食品安全快速檢測(cè)技術(shù)7-分子雜交技術(shù)

1、分子雜交技術(shù)一、分子雜交種類二、分子雜交的一般程序三、雜交樣品膜的制備 四、標(biāo)記探針的制備五、分子雜交與結(jié)果檢測(cè)六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化整理ppt整理ppt分子雜交技術(shù)分子生物學(xué)中用于檢測(cè)生物樣本中是否含有特定的生物分子的一門技術(shù)。樣 品 制 備電 泳雜 交轉(zhuǎn) 膜結(jié)果顯示探 針 制 備分 子 雜 交 流 程 圖整理ppt核酸分子雜交整理ppt一. 分子雜交種類 1. 按其分子種類劃分 1） DNA雜交探針為DNA或RNA 2） RNA雜交探針為DNA或cDNA 3） 蛋白質(zhì)免疫分析探針為抗體整理ppt2. 按樣品制備過程劃分 1） 原位雜交(in situ hybridization)

2、i. 原位菌落雜交 ii. 原位噬菌斑雜交 iii. 原位細(xì)胞雜交 iv. 原位組織塊雜交 原位裂解細(xì)胞，不需要分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)樣品，可同時(shí)處理大量樣品，常用于目的基因的篩選或檢測(cè)某類細(xì)胞或組織中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白質(zhì)序列。一. 分子雜交種類 整理ppt3）印跡轉(zhuǎn)移雜交(blotting hybridization) 先純化樣品，然后使不同大小的分子在凝膠上分離，轉(zhuǎn)移到固體基質(zhì)上，與探針雜交。該法可檢測(cè)出感興趣分子的分子量。用于轉(zhuǎn)移的方法有： i. 擴(kuò)散法 ii. 毛細(xì)管法 iii. 電泳轉(zhuǎn)移法 iv. 真空轉(zhuǎn)移法。 根據(jù)轉(zhuǎn)移對(duì)象的不同分為Southern印記法（D

3、NA）、Northern印跡法（RNA）和Western 印跡法（蛋白質(zhì)）。一. 分子雜交種類 2）斑點(diǎn)雜交(dot hybridization) 先分離DNA，RNA或蛋白質(zhì)，然后將樣品液直接點(diǎn)在固體基質(zhì)上進(jìn)行雜交，放射自顯影后，判斷是否有雜交及其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測(cè)，半定量分析。整理ppt 它利用兩種探針與待測(cè)DNA結(jié)合，先將不帶標(biāo)記的探針固定在基質(zhì)上，然后用待測(cè)樣品與之雜交，洗去非特異性結(jié)合后，再與第二種帶標(biāo)記的探針雜交。這種方法可用于粗制DNA樣品，可檢測(cè)出0.2ng的DNA樣品 4) 夾心雜交法(sandwich hybridization)一. 分子雜交種類

4、 整理ppt1) DNA和RNA的雜交 制備DNA或RNA樣品與固定基質(zhì)結(jié)合80真空固定預(yù)雜交加入標(biāo)記探針雜交洗滌放射自顯影或顯色反應(yīng)。 2）蛋白質(zhì)的免疫分析 制備蛋白質(zhì)樣品與固定基質(zhì)結(jié)合常溫空氣中固定封閉劑封閉 一抗反應(yīng)洗滌二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)洗滌顯色反應(yīng)（EIA） 或 一抗放射標(biāo)記物洗滌放射自顯影（RIA）二、 分子雜交的一般程序整理ppt1. 固定基質(zhì)的種類與特性 1）硝酸纖維素濾膜(Nitrocellulose filter, NCF) 可與三類大分子的結(jié)合，其機(jī)理不清楚，可能為被動(dòng)吸附。 NCF不能結(jié) 合小分子DNA，RNA和蛋白質(zhì)（20,000）優(yōu)點(diǎn)：i. 用于DNA，RNA雜交分析

