從小麥-簇毛麥易位系TAC文庫中篩選Hv-STPK基因(共9頁)

1、 從小麥(xiomi)-簇毛麥易位系TAC文庫(wnk)中篩選Hv-S/TPK基因(jyn)本文檔由【 HYPERLINK 中文word文檔庫】 HYPERLINK 提供，轉(zhuǎn)載分發(fā)敬請保留此信息； HYPERLINK 中文word文檔庫免費(fèi)提供海量教育、范文、學(xué)習(xí)、政策、報告和經(jīng)濟(jì)類word文檔。word文檔孫玉磊1, 曹愛忠1, 楊學(xué)明1,2, 王曉云1, 陳佩度11 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 南京 2100952 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所, 南京 210014摘 要: 本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)通過基因芯片技術(shù)篩選到一個白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達(dá)的抗病相關(guān)基因Hv-S/TPK,

2、 并獲得了它的全長cDNA序列。利用Hv-S/TPK的特異引物篩選小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系基因組可轉(zhuǎn)化人工染色體(Transformation-competent artificial chromsome, TAC)文庫, 獲得了陽性TAC單克隆, 并進(jìn)一步獲得了含有Hv-S/TPK cDNA序列的5160 bp(GenBank Accession No. EU153366)的亞克隆。對亞克隆的序列分析結(jié)果表明, Hv-S/TPK基因在起始密碼子和終止密碼子之間有3個內(nèi)含子和4個外顯子, 4個外顯子序列與簇毛麥上已得到的Hv-S/TPK的cDNA序列100同源。對起始密碼子上游序列分析

3、結(jié)果表明, 該基因的調(diào)控序列中, 含有W-Box、OCS-element等與抗病相關(guān)的元件。以TAC克隆為探針與小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系有絲分裂中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH), 結(jié)果表明含有Hv-S/TPK基因的TAC克隆來自于簇毛麥。關(guān)鍵詞: 小麥-簇毛麥易位系, 可轉(zhuǎn)化人工染色體文庫, Hv-S/TPK基因, 熒光原位雜交Screening Hv-S/TPK from TAC Library of a Triticum aestivum- Haynaldia villosa Translocation

4、LineYulei Sun1, Aizhong Cao1, Xueming Yang1,2, Xiaoyun Wang1, and Peidu Chen11 National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China2 Institute of Agricultural Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

5、, ChinaAbstract: Hv-S/TPK gene, a resistance related gene to powdery mildew, was cloned by using genechip, and its expression was upregulated after the inoculation of Blumeria graminis to Haynaldia villosa. Using the specific primers of Hv-S/TPK to screen a genomic TAC (Transformation-competent arti

6、ficial chromosome) library of translocation line 6VS/6AL, a positive TAC was screened. A 5-kb fragment containing Hv-S/TPK was subcloned and identified. This 5160-bp fragment (GenBank Accession No. EU153366) was determined by specific primer walking. The analysis of Hv-S/TPK genomic sequence showed

7、three introns and four extrons between start code and stop code. In the promoter region of Hv-S/TPK, there were W-box and OCS-like elements which were the elements related to disease resistance. In this study, the positive TAC clone was used to as probe in situ hybridized to mitotic metaphase chromo

8、somes of translocation line. The result of fluorescence in situ hybridization (FISH) indicated that the TAC clone containing Hv-S/TPK was from Haynaldia villosa chromosome.Keywords: Triticum aestivum-Haynaldia villosa translocation line, transformation-competent artificial chromosome (TAC), Hv-serin

9、e/threonine protein kinases (Hv-S/TPK) gene, fluorescence in situ hybridization (FISH)白粉病已經(jīng)成為小麥生產(chǎn)中日趨嚴(yán)重的病害之一, 鑒別新的抗白粉病基因(jyn)并研究它們的抗性機(jī)制變得越來越重要。而抗性機(jī)制除了與基因的編碼序列有關(guān)外, 其調(diào)控序列中的信息往往也很重要。位于(wiy)簇毛麥(Haynaldia villosa,VV, 2n = 14) 6V染色體短臂上的抗白粉病基因(jyn)Pm21是一個廣譜、高效抗性基因1,2。研究Pm21基因發(fā)揮抗病作用過程中所涉及的轉(zhuǎn)錄因子和重要的防衛(wèi)反應(yīng)基因, 對于運(yùn)

