, UTP, GT

13、P, CTP）。模板：單鏈DNA。酶：RNA聚合酶（RNA-pol）。其他蛋白質(zhì)因子：如轉(zhuǎn)錄因子、終止因子等。參與RNA轉(zhuǎn)錄合成的物質(zhì)22這是一種不同于引物酶的依賴DNA的RNA聚合酶（DNA dependent RNA polymerase，DDRP）。該酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從53聚合形成RNA。 一、RNA聚合酶（DDRP）23原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個亞基構(gòu)成，即2。亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的識別有關(guān)，在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放；余下的部分（2）被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關(guān)。 （一）原核生物的RNA聚合酶24核心酶 (core enzyme

14、)全酶 (holoenzyme)原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶25原核生物RNA聚合酶亞基的功能26單因子RNA 聚合酶T3,T7，sp6噬菌體RNA 聚合酶 200多個氨基酸組成的多肽 特異性多噬菌體上幾個啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。 體外獲得單鏈或者雙鏈RNA的最好的工具！簡單，高效。RNA 聚合酶+T7/T3/T6啟動子+ DNA 雙聯(lián)模板+終止子+ NTP+Mg2+ H2O27真核生物中的RNA聚合酶可按其對-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由1012個大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功能也不同。 （二）真核生物的RNA聚合酶28在真核生物中，轉(zhuǎn)錄的起始過程較為復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種蛋白

15、因子與RNA轉(zhuǎn)錄合成有關(guān)。凡是與基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)的蛋白因子統(tǒng)稱為反式作用因子（transacting factor）。二、轉(zhuǎn)錄因子29在反式作用因子中，直接或間接參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的形成的蛋白因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（transcriptional factor, TF）。不同的RNA聚合酶存在相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，如與RNA聚合酶相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TFH等。30真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子及其功能31 協(xié)助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子（蛋白質(zhì)）則稱為終止因子 (termination factor)。有的終止信號的作用可被特異的因子所阻止，使RNA聚合酶得

16、以越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，這稱為通讀(readthrough)，這類引起抗終止作用的蛋白質(zhì)稱為抗終止因子(antitermination)。原核生物中的終止因子蛋白是一種六聚體的蛋白質(zhì)，亞基的分子量為50kd。蛋白能識別轉(zhuǎn)錄終止信號，并與RNA緊密結(jié)合，導(dǎo)致RNA的釋放。 三、終止因子32第三節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄合成的過程The Process of RNA Biosynthesis33真核生物和原核生物轉(zhuǎn)錄的差別DNA核核糖體新生蛋白質(zhì)真核生物原核生物mRNA前體轉(zhuǎn)運(yùn)加工mRNAmRNA 真核生物中轉(zhuǎn)錄與復(fù)制在不同的區(qū)域 RNA聚合酶不相同 啟動子不同 轉(zhuǎn)錄后RNA加工修飾不同34RNA合成過程起始雙

17、鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達(dá)基因終點(diǎn)延長階段53RNA 啟動子（promoter) 終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開35（一）轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始需解決兩個問題：RNA聚合酶必須準(zhǔn)確地結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板。一、原核生物的轉(zhuǎn)錄過程36在原核生物中，若干功能相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因常常串聯(lián)在一起，由其上游的同一調(diào)控序列進(jìn)行調(diào)控，這種基因的組織形式稱為操縱子（operon）。1. 模板與酶的辨認(rèn)識別：5335結(jié)構(gòu)基因調(diào)控序列RNA-pol37DNA分子中參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的序列統(tǒng)稱為順式作用元件（cis-acting e

18、lement）。原核生物轉(zhuǎn)錄起始時，首先由RNA聚合酶中的因子識別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并促使核心酶結(jié)合形成全酶復(fù)合物。38位于基因上游，與RNA聚合酶識別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一些DNA調(diào)控序列被稱為啟動子（promoter）。啟動子序列通常由一些帶共性的保守序列構(gòu)成。39 利用足跡法(footprint)和DNA測序法可以確定啟動子的序列結(jié)構(gòu)。原理:DNA和蛋白質(zhì)結(jié)合以后便不會被DNAase分解，在測序時便出現(xiàn)空白區(qū)(即蛋白質(zhì)結(jié)合區(qū))，從而了解與蛋白質(zhì)結(jié)合部位的核苷酸對數(shù)目。在用酶移出與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA后，又可測出被結(jié)合處DNA的序列。 40足跡法確定啟動子序列41開始轉(zhuǎn)錄(Pribnow box