5、時(shí)結(jié)果可靠，靈敏，本底低。 ii. 用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，容量大（80g/cm2)；可直接染色；分辨率高； 不需要預(yù)激活；易于操作 缺點(diǎn)： 結(jié)合低分子蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，反復(fù)使用探針次數(shù)有限（2-3次） 2）重氮化紙：DBM紙與DPT纖維素紙最大特點(diǎn)是能結(jié)合小分子的DNA，RNA和蛋白質(zhì)，共價(jià)結(jié)合，可用不同 探針進(jìn)行多次雜交分析。該類基質(zhì)結(jié)合生物大分子的能力差，需要激活，分析蛋白質(zhì)時(shí)最好用放射性標(biāo)記物。這類基質(zhì)對(duì)生物大分子是主動(dòng)吸附。 三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt 3) 尼龍膜 i. 陽(yáng)離子尼龍膜 i) 容量大, 蛋白質(zhì)可結(jié)合480g/cm2 ii) 可結(jié)合不同大小的DNA，RNA和蛋白質(zhì)。 ii

6、i) 韌性好 iv) 可用于電轉(zhuǎn)移 v) 可進(jìn)行反復(fù)多次雜交試驗(yàn) vi) 廣泛的化學(xué)耐受性和可高溫消毒 *不能用于蛋白質(zhì)的直接染色。 ii. 尼龍66 廣泛用于核酸印跡分析，靜電荷可從pH4時(shí)陽(yáng)離子狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7時(shí)陰離子狀態(tài)，電轉(zhuǎn)移時(shí)要注意。 4）離子膜 i. DEAE-纖維素紙 ii. CM-纖維素紙三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt2. 固定基質(zhì)的選擇依據(jù) 1）強(qiáng)度，耐久性，操作簡(jiǎn)便 2）高信噪比（低本底高信號(hào)） 3）生物大分子的結(jié)合容量和穩(wěn)定性 4）重現(xiàn)性好三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt3. 各種雜交樣品膜的制備 1）原位雜交樣品膜的制備 i. 原位菌落雜交樣品膜(1) 在含有選擇

7、性抗生素的瓊脂平板上放一張硝酸纖維素濾膜。 (2) 用無菌牙簽將各個(gè)菌落先轉(zhuǎn)移至濾膜上,再轉(zhuǎn)移至含有選擇性抗生素但未放濾膜的瓊脂主平板上。應(yīng)按一定的格子進(jìn)行劃線接種(或打點(diǎn))。每菌落應(yīng)分別劃線于兩個(gè)平板的相同位置上。最后，在濾膜和主平板上同時(shí)劃一個(gè)含有非重組質(zhì)粒（如pBR322)的菌落。 (3) 倒置平板,于37培養(yǎng)至劃線的細(xì)菌菌落生長(zhǎng)到0.5-1.0mm的寬度。 (4) 用已裝防水黑色繪圖墨水的注射器針頭穿透濾膜直至瓊脂,在3個(gè)以上的不對(duì)稱位置作標(biāo)記。在主平板大致相同的位置上也作上標(biāo)記。 (5) 用Parafilm膜封好主平板,倒置貯放于4,直至獲得雜交反應(yīng)的結(jié)果。 (6) 裂解細(xì)菌,按下述

8、方法,使釋放的DNA結(jié)合于硝酸纖維素濾膜。 整理ppt i) 細(xì)胞培養(yǎng)（高密度，幾百十萬個(gè)菌落或低密度，幾百個(gè)以下） ii) 細(xì)菌細(xì)胞原位裂解與DNA變性 ii. 原位噬菌斑雜交樣品膜 i) 細(xì)胞感染和噬菌斑形成（10,000-20,000/平板） ii) 噬菌體轉(zhuǎn)移用NCF作影印 iii) DNA變性與固定（與上同）三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt 2） 斑點(diǎn)雜交樣品膜的制備 制備樣品點(diǎn)樣固定（可用斑點(diǎn)雜交儀或直接點(diǎn)樣）三、 雜交樣品膜的制備 整理ppt3）轉(zhuǎn)移雜交樣品膜的制備 i. 擴(kuò)散法（Difusion blotting method ) 簡(jiǎn)單但不能定量轉(zhuǎn)移，與電轉(zhuǎn)比較只能轉(zhuǎn)移25-

