2015主管臨床醫(yī)學(xué)檢驗免疫學(xué)和免疫講義

1、第十章 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)第一節(jié) 概述發(fā)光免疫分析是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。這種方法兼有發(fā)光分析的高靈敏性和抗原抗體反應(yīng)的高特異性。發(fā)光是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并光子的過程。光照發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光。一、化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)（發(fā)光劑）在化學(xué)反應(yīng)時，吸收了反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。化學(xué)發(fā)

2、光與熒光的區(qū)別是形成激發(fā)態(tài)分子韻激發(fā)能不同。熒光是吸收了光能使分子激發(fā)而發(fā)射的光；而化學(xué)發(fā)光是吸收了化學(xué)能使分子激發(fā)而發(fā)射的光。因此，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的首要條件是反應(yīng)必須提供足夠的化學(xué)能。通常只有那些反應(yīng)速度相當(dāng)快的放能反應(yīng)，才能在可見光范圍內(nèi)觀察到化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，而氧化-還原反應(yīng)所提供的能量介于其中，因此大多數(shù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為氧化-還原反應(yīng)。第二個條件是吸收了化學(xué)能而處于激發(fā)態(tài)的分子或原子，必須能出光子或者能將能量轉(zhuǎn)移到另一個物質(zhì)的分子上并使其激發(fā)，當(dāng)這種激發(fā)分子回到基態(tài)時一些化學(xué)反應(yīng)能出光子。足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過程稱為直接

3、化學(xué)發(fā)光。二、化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率又稱化學(xué)發(fā)光反應(yīng)量子產(chǎn)率?；瘜W(xué)發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率?；瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個發(fā)光反應(yīng)都具有其特征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。因此，可設(shè)計出不同的反應(yīng)模式。第二節(jié) 化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)一、化學(xué)發(fā)光劑在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式能量的化合物。能作為化學(xué)發(fā)光劑的有機化合物必須具備下列條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理、化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的物質(zhì)相匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)

4、的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒（一）直接化學(xué)發(fā)光劑性。在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用。包括吖啶酯和三聯(lián)吡啶釕。（二）酶促反應(yīng)發(fā)光劑利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光。目前化學(xué)發(fā)光酶免疫分析中常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶。辣根過氧化物酶催化的發(fā)光劑為堿性磷酸酶催化的發(fā)光底物為 AMPPD。及其衍生物。二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)發(fā)光劑的標(biāo)記是通過化學(xué)反應(yīng)將發(fā)光劑連接到抗體或抗原上。標(biāo)記反應(yīng)分為“直接偶聯(lián)”和“間接偶聯(lián)”兩種方式。（一）常用標(biāo)記方法碳二亞胺縮合法過碘酸鈉氧化法重氮鹽偶聯(lián)法4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法（二）影響標(biāo)記的發(fā)光劑的選擇被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)標(biāo)

5、記方法的選擇原料比標(biāo)記率溫度純化與保存第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析直接化學(xué)發(fā)光免疫分析是用化學(xué)發(fā)光劑（如吖啶酯）直接標(biāo)記抗體（抗原），與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相抗體-待測抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和糾正液（NaOH）使呈堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光，由集光器和光電倍增管接收，時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出待測抗原的含量。二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）是用參與催化某一化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶

6、（ALP）來標(biāo)記抗體（或抗原），與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相抗體一待測抗原一酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光。由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯螅侔阉鼈儌魉椭劣嬎銠C數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA）與一般化學(xué)發(fā)光分析不同，是以電化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，它包括電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光兩個過程。在電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中，磁性微粒為固相載體抗體（抗原），用三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體（抗原），在反應(yīng)體系內(nèi)待測標(biāo)本與相應(yīng)的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)，形成磁性微?？贵w-待測抗原-三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時將上述復(fù)合物吸入室，同時引入 TPA 緩沖液。當(dāng)磁性微粒流經(jīng)電極表面時，被安裝在電極下面的電磁鐵吸引住，而未結(jié)合的標(biāo)記抗體和標(biāo)本被緩沖液沖走。與此同時電極加壓，啟動電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使三聯(lián)吡啶釕和 TPA 在電極表面進行電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光。光信號由安裝在室上方的光信號檢測器檢測，光的強度與待測抗原的濃度