分子生物學(xué)緒論20152016學(xué)年

1、分子生物學(xué) Molecular Biology1緒論introduction2第一節(jié)分子生物學(xué)是從分子水平探討 生命活動(dòng)的本質(zhì) 一、分子生物學(xué)的定義 二、分子生物學(xué)發(fā)展簡(jiǎn)史 三、分子生物學(xué)研究對(duì)象和研究?jī)?nèi)容 3 生物學(xué)：研究生命現(xiàn)象、生命的本 質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。 生命科學(xué)研究的三個(gè)層次： 1、整體水平 2、細(xì)胞水平 3、分子水平 4分子生物學(xué):從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命本 質(zhì)、生命活動(dòng)及其規(guī)律的科學(xué)。核心內(nèi)容：從分子水平研究基因和基因的活動(dòng) （核酸和蛋白質(zhì)活動(dòng)）。5核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能基因組的結(jié)構(gòu)與功能基因的復(fù)制與表達(dá)基因表達(dá)調(diào)控及其生物學(xué)效應(yīng)生物大分子相互作用及其所形成的細(xì)胞

2、間通訊和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)調(diào)控的分析和基因制備、改造、調(diào)控、應(yīng)用所需的技術(shù)體系6分子生物學(xué)分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)分子發(fā)育生物學(xué)分子神經(jīng)生物學(xué)分子育種學(xué)分子腫瘤學(xué)分子細(xì)胞生物學(xué)分子免疫學(xué)分子病毒學(xué)分子生理學(xué)分子考古學(xué)分子遺傳學(xué)分子數(shù)量遺傳學(xué)分子生態(tài)學(xué)分子進(jìn)化學(xué).分子生物學(xué)的延伸分子生物學(xué)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的幾乎所有領(lǐng)域分子生物學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的帶頭學(xué)科7第一節(jié) 分子生物學(xué)是從分子水平探討生命活動(dòng)的本質(zhì)一、分子生物學(xué)的歷史回顧（孕育時(shí)期）：遺傳方面：1859年，達(dá)爾文-On the origin of species 生物性狀的可遺傳性生物性狀在自然選擇壓力下可變性生物性狀在不同物種

3、之間的相關(guān)性 8開始觸及生命本質(zhì)最核心問題：生命的特征和生物性狀為什么能代代相傳？代代相傳的性狀為什么可以改變？是什么在控制生物的性狀？9Gregor Mendel(1822-1884).The Father of Genetics孟德爾的遺傳學(xué)規(guī)律最先使人們對(duì)性狀遺傳產(chǎn)生了理性認(rèn)識(shí)10Mendel-豌豆性狀遺傳雜交實(shí)驗(yàn)1865年 Gregor Mendel:遺傳學(xué)的奠基人豌豆性狀遺傳的雜交實(shí)驗(yàn) 生物體存在遺傳單位，能夠從親代傳給子代1866年 發(fā)表了“植物雜交實(shí)驗(yàn)”11細(xì)胞學(xué)方面：1879年，Walter flemming 研究細(xì)胞分裂時(shí)觀察到染色體1902年，Walter sutton 提

4、出：基因在染色體上12 for his discoveries concerning the role played by the Chromosome in heredity , demonstrated that genes are on the chromosomeThomas Hunt Morganin Physiology or Medicine 1933 Nobel Prize 1910年，Hunt morgan 證明基因存在于染色體上Nobel medal Half a pound of 23-karal gold. 2.5 inches across13果蠅雜交實(shí)驗(yàn)14化學(xué)方面

5、：1868年,F.Miescher (米歇爾-瑞士)發(fā)現(xiàn)了核素（nuclein）20世紀(jì)20-30年代,已確認(rèn)自然界有DNA和RNA兩類核酸，并闡明了核苷酸的組成。151944年，O.T.Avery 等證明了肺炎球菌轉(zhuǎn)化因子是DNA。1617人們?nèi)圆幌嘈臘NA是遺傳物質(zhì),這是由于：（1）因認(rèn)為蛋白分子量大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，二十種氨基酸的排列組合將是個(gè)天文數(shù)字，可作為一種遺傳信息。而DNA分子量小，只含4種不同的堿基，人們一度認(rèn)為不同種的有機(jī)體的核酸只有微小的差異。18（2）認(rèn)為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中DNA并未能提得很純，還附有其它物質(zhì)。（3）即使轉(zhuǎn)化因子確實(shí)是DNA，但也可能DNA只是對(duì)莢膜形成起著直接的化學(xué)效