10、用基因工程手段提高小麥對白粉病的抗性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室利用基因芯片技術(shù), 克隆到了抗白粉病病相關(guān)基因Hv-S/TPK的全長cDNA序列。Hv-S/TPK是一個推導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸激酶基因3, 該類基因是抗病基因的一種重要類型4。Hv-S/TPK在抗病簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 因此可能是參與抗病過程的重要基因3。根據(jù)Hv-S/TPK的序列, 開發(fā)出一個與抗白粉病基因Pm21連鎖的共顯性分子標(biāo)記CINAU15(即NAU/xibao15)3。利用擴(kuò)增Hv-S/TPK的特異引物(CINAU15F和CINAU15R), 已將該基因定位到簇毛麥6V染色體短臂, 并進(jìn)一步明確該基因與Pm21基因位

11、于斷點(diǎn)距著絲粒為FL0.58的同一染色體區(qū)域。分離基因的調(diào)控序列可以用Tail-PCR5和篩選基因組文庫等方法得到。利用可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)6載體, 方玉達(dá)等7成功構(gòu)建了含有高抗白粉病基因Pm21的小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系的基因組TAC文庫。本研究利用克隆池PCR(pooled PCR)法8從此TAC文庫中篩選Hv-S/TPK的基因組序列。為了研究Hv-S/TPK基因的調(diào)控機(jī)制, 進(jìn)一步對它的啟動子區(qū)段進(jìn)行分析并對含有Hv-S/TPK基因的TAC陽性克隆進(jìn)行了染色體的初步定位研究。1 材料(cilio)與方法1.1 材料(cilio)與試劑小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系92R1

12、37由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞(xbo)遺傳研究所選育。小麥-簇毛麥易位系6VS/6AL基因組TAC文庫由方玉達(dá)等構(gòu)建7, 以混合克隆池的形式保存在22塊96孔板中。大腸桿菌DH10B和載體pBluescript由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2 文庫篩選采用PCR法篩選文庫, 引物為CINAU15-F: 5- AGATCCAACACCAGTTCAAG-3和CINAU15-R: 5-ATGTTATGGAGGCTTGTGTC-3, PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 94oC預(yù)變性3 min; 94oC變性30 s, 55oC退火30 s, 72oC延伸2 min, 32個循環(huán); 72oC延伸10 min; 10oC保存3。能擴(kuò)增

13、出來自Hv-S/TPK基因的902 bp特異條帶的視為陽性克隆。從TAC文庫每塊板中的6個孔各吸取1 L菌液進(jìn)行混合培養(yǎng)提取質(zhì)粒, 構(gòu)成1個初級克隆池, 每塊板構(gòu)成966=16個初級克隆池, 整個TAC文庫構(gòu)成2216=352個初級克隆池, 用PCR法對初級克隆池進(jìn)行篩選。篩選到陽性初級克隆池后, 進(jìn)一步從其對應(yīng)的6個孔中篩選出陽性孔, 提取質(zhì)粒電激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中, 挑取4060個單克隆組成次級克隆池。用PCR法再次篩選陽性次級克隆池, 把陽性次級克隆池混合菌液稀釋涂平板后, 挑選單克隆進(jìn)行PCR, 篩選出陽性單克隆。1.3 陽性單克隆的亞克隆提取陽性TAC克隆的質(zhì)粒, 用限制性內(nèi)

14、切酶(Hind III、EcoR I、EcoR V、BamH I、Not I、Hpa II、Pst I、Sal I、Sca I、Spe I、Xba I、Xho I、Kpn I)分別酶切。酶切產(chǎn)物用毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。以Hv-S/TPK的cDNA片段為探針用-32P dCTP標(biāo)記, 進(jìn)行Southern雜交9?；厥债a(chǎn)生雜交信號的酶切片段, 連接到pBluescript載體上。1.4 Hv-S/TPK的亞克隆與序列分析測序由上海博亞公司完成。序列比對采用DNAMAN進(jìn)行分析。啟動子順式作用元件用PLACE (http:/www.dna.affrc.go.jp/sigscan/)進(jìn)行分析。1.5