9、50%的蛋白質(zhì)。整理ppt ii. 毛細(xì)管法 (Capillary blotting method )毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法借助吸水紙吸收轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)所產(chǎn)生的牽引力量將DNA或RNA自膠體轉(zhuǎn)移至膜上。要轉(zhuǎn)印完全，起碼需要作用6 h以上。 雖然所需花費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)，以其不須要特別的儀器設(shè)備，毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法目前仍被普遍采用。 Southern、Northern印跡整理pptiii. 電轉(zhuǎn)移法 (electro blotting ) ：半干法和濕法電轉(zhuǎn)。iv. 真空轉(zhuǎn)移法 (Vaccum bllotting ) 轉(zhuǎn)移速度與凝膠的厚度成反比，在相同轉(zhuǎn)移率（50%）時(shí)，真空法比毛細(xì)管法快13倍，其損失僅6%，而毛細(xì)

10、管法損失率20%。整理ppt v. 各種轉(zhuǎn)移方法的比較 i) 擴(kuò)散法和毛細(xì)管法：操作簡(jiǎn)便，不需要特殊轉(zhuǎn)移儀器，但轉(zhuǎn)移效率低,（擴(kuò)散法為70%，毛細(xì)管法80%）耗時(shí)多。 ii) 電轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)少，需特殊轉(zhuǎn)移儀，對(duì)轉(zhuǎn)移條件要求較嚴(yán)。 iii) 真空轉(zhuǎn)移法：效率高，耗時(shí)最少，需特殊真空轉(zhuǎn)移儀。vi. 轉(zhuǎn)移的最佳條件 i) 固定基質(zhì)的選擇 ii) 轉(zhuǎn)移前預(yù)處理：DNA和RNA分子變性，蛋白質(zhì)則需除去凝膠中的SDS。 iii)大分子的轉(zhuǎn)移對(duì)于分子量較大的DNA片段，必須進(jìn)行原位斷裂后再進(jìn)行轉(zhuǎn)移，斷裂DNA分子最佳長(zhǎng)度為1-2kb。 其步驟是： 0.25M HCl處理凝膠兩次（每次15分鐘）水洗0

11、.5M NaOH/1M NaCl兩次，每次15分鐘轉(zhuǎn)移。 對(duì)于大分子蛋白質(zhì)，可采用下述三種方法之一： 解偶聯(lián)劑使凝膠解聚；蛋白酶作用；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入SDS。整理ppt四. 標(biāo)記探針的制備 1. 標(biāo)記化合物的種類 1）放射性同位素標(biāo)記物125I，3H，14C用于蛋白質(zhì)標(biāo)記；32P，3H，35S用于核酸標(biāo)記，其中32P和35S使用頻率高。32P標(biāo)記核苷酸的位或位，35S則是標(biāo)記核苷酸的位.整理ppt 2) 非放射性標(biāo)記物 i. 生物素 分離自蛋黃的水溶性維生素，它可以和分離自蛋清中的一種堿性蛋白抗生物素蛋白牢固地結(jié)合。每個(gè)抗生物素蛋白可結(jié)合4個(gè)生物素分子。此外，鏈霉菌抗生蛋白與生物素結(jié)合更牢固，

