分子生物學(xué)+常用核酸分子探針簡介

1、分子探針簡介分析化學(xué)新方法新技術(shù) 1寫在前面 經(jīng)典化學(xué)分析：沉淀劑、滴定劑、萃取 劑、指示劑和顯色劑等發(fā)展方向：微型化、仿生化、自動化、信息化 目前最高水平：DNA序列分析中標(biāo)記堿基的四種分子熒光探針 2微型化：納米芯片、生物芯片及芯片上的實(shí)驗(yàn)室 仿生化：電子鼻和電子舌的傳感器 自動化：原位及體內(nèi)實(shí)時在線檢測 信息化: 臨床、環(huán)境及生產(chǎn)過程檢測的網(wǎng)絡(luò)化 3生物分子探針 主要類型：離子探針 蛋白質(zhì)及酶的熒光探針 核酸分子熒光探針 4 離子探針？什么東東?。繉⑸锎蠓肿又械姆沁^渡族金屬離子用具有光、磁信息的過渡族金屬離子置換，用這些金屬離子與生物大分子的相互作用行為探查非過渡金屬的生物功能，即為離

2、子探針技術(shù)。這樣就能 對溶劑狀態(tài)中生物分子構(gòu)象和行為進(jìn)行研究，彌補(bǔ)了X射線衍射方法只能對晶體進(jìn)行測定的不足。所用的過渡族金屬離子就叫離子探針 5離子探針的生物及化學(xué)依據(jù) 大多數(shù)的酶要靠金屬離子表現(xiàn)其活性探針離子具有與原生物分子中的金屬離子相同或相似的物理化學(xué)行為：如半徑、化學(xué)配位性質(zhì)、立體化學(xué)行為等，可以置換 原來這么簡單??！6蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)血紅素肽鏈扭轉(zhuǎn)血紅蛋白的三級結(jié)構(gòu)7非過渡金屬離子（飽和電子層結(jié)構(gòu)）過渡族金屬離子（不飽和電子層結(jié)構(gòu)） K+1 Zn+2 Mg+2 Ca+2Co+2 Tl+1 Mn+2 Gd+3 Eu+3 Tb+3離子半徑/nm0.133 0.069 0.055 0.099

3、0.072 0.140 0.088 0.0938 0.095 0.0923靜電勢/（Z2/r）0.75 4.80 5.12 3.78 4.88 0.67 4.40 表一： 一些生物大分子中有關(guān)金屬離子參數(shù)Mn+2取代蘋果酸酶中的Mg+2后，該酶同樣具有催化L- 蘋果酸脫羧地反應(yīng)活性碳酸酐酶、羧酞酶及乳酸脫氫酶中含有Zn+2，用Co+3 代替Zn+2，這些酶仍具有活性伴刀豆球蛋白A含有Mn和Ca，用稀土離子 Eu+3,Tb+3,Gd+3置換Ca+2后，該蛋白仍然保持有結(jié) 合糖的活性 8蛋白質(zhì)及酶的熒光探針蛋白質(zhì)是生物大分子，它能在溶液中與某些染料靜電吸引或氫鍵結(jié)合，可用紫外可見光度法或熒光測定蛋

4、白質(zhì)。另外蛋白質(zhì)含有氨基（NH2 或NH），SH，COOH和=CO,可用與以上基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)的熒光 衍生試劑對蛋白質(zhì)標(biāo)記，進(jìn)而用色譜及電泳分離紫外可見或熒光檢測蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的熒光，主要是構(gòu)成它的色氨酸，絡(luò)氨酸和苯丙氨酸具有的熒光，通過蛋白質(zhì)的天然熒光用熒光法檢測比紫外吸收法靈敏。熒光探針是一類比蛋白質(zhì)熒光發(fā)射較強(qiáng)熒光的染料，它吸附或共價結(jié)合到蛋白質(zhì)上，熒光特性會發(fā)生變化，從而可以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和測定蛋白質(zhì)。這其中有一種叫做免疫熒光技術(shù)9免疫熒光技術(shù)，即熒光抗體方法，就是把特異性抗原多 次注入動物體，使之產(chǎn)生抗體，將抗體球蛋白從血清中分離 出來，用熒光染料標(biāo)記，制成熒光標(biāo)記抗體溶液。免疫熒光