15、 TAC克隆(k ln)的熒光原位雜交以陽性TAC克隆為探針(tn zhn), 打斷的普通小麥基因組DNA做封阻, 對小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系的根尖中期有絲分裂制片進(jìn)行熒光原位雜交。根尖制片、探針標(biāo)記、原位雜交方法參照Zhang10的方法(fngf)。2 結(jié)果2.1 篩選TAC文庫用CINAU15F和CINAU15R為引物對352個初級克隆池進(jìn)行PCR篩選, 從初級克隆池4-11中擴(kuò)增出來自Hv-S/TPK的902 bp特異條帶(圖1a)。對組成初級克隆池4-11的6個孔進(jìn)行再次篩選, 從4-11-1中擴(kuò)增出902 bp的特異條帶(圖1b)。將4-11-1的混合質(zhì)粒電激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌D

16、H10B中, 然后把培養(yǎng)皿分36個小區(qū)挑選混合克隆, 每個小區(qū)包含約4060個克隆, 組成36個次級克隆池。從31號次級克隆池中可擴(kuò)增出902 bp的特異條帶(圖1c)。把31號次級克隆池的混合菌液稀釋涂平板, 挑選了256個單克隆, 進(jìn)行PCR篩選, 發(fā)現(xiàn)31號單克隆可擴(kuò)增出902 bp的特異條帶(圖1d), 該克隆為可能含有Hv-S/TPK基因的陽性TAC單克隆。2.2 陽性TAC單克隆的鑒定和亞克隆用13種限制性內(nèi)切酶(Hind III、EcoR I、EcoR V、BamH I、Not I、Hpa II、Pst I、Sal I、Sca I、Spe I、 Xba I、Xho I、Kpn I

17、)分別酶切陽性TAC質(zhì)粒(圖2)。酶切分析表明陽性TAC克隆插入片段約30 kb。將酶切產(chǎn)物電泳轉(zhuǎn)膜, 用Hv-S/TPK的cDNA片段為探針進(jìn)行Southern雜交(圖2), 該TAC單克隆每個泳道都有雜交帶, 說明該TAC克隆為含有Hv-S/TPK基因的真正的陽性單克隆。EcoR I酶酶切的陽性TAC克隆, 僅在約5.0 kb處有一條雜交帶?；厥沾似? 連接到pBluescript載體上, 測序獲得5160 bp序列(GenBank登錄號EU153366)。2.3 亞克隆的序列分析對該陽性TAC亞克隆測序, DNA序列分析表明Hv-S/TPK基因在起始密碼子和終止密碼子之間有3個內(nèi)含子和

18、4個外顯子。4個外顯子序列與從簇毛麥上克隆到的Hv-S/TPK的cDNA全長序列100同源。內(nèi)含子依次位于19222033、22752643、27933246, 長度依次為112 bp、368 bp和454bp。在起始密碼子上游有TATA盒(13631368; 14831488), TATA盒的上游存在2個W-box (136140; 12011205)、2個PAL-box (261270; 12491267)和3個OCS元件(552565; 874887; 12761289)。2.4 含Hv-S/TPK基因(jyn)的TAC克隆(k ln)的熒光原位雜交以獲得的陽性TAC克隆為探針, 打斷的

19、普通小麥基因組DNA做封阻, 與小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系的根尖有絲分裂中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(zjio)。結(jié)果顯示在易位染色體6V染色體短臂上有較強(qiáng)的雜交信號(圖4), 表明該TAC克隆來自6V染色體短臂。3 討論本研究通過篩選基因組文庫的方法不僅獲得了Hv-S/TPK的基因組序列, 而且得到了它的啟動子區(qū)圖1 從6VS/6AL基因組TAC文庫中篩選含有Hv-S/TPK的TAC克隆Fig. 1 The schematic depiction of the screening of the TAC clone having Hv-S/TPK from the translocatio

20、n line 6VS/6AL genomic TAC library(a) screening 16 original plasmid clone pools of the fouth plate, 4-11 pool amplified 902 bp specific band; (b) screening the six mixed plasmid of 4-11 pool, 4-11-1 pool amplified 902 bp specific band; (c) screening 36 secondary plasmid clone pools, the 31 pool ampl

21、ified 902 bp specific band; (d) screening 256 single colony, the 31 single colony amplified 902 bp specific band圖2 陽性(yngxng)TAC克隆(k ln)Southern雜交(zjio)驗(yàn)證Fig. 2 The Southern hybridization of positive TAC cloneThe left showed the patterns of positive TAC digested by different restriction enzymes(Hind