6、應(yīng)，而不是充當(dāng)遺傳信息的載體。191952年，A.D.Hershey 和M.Chase 用35S 和32P 分別標(biāo)記 T2 噬菌體的蛋白質(zhì)和核酸，感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了核酸是遺傳物質(zhì)。2021DNA是動(dòng)物細(xì)胞的遺傳物質(zhì)當(dāng)DNA加入到某種在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真核單細(xì)胞生物群落中，核酸就會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞中去，其中有一部分就會(huì)合成出一些新的蛋白質(zhì)。導(dǎo)入DNA的表達(dá)將使細(xì)胞產(chǎn)生一些新的特性。圖. 胸腺嘧啶核苷激酶的合成22在對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的研究上1949-1952年，Wilkins 等的X-線衍射分析闡明了核酸并非平面的空間構(gòu)像，提出了DNA是螺旋結(jié)構(gòu)1948-1953年，Chargaff等用新的層析和

7、電泳技術(shù)分析組成DNA的堿基和核苷酸量，積累了大量的數(shù)據(jù)，提出了DNA堿基組成A=T、G=C的Chargaff 規(guī)則，為堿基配對(duì)的DNA結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)打下了基礎(chǔ)23克里克(19162004) 英國(guó)生物物理學(xué)家 沃森(1928) 美國(guó)生物學(xué)家1953年沃森、克里克在英國(guó)生物學(xué)家富蘭克林(女)等人研究成果的基礎(chǔ)上， 首先提出了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，于1962年獲獎(jiǎng)?，F(xiàn)代分子生物學(xué)誕生的里程碑。24DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)示意圖25核酸分子的大小常用堿基(base或kilobase)數(shù)目來表示。小的核酸片段(50bp)常被稱為寡核苷酸(oligonucleotide)。自然界中的DNA和RNA的長(zhǎng)度可以高達(dá)幾十

8、萬(wàn)個(gè)堿基。 26DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性2728二、分子生物學(xué)早期理論形成期1953，DNA雙螺旋模型建立1970年，James Watson 第二版Molecular biology of the gene標(biāo)志分子生物學(xué)開始有了較完整的理論體系。這期間的主要內(nèi)容： mRNA的發(fā)現(xiàn)、DNA聚合酶、RNA聚合酶、DNA半保復(fù)制留機(jī)制、操縱子學(xué)說、遺傳密碼的發(fā)現(xiàn)和破譯、生物遺傳的中心法則29DNA半保留復(fù)制模型30DNA-pol （109kD）1958 Kornberg 分離出DNA聚合酶I31DNA-pol (250kD)321DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄 1970年H.Temin復(fù)制遺傳信

9、息傳遞的中心法則：1958年 F.Crick331961-1969 Nirenberg 破譯遺傳密碼遺傳密碼表34三、20世紀(jì)70年代以來分子生物學(xué)飛速發(fā)展1、逆轉(zhuǎn)錄酶2、限制性內(nèi)切酶、連接酶 基因重組3、斷裂基因4、DNA測(cè)序5、核酶6、PCR發(fā)明7、增強(qiáng)子等調(diào)控序列8、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物9、基因治療10、人類基因組計(jì)劃35Kary B. Mullis1985年發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)36轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物降糖米GLP-1Ob miceGH transgenic miceDolly sheep372003年4月14日，國(guó)際人類基因組測(cè)序組隆重宣布：美、英、日、法、德和中國(guó)科

10、學(xué)家歷經(jīng)13年的共同努力，人類基因組序列圖亦稱“完成圖”，提前繪制成功。為此，參與研究國(guó)6國(guó)政府首腦發(fā)表聯(lián)合聲明表示祝賀。從現(xiàn)在起，生物學(xué)被重新劃分為前基因組和后基因組兩部分，人類正生活在后基因組時(shí)代。 3839 發(fā) 現(xiàn): a. 2.91Gbp，約39000多個(gè)基因，平均基因大小有 27kbp，1號(hào)染色體基因最豐富，而13號(hào)最少； b. 發(fā)現(xiàn)定位了26000多個(gè)功能基因，其中尚有42% 的基因尚不知道功能；在已知基因中酶占10.28%， 核酸酶占7.5%，信號(hào)傳導(dǎo)占12.2%，轉(zhuǎn)錄因子占 6.0%，受體占5.3%等;40 c. 人類“種屬”之間沒有本質(zhì)的區(qū)別； d. 存在 “熱點(diǎn)”和大片 “荒