19、)T A T A A T Pu A T A T T A Py-10 區(qū)1-30-5010-10-40-205 3 3 5 原核生物啟動子的保守序列T T G A C AA A C T G T-35 區(qū)RNA-pol辨認(rèn)位點(diǎn)(recognition site) 55RNA聚合酶保護(hù)區(qū)結(jié)構(gòu)基因3342原核生物轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的一致性序列43大腸桿菌啟動子共有序列的功能AGTCTTGACAAATTTAAATAACTGTAATPribnow框-10-35識別區(qū)16-19bp5-9bp起點(diǎn)44被RNA聚合酶辨認(rèn)的區(qū)段就是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-35區(qū)的TTGACA序列。RNA聚合酶與該區(qū)結(jié)合后，即滑動至-10區(qū)的TA

20、TAAT序列（Pribnow盒），并啟動轉(zhuǎn)錄。 45RNA聚合酶全酶在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的結(jié)合 氫鍵 結(jié)合于大小溝解鏈區(qū)-9-+1346 DNA局部雙鏈解開。 RNA聚合酶全酶(2)與模板（啟動子區(qū)）結(jié)合。 在RNA聚合酶作用下發(fā)生第一次聚合反應(yīng)，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。產(chǎn)生第一個核苷酸(+1)RNApol (2) - DNA - pppGpN- OH 3轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物:5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi2. 轉(zhuǎn)錄的起始過程：47Fig6.3 The factor confers specificity for the T4 immediate early gen

21、es.48Binding of RNA polymerase to promoterThe factor allows initiation of transcription by causing the RNA polymerase holoenzyme to bind tightly to a promoter.It depends on local melting of DNA to form an open-promoter complex and is possible only in the presence of .The can therefore select which g

22、enes will be transcribed .After has participated in intiation ,it dissociate from the core polymerase, leaving the core to carry on with the elongation process.49RNA polymerase/promoter binding50更換不同的 factor 控制不同基因轉(zhuǎn)錄！E.coli:3種S.b: 2種 51Transcription InitiationComplex:RNA polymerase makes many small,

23、abortive transcripts without ever leaving the Promoter.the abortive transcripts up to 9-10 nt in size流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄通過啟動子（起始）快：強(qiáng)啟動子 慢： 弱啟動子52轉(zhuǎn)錄起始可被抑制利福平rifamycin ：抑制亞基利迪鏈霉素strepolydigin抑制亞基 注意鏈霉素strepomycin結(jié)合了細(xì)菌核糖體 30S 小亞基放線菌素D actinomycin 抑制真核聚合酶I，與DNA 結(jié)合，阻止延伸 （凋亡）-鵝膏蕈堿amanitin ：具有雙環(huán)結(jié)構(gòu)的八肽毒素，真核聚合酶II 結(jié)合，抑制催化合成m

24、RNA ，（致死）53因子從全酶上脫離，余下的核心酶繼續(xù)沿DNA鏈移動，按照堿基互補(bǔ)原則，不斷聚合RNA。 1. 亞基脫落，RNApol聚合酶核心酶變構(gòu)，與模板結(jié)合松弛，沿著DNA模板前移；2. 在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷延長。（二）轉(zhuǎn)錄延長(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi54轉(zhuǎn)錄空泡(transcription bubble)的形成55原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象56RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機(jī)制有兩種：1，內(nèi)在因子，非Rho因終止子：轉(zhuǎn)錄的終止的特殊信號（一段RNA 序列） 2依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止：由終止因子（因子）識別特異的終止信號，并促使RN

25、A的釋放。（三）轉(zhuǎn)錄終止：RNA 聚合酶停滯， RNA 解離57模板DNA鏈在接近轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動停止，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。1非依賴Rho的轉(zhuǎn)錄終止：58596061625UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3 RNA 5TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTT

26、TTTAGTCACCAGCCTTTTT. 3 DNA UUUUU. UUUU.5UUGCAGCCUGACAAAUCAGGCUGAUGGCUGGUGACUUUUUAGUCACCAGCCUUUUU. 3莖環(huán)(stem-loop)/發(fā)夾(hairpin)結(jié)構(gòu)6364莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理 使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓； 使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。65大腸桿菌兩類終止子的回文結(jié)構(gòu)A. 不依賴于Rho（）的終止子A. 依賴于Rho（）的終止子富含G-C系列U66ATP2，依賴 Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA 序列缺乏共性，不能形成強(qiáng)的發(fā)卡結(jié)構(gòu)6聚體， 具有NTP酶和解螺旋酶6768原核轉(zhuǎn)錄和翻