22、 III, EcoR I, EcoR V, BamH I, Not I, Hpa II, Pst I, Sal I, Sca I, Spe I, Xba I, Xhol I and Kpn I); The right was the corresponding result of Southern hybridization with the Hv-S/TPK cDNA fragment as a probe; M was the -DNA/Hind III DNA marker; The arrow showed the 5 kb hybridization fragment digeste

23、d by EcoR I1 TTCCAGTGTCGTCCATAATAAGAGACTGAAATCGGCTTCGATTTTGCTCGTACGACTATCCGCTGATGAA 71 AATTGTACTAGTTTCGTGCCCTGCCCTGCGCGATAGCCTATAATCGTCACAACGTTTTGTCGGTTTTGAC 141 TGGTTTTGGATGGGTATTGAGAAATGTTGTACAGCTGAAATGTGCTTTCCTGTGTGAACAGAGATGCTGC 211 TGGGTGGAGTCGTGGACCTTTTGGCTATCTATTGCGTGTGACGGTGTGAGATAGGTTAGTTTA

24、ATTGGTA 281 GCAGAGACACTTAGACTATAAAATCATCTTTGTCGAGACAAATACACCACCATTTCCCCCTAGATTAGTT 351 GGAAGTCCTAGCAGGCAATCATCCACGAGGTAATGCTTGTCCAAGTGTGGTATCCCGCTGAATAGTTTAT 421 TTGAAATGTTGATAAATATATTGTTGATACCTATGGCAGGGAGCTCTGCCCATTTATTAAAGTTGTAGCA 491 GCCGTCGCAGGTGGAGAAACTGAGATACTCAACTGCACTTTTAAAAATTAGTACTATTTATGT

25、CATAGTG 561 GACCTAATCTAATTTGTATAGTCGGCTATAAGCTTAAGTTAGTTGCTTTCAGCTGCTGATGTAGTAGTTA 631 GATATGTTTCTCTCATGAGAACTCTATGCATGTTCTGAGCTTGAACAGATCACCTGAAGTACATCAGCAA 701 TTTTGATCTTCTATGCAGAAGAtAATACTCCCTCCGATCCATATTACTTGTCGCTGCTTTAGTACAACTT 771 TAAAGTTGTACTCCCTCTGTAAACTTTTATAATACGTTTAATTATAAGGTAGTAGTGCCTGAT

26、TTAGCTG 841 CTGATTGCAAGGCAGAAAGTGTGCATTTTTGTGTAGCACCGCACGTAGTCACAGTTTACACTAACATAAT 911 ATTACTTCCTCCTCTTGATGGAGAAATATAACTAAATCCCAATTAATATAGCTGTTGGACTGAAAAGAAC 981 AGATTGGCCACGTTTCTTTTTTTGAACCACGAAAGGGCAGGAGCTCTGCAATTCACCATGGAAGTAGCAG 1051 AGTTGCCCAATTAATTAGGGAAATATTGGGCTCAAACCACCTAGCTAACCTAGGTTTGAGAC

27、CCACCGAC 1121 TGACAACTCAACGGACATGATGGTTCACAGTAATTGGTTGGTACCGTAGAAGGACTCATTCAGTATAATT 1191 CTCTTTGTGGTGACCATAAGTTTCATTTATTTTCAGGATATGATGGCAGCTGTTTAAGGTTGATGAAATG 1261 TCTCTGTGTATATCGTAAGTGCAAACGTATTTATTGAACTGACAACGGCGAGGCAGATATATTTTGAGAA 1331 TATAAGTAATGGGTTGTTCTCCTTTCTTTTGCTATAAAAGTGGGGCAACACGCCAGCA

28、AATTTCTACACA 1401 TACTGAAGGTAGATATTTCTTATACAGACTGTTCTACACTCTTGTGGACTATGATATGGTCACCTTCTTC 1471 ATGTTGCCATATTTAAATACTCAAACCTAATTTTACAGACCTCCTTGGTGATATTAATACAATAAGATAC 1541 ACTTATAAGGAGCTAGCAAAGGCAACAGAAAATTTTAACCCCTCCAACAAGATTGGTGAGGGGGGTTTTG 1611 GATCTGTATATAAGGTAGTGTGTGTAACCTTCAACTAATAAGCCAAATGAAATT