11、漠”； e. 男性的基因突變率是女性的兩倍； f. 約有200個(gè)基因來自細(xì)菌基因； g. 基因重排更復(fù)雜41沿DNA雙軌的“淘金”熱浪勢(shì)不可擋，因?yàn)檫@是最好的致富道路之一。42 Gene = Money知識(shí)和理論的致富人類基因組的DNA序列破譯全部基因密碼：人類基因組計(jì)劃 解釋人類多樣性：基因組DNA多態(tài)性 加速對(duì)生命奧秘的闡明、重大疾病發(fā)病機(jī)理的突破物質(zhì)的致富 發(fā)現(xiàn)和設(shè)計(jì)新藥43分子生物學(xué)研究對(duì)象和主要內(nèi)容 生物學(xué)是研究生命的科學(xué)，研究生命的本質(zhì)及其各種生命現(xiàn)象和規(guī)律。 分子生物學(xué)是在分子水平認(rèn)識(shí)生命本質(zhì)，研究各種生命現(xiàn)象在分子水平的機(jī)制及其相互作用規(guī)律的科學(xué)。 主要從以下幾個(gè)方面闡述： 1

12、. 遺傳物質(zhì)和遺傳信息的傳遞 2. 基因結(jié)構(gòu)、生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能 3. 以DNA重組和分子雜交為核心的現(xiàn)代分子生物 學(xué)技術(shù) 44染色體是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，是基因的載體。Human Chromosome 1、遺傳物質(zhì)和遺傳信息的傳遞1/染色體45染色質(zhì)(chromatin)和染色體(chromosome)染色質(zhì)：細(xì)胞間期核內(nèi)伸展開的DNA-蛋白質(zhì)纖維。 DNA (deoxyribonucleic acid)，主要 核 酸 RNA (ribonucleic acid)，少量 組蛋白（H1、H2A、H2B、H3、H4） 蛋白質(zhì) 非組蛋白 染色質(zhì)染色體 （分裂間期） （分裂期） 螺旋化 46染色質(zhì)和

13、染色體是同一遺傳物質(zhì)在細(xì)胞間期和分裂期的兩種不同形態(tài)。47串珠狀染色質(zhì)48遺傳信息的傳遞遺傳物質(zhì)是DNA，遺傳單位是基因，遺傳信息貯存于DNA中,通過半保留和半不連續(xù)復(fù)制傳遞到子代細(xì)胞中。分子生物學(xué)核心是研究遺傳信息及其傳遞49 磷酸 脫氧核糖 堿基 脫氧核糖核苷 脫氧核糖核苷酸(1) DNA結(jié)構(gòu)DNA的基本結(jié)構(gòu)單位單脫氧核糖核苷酸50堿基種類胸腺嘧啶Thymine，T胞嘧啶Cytosine，C鳥嘌呤Guanine，G腺嘌呤Adenine，A51堿基互補(bǔ)配對(duì)：A=T, GC52穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力為氫鍵和堿基堆積力（即疏水作用）53DNA結(jié)構(gòu)特征 DNA為兩條多核苷酸鏈相互逆向纏繞的雙螺旋結(jié)

14、構(gòu)。方向性54(2)DNA復(fù)制/遺傳信息傳遞 通過DNA復(fù)制,將親代遺傳信息傳給子細(xì)胞/子代，DNA復(fù)制方向53, 半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制, 遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則.55DNA結(jié)構(gòu)的基本特征 AT、C G互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。 堿基的排列順序就是DNA序列儲(chǔ)存遺傳密碼。 雙螺旋互補(bǔ)結(jié)構(gòu)是DNA復(fù)制和修復(fù)的基礎(chǔ)。 雙螺旋的溝，尤其是大溝為蛋白質(zhì)分子結(jié)合的場(chǎng)所。 雙螺旋的互補(bǔ)性是分子識(shí)別的原理之一，也是現(xiàn)代 分子技術(shù)核心技術(shù)分子雜交的基礎(chǔ)。(3)DNA結(jié)構(gòu)的基本特征和生物學(xué)意義56DNA具有重要的生物學(xué)意義 它是遺傳信息的載體，貯存并傳遞支配生命活動(dòng)的 指令。 它是構(gòu)建生物體的藍(lán)圖。 它是人為操作、研究生