27、譯同時進(jìn)行 mRNA 翻譯起始： SD 序列:AUG上游的7-12 和核苷酸，AGGAGG與16S RNA互補(bǔ) UCCUCC多順反子rRNA 加工69原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面：rRNA前體被大腸桿菌RNase,RNaseE等剪切成一定鏈長的rRNA分子；rRNA在修飾酶催化下進(jìn)行堿基修飾；rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基 70二、真核生物的轉(zhuǎn)錄過程1. 轉(zhuǎn)錄起始的上游區(qū)段：UAS真核生物的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-35-25bp區(qū)也存在一段富含TA的順序，被稱為Hogness盒或TATA盒，通常認(rèn)為是啟動子的核心序列。（一）轉(zhuǎn)錄起始： 真核生物的啟動子71除此之外，在真核生物

28、中還可見到其他帶共性的序列，如 -80-70, CAAT盒(ccaat)及-110-80GC盒(gggcggg)等。 TATA盒上游的序列：UAS,在遠(yuǎn)離受控基因處存在的，能夠增強(qiáng)基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控序列稱為增強(qiáng)子（enhancer）。增強(qiáng)子特點(diǎn)：p79 遠(yuǎn)距離效應(yīng)；無方向性；順勢調(diào)控；廣泛性，相位性72真核生物啟動子保守序列參與轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)確定起始控制轉(zhuǎn)錄起始頻率73真核生物中的RNA聚合酶可按其對-鵝膏蕈堿的敏感性而分為三種，它們均由1012個大小不同的亞基所組成，結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，其功能也不同。 真核生物的三種RNA聚合酶74真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子及其功能真核轉(zhuǎn)錄起始需要各種轉(zhuǎn)錄因子75真核

29、生物轉(zhuǎn)錄起始時，首先由TFD的TBP亞基識別并結(jié)合TATA盒，然后在其他轉(zhuǎn)錄因子的配合下，與RNA聚合酶組裝形成轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)。2. 轉(zhuǎn)錄起始過程：76RNA聚合酶催化第一個磷酸二酯鍵形成。RNA聚合酶的羧基末端結(jié)構(gòu)域（CTD）被磷酸化修飾，大部分轉(zhuǎn)錄因子脫離，聚合酶向下游移動延伸RNA鏈。77（二）轉(zhuǎn)錄延長真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物類似，但由于存在核小體的高級結(jié)構(gòu)，故在轉(zhuǎn)錄延長過程中可觀察到核小體移位和解聚現(xiàn)象。78（三）轉(zhuǎn)錄終止真核生物轉(zhuǎn)錄終止與轉(zhuǎn)錄后修飾，即poly A尾巴結(jié)構(gòu)的添加密切相關(guān)。在poly A修飾位點(diǎn)的下游存在

30、一組共同序列AATAAA和GTGTGT，為轉(zhuǎn)錄終止的識別修飾位點(diǎn)。在轉(zhuǎn)錄越過修飾點(diǎn)后，RNA鏈在修飾點(diǎn)處被切斷，隨即進(jìn)行加帽和加尾修飾。79真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄終止5-AAUAAA-5 -AAUAAA-核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAA GTGTGTG轉(zhuǎn)錄終止的修飾點(diǎn)55333加尾AAAAAAA 3 mRNA80第四節(jié) 真核生物的轉(zhuǎn)錄后修飾Post-transcriptional Modification in Eukaryote81 1加帽（adding cap）：即在mRNA的5-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即HnRNA即可進(jìn)行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的

31、作用下，將5-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對G進(jìn)行甲基化。 一、真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工（一）首、尾的修飾82GAAGuanine-7-methyl-transferase2-O-methyl-transferaseCap 01015%100%83 2加尾（adding tail）：這一過程也是細(xì)胞核內(nèi)完成，首先由核酸外切酶切去3-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。polyA結(jié)構(gòu)與mRNA的半壽期有關(guān)。 84The 3 ends of mRNAs are generated by cleavage and polyadenylation；The s

32、equence AAUAAA is necessary for cleavage to generate a 3 end for polyadenylation.85（二）mRNA的剪接（splicing）雞卵清蛋白成熟mRNA與DNA雜交電鏡圖mRNADNA861. 斷裂基因（splite gene）CABD編碼區(qū) A、B、C、D非編碼區(qū)真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)，這些基因稱為斷裂基因。87外顯子(exon)和內(nèi)含子(intron) 外顯子在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達(dá)為成熟RNA

33、的核酸序列（結(jié)構(gòu)基因中能夠指導(dǎo)多肽鏈合成的編碼順序）。內(nèi)含子隔斷基因的線性表達(dá)而在剪接過程中被除去的核酸序列（不能指導(dǎo)多肽鏈合成的非編碼順序）。88核內(nèi)帶有外顯子和內(nèi)含子編碼序列的初級RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稱為雜化核RNA （hetero-nuclear RNA, hnRNA）。hnRNA經(jīng)剪接加工除去內(nèi)含子編碼序列并將外顯子編碼序列連接起來才能形成成熟的mRNA。2. hnRNA和snRNA：89snRNA為核內(nèi)小RNA，富含尿嘧啶，故以U作分類和命名，如 U1、U2等。snRNA與核內(nèi)蛋白質(zhì)組裝形成小核蛋白體（snRNP），參與hnRNA的剪接加工。903. hnRNA的剪接過程： snRNP與h