29、CTAATGGAAAAAATGT 1681 ACATGTTTAAAGTTTGATCATGTAATGGTGTAGGGGCGGCTAAGGAATGGAAAACTTATTGCTGTCAAGG 1751 TGTTATCTGTAGAATCAAGACAAGGATTAAAGGAGTTTCTGAATGAACTGATGTCAATTTCCAACATATC 1821 TCATGGCAATCTTGTCAGCCTTTATGGCTATTGTGTGGAAGGAAACCAGAGGATCCTTGTTTACAATTAC 1891 CTTGAGAATAATAGCCTAGCACAAACACTTCTAGGTAATTCTTGGTTGGT

30、TCTTTTCATCGTACTGTTCT 1961 TCGAAACTTCTACATATTTGCTTAAAAAGGTCTAATTCTAATGTTCCTTAGCTTTTCTCTTCTTATTTCT 2031 TATTAGGTTCTGGCCGCAGCAATATCCAGTTCAATTGGAGAAGTAGAGTAAATATTTGCCTTGGTATCGC 2101 CCGAGGATTAGCATACCTTCATGATGATGTCAATCCCCACATTGTTCATCGGGATATCAAAGCAAGCAAT 2171 ATACTTCTTGATAAGGATCTCACCCCCAAAATTTCTGATTTCGGTT

31、TAGCAAAGCTTCTACCTCCAAATG 2241 CGTCACATATTAGCACACGGGTTGCAGGAACATTGTAAGTTAATTTTGTCATATGGAACTATCTACCTAT 2311 AATGAGTTATCATGTGCGCTGCATGTTTACTACTCATATATTACATCCTATATGCTCATATATTGGATGT 2381 AAGTCTTATGTTATGGGACGGAGGGAGTAGTTTCTTTGTTTTGTACTGTGTGCCTTCAGAAGCTACTGCT 2451 TATAATTGGCATTTCAACTTAATTTGGTTGAATTTAATACAC

32、CCCAAAAGAATCTTTCACATATGATGAA 2521 ACCACACCACCTGTTTCGTAGGAGAAGTTAGAGGCAATTACAATTGAAATAAAAATATTATTCATAAATG 2591 ATCACTATATTGTGATAAACTGTCGGCATTACTTACTCAGTTTTACTTCACAGAGGTTACTTGGCTCCTG 2661 AGTATGCCATTCGAGGACAAGTGACACGGAAGTCAGATGTTTATAGTTTTGGTGTTTTGCTTCTGGAAAT 2731 AGTCAGTGGGAGATCCAACACCAGTTCAAGATTACCCT

33、ATGAAGACCAAATACTTTTGGAAAAGGTTAGA 2801 TGAAGTAGAATACATATTTCTTTCTCTTCTTTTCCCGTTCCTTATTGGTAAAAAAGTAAACTATTATGTT 2871 CTACCATAATGAATGAATTAGTTTTAGCTGAAGTTATTTACAGTTTGAGTTTGATGGATGGATAGTACTG 2941 GCACGTCATAAATTTGGAGTGCATAAAAGCAATCTTGATTTCTGGTAAAAAAAAACTAGCTTAGATGCAT 3011 ACAACTCTTGCATTTTAGAATGTTAGCCATGCCA

34、TGTCCATTTTTCATTTATTAAATTTGTAGTACAATA 3081 CAGAAAAATGATTACTACTATCATGCACTTAAATTTTAGTTGCTTGCTGGCAAGCACATTAGCTGCTTCC 3151 TTGTCTCTACATAAATGCATAAATCGTGTATAACCTCTTAGCATGACTGGAGGGAGCAAATATTCTAACT 3221 CATGGACTTTTGTTCTTTACTGCTACAGTTCCCAGAGGTTACCAATGGGGTTCTCCTCTTGCAGACATGG 3291 ATGTATTATGAGCAGGGAGATTTGGTGAAA

35、ATCATAGACAGTTCTGTGGGTGATGATTTGGATATTGAAC 3361 AAGCCTGCAGGTTCCTGAAAGTTGGACTTCTCTGTACACAAGATGTCACAAGACATCGACCCACCATGTC 3431 AACTGTCGTCAGCATGCTAGCAGGCGAAAAGGATGTTGACTCGGAGAAGATCAGCAAGCCCGCTACAATT 3501 AGCGACTTTATGGACCTCAAGATCAGGAGCATGAGGAGAGAAAATAACATAGCTTTCGCTTCTTCCTCCA 3571 CGTTGCTATCCACTATCATGGCACAC