15、命和改造生命特征的元件。 它是生命科學(xué)技術(shù)遵循的原則。572.基因表達(dá)和調(diào)控- 遺傳信息的表達(dá)理解生命大分子運(yùn)動(dòng)的基本規(guī)律中心法則 破解遺傳密碼及DNA序列 弄清基因如何轉(zhuǎn)錄和翻譯及信息傳遞過 程中如何調(diào)控的？581/中心法則 （central dogma）1958年Crick提出，1970年Baltimore和Ternin等修正并補(bǔ)充。592.基因表達(dá)（1）基因的概念 是DNA序列中的一個(gè)功能片段。（2）基因的結(jié)構(gòu) 原核生物的基因是DNA分子的一個(gè)片段，且轉(zhuǎn)錄部分連續(xù)編碼。 真核生物包括人類的基因不同于原核生物的基因。 真核生物的結(jié)構(gòu)基因的DNA序列（轉(zhuǎn)錄部分）由編碼序列和非編碼序列兩部分組

16、成，編碼序列是不連續(xù)的，被非編碼序列分割開來，稱為斷裂基因（split gene）。60基因的結(jié)構(gòu)和生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能基因的物質(zhì)基礎(chǔ)是核酸基因編碼的終產(chǎn)物是蛋白質(zhì)61Exon 和 Intron： Exon -編碼序列，Intron-非編碼序列。GT-AG法則 ：5-GT-AG-3，是真核生物基因內(nèi)含子剪切和外顯子拼接信號(hào)，高度保守的共有序列。旁側(cè)（Flanking sequence，側(cè)翼序列）：每個(gè)結(jié)構(gòu)基因在第一個(gè)和最后一個(gè)外顯子的外側(cè)有一段不被轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)- Flanking sequence。62旁側(cè)包括：?jiǎn)?dòng)子（promoter）： TATA BOX：位于-19-27 bp，7個(gè)堿

17、基組成， TATAT(A)AT(A)，TFII結(jié)合位點(diǎn)，再與RNA聚合酶II形成復(fù)合物，準(zhǔn)確識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，具定量效應(yīng)。 CAAT BOX：位于-70-80 bp，9個(gè)堿基組成， GGC(T)CAATCT，轉(zhuǎn)錄因子CTF的識(shí)別位點(diǎn)，與之結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。 63GC BOX：位于CAAT BOX兩側(cè)，6個(gè)堿基組成，GGCGGG，轉(zhuǎn)錄因子SP1識(shí)別位點(diǎn)，激活轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率。增強(qiáng)子（enhancer）：位于啟動(dòng)子上游/下游的一段DNA序列，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率，作用方向可以是5-3方向，或3-5。microRNAmiRNA:內(nèi)源性、大小在 20-25nt 一類非編碼 RNA 64終止子（terminato

18、r）：由一段回文序列以及特定的序列5-AATAAA-3Poly A 組成，是RNA聚合酶停止工作的信號(hào)。 回文序列為轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) polyA（AATAAA）是多聚腺苷酸添加信號(hào)65順式作用元件 (cis-acting element) 是同一DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列。 啟動(dòng)子 增強(qiáng)子 終止子 沉默子：某些基因含有的一種負(fù)性調(diào)節(jié)元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時(shí)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。 與啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，稱為反式作用因子/元件。順式作用元件與反式作用因子66 3/ 基因表達(dá)（gene expression）是遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA再經(jīng)翻譯生成蛋白質(zhì)的過程。67基因表達(dá)6