12、可大大提高其靈敏度。 生物素可以經(jīng)過化學(xué)法與不同的化合物結(jié)合形成標(biāo)記化合物。 ii. 半抗原 包括汞，2-乙酰胺二苯丙茂，地高辛配體和金屬銪。 地高辛配體是一種脂質(zhì)半抗原，可將其連在dUTP（脫氧尿三磷酸）上，然后用酶將其摻入新合成鏈中。檢測(cè)上述標(biāo)記物的方法是利用二抗-酶偶聯(lián)物反應(yīng)和顯色反應(yīng)。整理ppt iii. 蛋白質(zhì)檢測(cè)標(biāo)記物 i) 酶偶聯(lián)二抗（0.05ng） ii) 蛋白質(zhì)A（來自金黃色葡萄球菌）?？勺饔糜诖蠖鄶?shù)哺乳動(dòng)物的IgG（免疫球蛋白），靈敏度較低（5ng） iii) 免疫金（immunogold） 0.1-0.5ng3) 兩類標(biāo)記化合物的比較 i. 靈敏度 i ) 檢測(cè)蛋白質(zhì)，兩

13、種方法差不多。 ii) 檢測(cè)核酸，放射法比酶法敏感。 ii. 穩(wěn)定性 酶法探針可在4保存一年，放射性標(biāo)記需每次制備。 iii. 安全性 非放射性標(biāo)記安全。 iv. 效率 非放射性標(biāo)記所需時(shí)間短。整理ppt2. 標(biāo)記探針的制備方法 1）鏈標(biāo)記法 2) 末端標(biāo)記 3) 標(biāo)記化合物的純化 整理ppt1）鏈標(biāo)記法 i. 切口移位法 ds-DNA+DNase I+DNApol I+dNTP(32P-dCTP) ii. 隨機(jī)DNA引物延伸法 ds-DNAss-DNA-(6n,t)Klenow片段+dNTP(32P) iii. 反轉(zhuǎn)錄法 mRNA+dNTP(32P) cDNA（標(biāo)記） iv. 轉(zhuǎn)錄法 含有待

14、標(biāo)記DNA片段的重組質(zhì)粒+NTP(32P)RNA（標(biāo)記） SP6聚合酶 v. 引物延伸法 含待標(biāo)記DNA的單鏈DNA分子(M13mp系列)+引物(15-17n.t)+dNTP(32P)待標(biāo)記DNA鏈 vi. T4 DNA聚合酶法 ds-DNAT4 DNA聚合酶, 無dNTP3-5外切酶活性加入dNTP和標(biāo)記核苷酸新合成鏈（32P）整理ppt2) 末端標(biāo)記 i. 5-末端標(biāo)記 ss-和ds-DNA, RNA脫磷酸化反應(yīng) (CIP) T4DNA連接酶(-32P )ATP ii. 3-末端標(biāo)記 i) TdT加尾反應(yīng)，用于dsDNAii) 補(bǔ)齊反應(yīng) iii) T4 RNA連接酶反應(yīng) RNA-OH+*p

15、Np（3-5-二磷酸核苷）+ATPRNA-*pNPp+pA+ppi 3) 標(biāo)記化合物的純化 i. 柱層析 利用Sephadex G-50，前峰-標(biāo)記物，后峰-核苷酸 ii. 旋轉(zhuǎn)柱層析 快速，簡(jiǎn)便, 可同時(shí)純化多個(gè)樣品。下一節(jié)整理ppt雙鏈DNA標(biāo)記法一切口移位法 （Nick Translation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口處按5 3方向切除單核苷酸；在切除的同時(shí)DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口處3端鏈接底物中的單核苷酸，彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，缺口平移，并且底物中被標(biāo)記的單核苷酸被隨機(jī)

16、摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行，探針即被標(biāo)記。 Nick Translation返回整理ppt雙鏈DNA標(biāo)記法二隨機(jī)引物法（6核苷酸引物標(biāo)記法） 原理及過程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5 3聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下，以引物3端為起點(diǎn)，沿模板3 5方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中，探針即被標(biāo)記。返回整理ppt 1. 核酸雜交步驟與結(jié)果檢測(cè) 1）預(yù)雜交： 預(yù)雜交液中常加入鮭魚精DNA，若標(biāo)記探針是cDNA或RNA，