36、TCTTCTCCATTGTTGTCGCAAGAGACGACACAAGCCTCCTTAAC 3641 ATTCACCGCAATATCAGAGTGTGAGTGACCTGAAGTTGGTTGCAAATACGAAGACCATGTAGAGAAGTAG 3711 CATAGCCAGATACCTTTTCTTTTTCAGAAAATTTCTTCCTAGTGTATAGATTCACTTTGTTTATAGTGTA 3781 GACAGCATTGCTGGGACAAAGAAGTTCACCAGTTTTACTTTGTGTGTATAATACTAGATTGGTGGCGCAG 3851 TGTCATTGTATAATTTGTGCAT

37、GTACATCGTGTCTGTTGTTTGTTTGGAGGGTAAGAAAATACAAGTTTG 3921 AGATCCTGTGAGTACATAGCCTGGCTGTATCAACAAAATCCAGATGAGCTGGTTTGGTTGCCCGCTTGAC 3991 TTGCAGTTCATAAATGGCCAACATTACAAGGGCATGTTCCCCACACGTTGTCATGAACTACCAAAATGCA 4061 AAACGCATCTTGCGATGATCAGTTTCCATCGTCTCCTTTTCCCTGTACACCATCACATATGCTCTCAGCT 4131 TCAGTGTAACTTGGATAA

38、TGCAGAGACTCCTTTTTCCTGTACACCATCACATATGCTTTCAGCTTCAGTG 4201 TAACTTGGATAATGCAGAGATTGATGTATTGTCTTTGTCTCGGCAGTCCTCCAGCACCATGGCAGGTGTT 4271 CTACTACTGCTACTGCTGCTGCTGCTACCACCACCACCATCACCACCAAGCAAGCAGCTAGCTGCCATGA 4341 TGTCTGCATCACCATCATGCGAGTAGTTCCCCGTGGAAGAAGGGACCCAGCCAGGTGCTCCTCCGCCTCC 4411 CAGCCAGTGAGGTA

39、ATCTCCAACATGGGAACAGGGAATGGCAGTGTCCTCCCATCTGCCCTTGGCAAAAT 4481 TTCGTGTTTTGACCCTTTTGTGGTACAAAATCGGAATCTGACCCATGTTTAATTTTTTTTCGACATTTGA 4551 CCCTTTTTCCTACCGCCGGGCCTAGCCTACCGCCAGAAAGTGCGGCGGTAGGAAACTTATCCATGTCAGC 4621 AGTGTTAACGGCCTCCGTCCCTCCTTCGCCCCACCCTACCGCCTATGGTCCTGGCGGTAGCTGATGTGGT 4691 TGCATACTAG

40、GGGTAGGGTCCTAGACAAGGCCCATATGCCCCACACAAGGATACTAAGACGTGATCTCTT 4761 TAGGACACCTTATGTACCGACTGATTCAGGCAAGTTCAAAAAACACTTGGTCTACATACCACTCGGCGGT 4831 AATCAAGTCACACGGCTGAAACTAAACCACTCGGCATGATCCGAGAATCAGTCGGCTAGAAGACGAAGAA 4901 CTGCAGAGGAGATAAAGAGGTGCTGTAACGGCTGTAGTTATCGCCCTTTATTACTTACGTTACCTGCAAC 4971 ATTACT

41、CTTAACATTCATTCCTCGAACCCTTCATTGCCAACGCATCTATGAGGGGCAGCGCACTCTATAT 5041 AAGCCGCCCCTCACCTCTGGCACAAGGGTTCGCACCCCCTGTAACCATTGTTCTCCCACACGACAAAGAA 5111 ACGCTCCGGCGCACTGAGACGTAGGGCTTTTACCTCTCCGCGAGGGGCCT圖3 來自(li z)小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系的Hv-S/TPK基因(jyn)序列Fig. 3 The genomic sequences of Hv-S/TPK isolated from Trit

42、icum aestivum-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lineTTGAC and TGACC represented two W-boxes; GTCATAGTGGACCT, GTAGCACCGCACGT and GTAAGTGCAAACGT represented the three OCS-like elements; GATAGGTTAG and GGTTGATGAA represented PAL-box; ATG were start code; TAG were stop code; the sequences of 111 w