19、8轉(zhuǎn) 錄69RNA剪接RNA加工過程70加 帽RNA加工過程71加 尾RNA加工過程72反密碼子tRNA運(yùn)輸73密碼子 三聯(lián)體密碼子 共有64個(gè)密碼子 UAA UGA 為終止密碼子 UAG AUG 為起始密碼子通用性、兼并性74遺傳密碼和遺傳密碼子的發(fā)現(xiàn)和確立，建立起了DNA-蛋白之間的橋梁。遺傳信息儲(chǔ)存在DNA的堿基排列順序中，每3個(gè)堿基組成一個(gè)三聯(lián)體-遺傳密碼，一個(gè)密碼子編碼一個(gè)氨基酸。mRNA中的三聯(lián)體密碼子的排列順序決定多肽鏈的氨基酸的排列順序。75翻譯76 遺傳物質(zhì)是DNA固然重要，但蛋白質(zhì)也具有同等重要的地位。因?yàn)镈NA復(fù)制及發(fā)布合成蛋白質(zhì)的指令必須要有執(zhí)行工作的酶（蛋白質(zhì)）的存在

20、，也就是說是DNA復(fù)制酶使DNA完成自身復(fù)制，也是酶使DNA 發(fā)布合成蛋白質(zhì)的指令。所以，對(duì)于生命至少是地球上的生命DNA與蛋白質(zhì)具有同等重要的地位。77 3. 以DNA重組和分子雜交為核心的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)重組DNA技術(shù)是分子生物學(xué)技術(shù)的核心技術(shù)，也是遺傳工程的核心技術(shù)，是人類在基因和DNA水平進(jìn)行操作的技術(shù)。 DNA克隆重組DNA技術(shù) 核酸分子雜交781）DNA克隆克?。╟lone）：應(yīng)用無(wú)性繁殖的方法復(fù)制一個(gè)分子、細(xì)胞、個(gè)體的過程。DNA克隆利用重組DNA技術(shù)利用PCR技術(shù)79DNA克隆: 將目的基因/DNA與基因運(yùn)載體重組，在宿主細(xì)胞中表達(dá)/擴(kuò)增得到大量相同DNA片段的過程?；具^程

21、：重組DNA分子的構(gòu)建：目的基因+載體轉(zhuǎn)化：將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞細(xì)胞克隆的選擇增殖-細(xì)胞克隆分離重組DNA分子DNA克隆-利用重組DNA技術(shù)80DNA克隆用途：大量相同拷貝DNA；DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)；基因功能研究；生產(chǎn)蛋白質(zhì)81DNA克隆-利用PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）概念：模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，體外程序化地 特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。步驟：變性復(fù)性延伸82聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）1. 構(gòu)建兩個(gè)寡核苷酸引物（1330nt）以進(jìn)行目的DNA選

22、擇擴(kuò)增，故需了解其序列信息。2. 具有4種DNA前身物：dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP3. 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)： DNA變性（9395） 復(fù)性（5070） 延伸（7075）4. 一定條件：溫度、耐熱酶（Taq酶）、Mg2+、緩沖液5. 三段反復(fù)循環(huán)，一般3040周期，DNA擴(kuò)增2n倍83PCR擴(kuò)增應(yīng)用：生命科學(xué) 疾病診斷 法醫(yī)學(xué) 考古學(xué)等8485PCR衍生技術(shù)RT-PCR: 檢測(cè)mRNA大小及含量PCR-DGGE：檢測(cè)基因點(diǎn)突變PCR-SSCP：檢測(cè)基因點(diǎn)突變Multiplex-PCR：檢測(cè)一個(gè)基因多個(gè)片段的缺失Nest-PCR：檢測(cè)表達(dá)量低的基因表達(dá)水平862）雜交核酸-核酸：South

23、ern Blot、Northern Blot 、 cDNA芯片、Dot hybridization蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)：Western Blot、免疫沉淀、蛋白質(zhì)芯片 核酸-蛋白質(zhì)：ChIP、EMSA87是標(biāo)記的探針（DNA/RNA）與DNA/RNA雜交過程。遵循的基本原則：堿基互補(bǔ)配對(duì) Southern Blot 印跡雜交 Northern Blot 印跡雜交 cDNA芯片 Dot hybridization（1）核酸分子雜交：核酸-核酸雜交88是指DNA-DNA雜交,以標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)靶DNA,應(yīng)用于DNA分子的檢測(cè)、分析。Southern Blot 印跡雜交核酸-核酸雜交應(yīng)用：(1) 基因組結(jié)構(gòu)分析：如缺失、插入、 倒位等的檢測(cè) (2)RFLP連鎖分析89Southern印跡雜交核酸-核酸雜交90Northern印跡雜交 是指DNA(或RNA)-RNA分子雜交，以標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)靶RNA，應(yīng)用于