SDSPAGE各成分作用

1、SDSPAGE電泳的原理及濃縮膠濃縮樣品的原理（甘氨酸的作用）SDS（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）是目前最常用的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。下面就SDS的基本原理做簡單介紹。SDSPAGE電泳的基本原理？SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS,SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結(jié)合大量的SDS,使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白

2、質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX,式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。SDS電泳成功的關(guān)鍵是什么？溶液中SDS單體的濃度SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存在，能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。為了保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，

3、它們的重量比應(yīng)該為1：4或1：3。樣品緩沖液的離子強度因為SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)上的量僅僅取決于平衡時SDS單體的濃度，不是總濃度，而只有在低離子強度的溶液中，SDS單體才具有較高的平衡濃度。所以，SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，常為10-100mM。二硫鍵是否完全被還原只有二硫鍵被完全還原以后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上從而給出相對遷移率和分子質(zhì)量對數(shù)的線性關(guān)系。Samplebuffer中的0-巰基乙醇的濃度常為4-5%,二硫蘇糖醇的濃度常為2-3%。前者有揮發(fā)性，最好使用前加入。SDS緩沖液系統(tǒng)的選擇，Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼

4、酸鹽或者其他？一般來說，在被分析的蛋白質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍，凡是不與SDS發(fā)生相互作用的緩沖液都可以使用，但緩沖液的選擇對蛋白帶的分離和電泳的速度是非常關(guān)鍵的。Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。如果要測定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，對于分子質(zhì)量小于15kDa的蛋白樣品，可以使用SDS-尿素系統(tǒng),也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。積層膠（或稱濃縮膠）的作用原理？在緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸，在pH6.7時很少解離，其有效泳動速率很低，而氯離子卻有很高的泳動速率，蛋白質(zhì)的泳動速率介于兩者之間。加上電壓以后，作為先導離子的氯離子和尾隨離子的甘氨酸離子分離開來，

5、并在其后面留下一個導電性較低的區(qū)帶。由于導電性和電場強度成反比，這一區(qū)帶便獲得較高的電壓梯度，加速甘氨酸離子的泳動，使其趕上氯離子，建立起甘氨酸和氯離子的電壓梯度和泳動速率乘積相等的穩(wěn)定態(tài)（我不太明白這句話），使這些帶電顆粒以相同的速度泳動，兩種離子之間有明顯的邊界。當甘氨酸、氯離子界面通過樣品進入濃縮膠時，在移動界面前有一低電壓梯度，界面后有一高電壓梯度。由于在移動界面前的蛋白質(zhì)分子泳動速率比氯離子低，因此氯離子能迅速越過。移動界面后的蛋白質(zhì)處于較高的電壓梯度中，其泳動速率比甘氨酸快。因此，移動的界面將蛋白質(zhì)分子堆積到一起，形成一條狹窄的區(qū)帶。蛋白質(zhì)在移動界面中的濃度作用僅取決于樣品和濃縮膠

6、中Tris-HCl的濃度（為什么？），而與樣品中蛋白質(zhì)的最初濃度無關(guān)。由于濃縮膠為大孔凝膠，故對蛋白樣品沒有分子篩作用。當移動的界面到達濃縮膠和分離膠的界面時，凝膠的pH明顯增加，導致甘氨酸大量解離。此時，甘氨酸的有效泳動速率明顯增加，超越蛋白分子，直接在氯離子后移動。由于凝膠孔徑變小，蛋白質(zhì)分子的遷移速率降低，落在后面的蛋白質(zhì)便在均一的電壓梯度和pH環(huán)境中泳動，并根據(jù)其固有的電荷與分子大小進行分離。可見，甘氨酸并非作為緩沖成分參與，而是作為尾隨離子來參與電泳過程。以上內(nèi)容主要摘自蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)第二版（郭堯君編著）。需要進一步了解相關(guān)內(nèi)容的同學可以查閱該書。SDS電泳小問答Q：SDS電泳的

7、基本原理？A：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質(zhì)復合物，這種復合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率

8、和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX,式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。Q：配膠緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響？A：在SDS不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠是pH6.7，分離膠pH8.9；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)。在濃縮膠中，其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場的作用下，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動。由于導

9、電性與電場強度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓剃度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當樣品進入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時由于分離膠孔徑的縮小，在電場的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進行分離。所以，pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應(yīng)首要考慮該因素。Q：樣品如何處理？A：根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。1、還原SDS處理：在還原劑中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后

10、，蛋白質(zhì)構(gòu)象被解離，電荷被中和，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子，在電泳中，只根據(jù)分子量來分離。一般電泳均按這種方式處理，樣品稀釋適當濃度，加入上樣Buffer，離心，沸水煮5min,再離心加樣。2、帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并經(jīng)久牢固的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止銀染時的紋理現(xiàn)象。100ul樣品緩沖液中10ul20%的碘乙酸胺，并在室溫保溫30min。3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。Q：SDS電泳凝膠中各主要成

11、分的作用？A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7,分離膠選擇pH8.9,選擇trisHCL系統(tǒng)，具體作用后面介紹；TEMED與AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。Q：提高SDS電泳分辨率的途徑？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS

12、結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考馬斯亮藍、銀染色三種染料，不同染料又各自不同的染色方法，具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊P82-103。Q：“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？A：主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。Q：“皺眉”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？A：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。Q：為什么帶出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象？A：主要是樣品融解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。處理辦法：加樣前離心

13、；選擇適當?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。Q：為什么帶出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？A：主要是樣品不溶性顆粒引起的。處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。Q：什么是“鬼帶”，如何處理？A：“鬼帶”就是在跑大分子構(gòu)象復雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標條帶大，有時不能進入分離膠。但它卻于目標條帶有相同的免疫學活性，在WB反應(yīng)中可見其能與目標條帶對應(yīng)的抗體作用。處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。Q：為什么溴酚藍不能起到指示作用？A：我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。Q：為什么電泳的條帶很粗？A：電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.7）；適當降低電壓；Q：為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？A：這種現(xiàn)象一般初學者易出現(xiàn)。比如電