43、ere introns序列(xli), 這對研究Hv-S/TPK的功能會提供幫助。在Hv-S/TPK的啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)有2個PAL-box(PAL基因啟動子的順式作用元件)、2個W-box和3個OCS元件。苯丙氨酸解氨酶(PAL)與植物抗病性密切相關(guān)12, 是一個重要的防衛(wèi)反應(yīng)基因, 在很多植物抗病反應(yīng)中都大量表達(dá), 所以在其調(diào)控區(qū)域可能含有與抗病性相關(guān)的調(diào)控元件。W-box是WRKY轉(zhuǎn)錄因子在啟動子區(qū)域的結(jié)合位點(diǎn), 大量證據(jù)表明, W-box是被病原物所誘導(dǎo)表達(dá)的許多植物基因的順式作用元件的主要類型, 且W-box和類W-box在啟動子區(qū)段多聚集成簇13。OCS(Octopine synthas

44、e, OCS)元件是首先在根癌農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)的章魚堿合成酶基因啟動子上游中發(fā)現(xiàn)的一個16 bp的反向重復(fù)序列, 在一些防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因的啟動子區(qū)存在OCS元件14。在Hv-S/TPK序列的上游也存在與抗病反應(yīng)相關(guān)的基因中存在的順式作用元件, 推測該基因在受到病原菌侵染后, W-box、PAL-box和OCS元件與各自轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合協(xié)同作用, 誘導(dǎo)該基因表達(dá), Hv-S/TPK可能是參與抗病過程的重要基因。利用(lyng)擴(kuò)增Hv-S/TPK的特異(ty)引物已將Hv-S/TPK定位(dngwi)到簇毛麥6V染色體短臂上3。本研究以獲得的陽性TAC克隆為探針, 熒光原位雜交結(jié)果顯示在易位染色體

45、6VS上有較強(qiáng)的雜交信號, 初步表明含Hv-S/TPK基因的TAC克隆來自于小麥-簇毛麥易位系的6VS染色體, 與PCR的結(jié)果一致。由于含有Hv-S/TPK的TAC克隆的插入片段只有約30 kb左右, 但原位雜交發(fā)現(xiàn)在6VS染色體短臂上幾乎都有雜交信號, 所以推測TAC克隆除含有Hv-S/TPK外, 還含有簇毛麥?；闹貜?fù)序列。下一步我們將采用亞克隆序列作為探針進(jìn)行原位雜交, 進(jìn)一步確定Hv-S/TPK基因在6VS染色體上的物理位置。圖4 小麥-簇毛麥6VS/6AL易位系有絲分裂中期染色體的C-分帶和以TAC克隆做探針的分子原位雜交圖Fig. 4 The chromosome C-bandin

46、g and TAC-FISH preparation at meatephase of RTC in T.aestivum-H. villosa 6VS/6AL translocation lineThe arrow showed the 6V chromosome short arm from Haynaldia villosa本文檔對您參考價值不大? 百萬(bi wn)文檔，終有你所需！文檔搜索引擎： HYPERLINK /search/ /search/如您認(rèn)為此文檔對您有較大幫助，期待您能在微薄、博客、網(wǎng)站和論壇等網(wǎng)頁(wn y)宣傳本站鏈接。鏈接網(wǎng)址(wn zh)： HYPERLIN

47、K 鏈接名稱： HYPERLINK / o 意見word列表,意見文檔全集 中文word文檔庫REFERENCESChen PD, Qi LL, Zhou B, et al. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Hay naldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew. Theor Appl Genet, 1995, 91 (6-7): 11251128.Qi LL,Chen PD, Liu DJ, et

48、 al. The gene Pm21A new source for resistance to wheat powdery mildew. Acta Agronomica Sinica, 1995, 21(3): 257262.齊莉莉, 陳佩度, 劉大鈞, 等. 小麥白粉病新抗原基因Pm21. 作物學(xué)報, 1995, 21(3): 257262.Cao AZ, Wang XE, Chen YP, et al. A sequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS, 6BS, 6DS of T

49、riticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa. Plant Breeding, 2006, 125(3): 201205.Qin GJ, Li WL, Chen PD. Update of resistance genes and resistance gene analogs in plants. J Nanjing Agri Univ, 1999, 22(3): 102107.秦跟基, 李萬隆, 陳佩度. 植物抗病基因結(jié)構(gòu)特征及其類似序列的研究進(jìn)展. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1999, 22(3): 102107.Liu YG, Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced PCR: Automatable amplification and sequencing of insert end fragments from P1 and YAC clones for chromosome walking. Genomics, 1995, 25(3): 674681.Liu YG, Shirano Y