34、nRNA結(jié)合成為剪接體。91 剪接體結(jié)構(gòu)調(diào)整，U2和U6形成催化中心，發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。92UpAGpU外顯子1內(nèi)含子外顯子2pG-OH(ppG-OH, pppG-OH)U-OHGpUpGpA第一次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)第二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)G-OHUpUpGpA剪接過程的二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)I 型內(nèi)含子93II 型內(nèi)含子線粒體與葉綠體的rRNA 中 無需自由Gpp 使用自身2-OH 進(jìn)行攻擊:(有酶催化活性的RNA分子命名為Ribozyme )!94 核酶一類具有催化功能的RNA分子，1982 Cech ,從四膜蟲rRNA前提加工中發(fā)現(xiàn)（自我剪切）。特殊結(jié)構(gòu)2種類型潛在應(yīng)用95雞卵清蛋白基因hnRNA首、尾修飾hnRNA剪接

35、成熟的mRNA雞卵清蛋白基因及其轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾964. mRNA的編輯和修飾RNA的編輯(RNA editing): 某些RNA，特別是mRNA的一種加工方式，它導(dǎo)致了DNA所編碼的遺傳信息的改變（如 單堿基突變）RNA的修飾（RNA modification）： 有些RNA，特別是前體rRNA和tRNA可能有特異性的化學(xué)修飾。97RNA的編輯 :mRNA編輯是在mRNA水平上信息發(fā)生改變(堿基取代、插入或缺失)的過程。在哺乳動物細(xì)胞中，mRNA中有時會發(fā)生單個堿基的替換，導(dǎo)致它所編碼的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變。在錐蟲線粒體中，當(dāng)堿基有條理地增加或缺失時，在一些基因的轉(zhuǎn)錄物中會發(fā)生更大范圍的變化。

36、mRNA編輯機(jī)理：非剪切作用改變mRNA。98堿基取代如哺乳動物載脂蛋白B mRNA的編輯：載脂蛋白B的mRNA含29個外顯子，有4563個code，第2153號code是CAA，在肝中mRNA 編碼4563AA的蛋白，小腸中存在的脫氫酶使C脫氫，將CAAUAA，小腸的mRNA中編輯產(chǎn)生UAA使翻譯停止在2153code處。Apo100Apo48:形成CM:乳糜顆粒99堿基的插入或缺失和移碼移碼：錐蟲coxII(cytochromeoxidase,細(xì)胞色素氧化酶II)基因的mRNA相對于其DNA序列出現(xiàn)了讀碼框的偏移，通過插入4個U，才能產(chǎn)生正確的讀碼框。100 插入或缺失：錐蟲線粒體的細(xì)胞色

37、素氧化酶III mRNA序列分析表明，許多U并非在DNA中編碼（紅色）或在RNA中被除掉（用T表示）。這些U的專一性插入信息是由向?qū)NA(guide RNA)提供的，向?qū)NA含有和正確編輯的RNA互補(bǔ)的一段序列。101尿嘧啶殘基的添加或刪除過程：首先RNA切斷，添加或去除尿嘧啶，最后進(jìn)行末端連接。該反應(yīng)在向?qū)NA的指導(dǎo)下由一個酶復(fù)合體催化完成的。102二、tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工主要有以下幾種加工方式：切斷。剪接。3-末端-CCA序列添加?；瘜W(xué)修飾。103tRNA前體RNA pol TGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNAtRNA前體的轉(zhuǎn)錄合成104tRNA前體的切斷和剪接加工10

38、5tRNA3-末端-CCA序列的添加106tRNA的堿基修飾（2）還原反應(yīng) 如：U DHU （3）核苷內(nèi)的轉(zhuǎn)位反應(yīng) 如：U （4）脫氨反應(yīng) 如：A I 如：A Am（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）107三、rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工 真核生物中前體包括了18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA序列。在高等真核生物中，前體以沉降速率來命名，命名為45SRNA，在低等真核生物中，它比較?。ㄈ缃湍钢袨?5S）108109rRNA前體的轉(zhuǎn)錄和剪接加工110 原核生物中前體包括了16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA和tRNA序列。前體為30S RNA。111112四、RNA生物功能的多樣性1、RNA在遺傳信息的翻譯中起著決定作用。2、RNA具有重要的催化功能和其他持家功能。3、RNA轉(zhuǎn)錄后加工和修飾依賴于各類小