17、預(yù)雜交液中還需加入多聚A以阻止特異性結(jié)合, 42 4-6h或過夜。 2）雜交：探針100變性，迅速冷卻，加入預(yù)雜交液中，42一天五. 分子雜交與結(jié)果檢測(cè)3）洗滌：2SSC+0.1%SDS常溫洗滌兩次，1SSC+0.1%SDS 65洗滌兩次，每次15分鐘。若使用低聚核苷酸探針，洗滌溫度按下式計(jì)算： T=4GC+2AT * 高強(qiáng)度與低強(qiáng)度雜交：若具高度特異性同源序列，采用高強(qiáng)度雜交條件；若使低同源性DNA之間雜交，則采用低強(qiáng)度雜交條件。這兩種條件之差異表現(xiàn)在雜交液和洗滌液的離子強(qiáng)度以及雜交和洗滌時(shí)的溫度。整理ppt4）放射自顯影或顯色反應(yīng) 使用放射性同位素標(biāo)記物，采用放射自顯影。若采用非放射性同位

18、素標(biāo)記物，則采用顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)將依據(jù)偶聯(lián)的酶類而定。主要有兩種酶： i. 辣根過氧化物酶: 可將3，3-二氨基苯胺氧化成褐色沉淀或?qū)?-氯萘酚氧化成紫色沉淀物。 ii. 堿性磷酸酶的作用底物是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，在酶作用下，該化合物可轉(zhuǎn)變?yōu)樘m色沉淀物，該反應(yīng)中釋放的氫離子可將硝基蘭四唑還原成深紫色沉淀，這些沉淀物都是沉積在酶的作用位點(diǎn)。 iii. 兩種酶偶聯(lián)物的比較 i) 堿性磷酸酶的靈敏度比辣根過氧化物酶高10倍左右，但噪聲大。 ii) 堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)可持續(xù)幾個(gè)小時(shí)，其顯色結(jié)果可長(zhǎng)期保存，但辣根過氧化物酶的顯色反應(yīng)僅能持續(xù)30分鐘。 5) 雜交結(jié)果整理ppt2. 蛋白質(zhì)的

19、免疫分析 封閉劑，明膠，牛血清蛋白，卵清蛋白等。雜交結(jié)果示意圖整理ppt六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化探針的選擇 在大多數(shù)情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針 在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針或RNA探針 長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體，但不適宜于組織原位雜交 整理ppt探針的標(biāo)記方法 選擇什么標(biāo)記方法主要視個(gè)人的習(xí)慣和可利用條件而定； 但還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求，如靈敏度和顯示方法等 一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高 在對(duì)靈敏要求不高時(shí)，可采用保存時(shí)間長(zhǎng)的生物素探針技術(shù)和比較穩(wěn)定的堿性磷酸酶顯示系統(tǒng) 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)

20、化整理ppt探針的濃度總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放射性標(biāo)記探針的用量分別為510ng/ml和251000ng/ml，而原位雜交中，無論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.55.0g/ml 受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響 六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化整理ppt雜交率 現(xiàn)代雜交實(shí)驗(yàn)無論在液相雜交還是固相雜交均在探針過剩的條件下進(jìn)行 在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長(zhǎng)度（復(fù)雜度）和探針濃度。下面列出的公式適用于過剩單鏈探針對(duì)靶序列雜交的情形 t1/2=ln2/kct1/2半數(shù)探針與固定靶序列雜交所需的時(shí)間（s）k =形成雜交體的速率常數(shù)mol/(Lxntxs)決定于探針長(zhǎng)度（L）、探針復(fù)雜度（N）、溫度、離子強(qiáng)度、粘度和pHc =溶液中的探針濃度（mol/L）六、核酸分子雜交實(shí)驗(yàn)因素的優(yōu)化整理ppt雜交最適溫度 雜交技術(shù)最重要的因素之一 反應(yīng)溫度低于Tm 1015，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm-30），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合的更弱 最適復(fù)性溫度（Optimunm renaturation temperature, T