5、染色比其他的生物染色方法有較高的特異性和靈敏度?？贵w（免疫球蛋白）與熒光染料結(jié)合后，仍不失抗體的免疫活性， 稱為熒光抗體。用于標(biāo)記抗體的熒光染料于一般的熒光染料 不同，必須容易與抗體球蛋白結(jié)合，又不影響其免疫活性； 還要求性能穩(wěn)定、容易溶解和標(biāo)記方法簡單。由于蛋白質(zhì)本 身也具有熒光，為了減少蛋白質(zhì)本身的熒光干擾，標(biāo)記抗體 的熒光染料不但熒光量子產(chǎn)率高，還要求熒光發(fā)射波長較長。 常用的標(biāo)記抗體的熒光染料有熒光素異硫氰酸酯、四甲基羅 丹明異硫氰酸酯和羅丹明B200等。10核酸分子熒光探針及核酸染色 沿核酸的螺旋方向看，雙螺旋表面有兩個溝槽，一個寬槽和一個窄槽，這兩個溝槽使堿基外露，為分子探針或其他

6、分子與堿基作用提供了空間。窄槽 寬槽11核酸染色劑及熒光探針的應(yīng)用溶液中核酸的定量測定 單分子核酸檢測 核酸的凝膠染色體電泳分離檢測在熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)中的應(yīng)用 DNA序列分析12DNA序列分析中的熒光染料：在電泳分離熒光法檢測DNA 序列分析中，通常分四組（A,C,G,T體系）進(jìn)行，如果用 四種不同的熒光染料為探針,標(biāo)記一個共同的引物，分別 用在 A、C、G、T四個反應(yīng)體系中，等于用不同的探針 專一地標(biāo)記了不同的堿基，利用各熒光探針光譜的差別 便可把不同的堿基區(qū)分開,因此選擇一組四種合適的染料 成為關(guān)鍵，它們應(yīng)滿足以下條件： (1)吸收和發(fā)射光譜應(yīng)在可見光區(qū)，以降低散射和熒光背

7、景； (2)各染料的熒光發(fā)射波長因該有明顯不同，以便區(qū)分不同染料; (3)應(yīng)有很強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，以獲得高靈敏度； (4)不嚴(yán)重干擾引物的雜交作用，使其不影響測序反應(yīng)效率； (5)染料的存在不嚴(yán)重改變電泳譜圖。 1314表二：菲啶和口丫啶類嵌入劑及其 與DNA結(jié)合物的有關(guān)性能 表三：含吲哚和苯并咪唑類嵌入劑及其 與DNA結(jié)合物的有關(guān)性能 核酸分子探針種類：目前作為核酸分子探針的有機(jī) 分子染料有幾十種，按探針分子結(jié)構(gòu)可分為： 菲啶和口丫啶類染料、吲哚和咪唑類染料、 碳菁陽離子染料、苯并呋喃酮（香豆素）類等。表四：TOTO-1系列染料及其 與DNA結(jié)合物的有關(guān)性能15探針序號溶解性max/nm*103

8、/（1mol-1*cm-1） (ex/em)/nm性能及應(yīng)用溶劑1H2ODMSO518 5.2518/605不滲透膜；雙股DNA嵌入劑；死細(xì)胞染色；染色體計數(shù)染色；電泳；流動細(xì)胞光度法；氬-離子激光甲醇2H2O，DMF 535 5.8 536/617不滲透膜；死細(xì)胞染色；染色體和細(xì)胞計數(shù)染色甲醇3DMSO 518 3.9 518/600滲透膜；染色核酸和真核生物及一些細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)甲醇4DMF 500 53 500/526滲透膜；RNA/DNA的辨別測定；溶酶體標(biāo)記；流動細(xì)胞光度法水或甲醇5DMSO 528 7.0 528/617不滲透膜；高親合DNA標(biāo)記；死細(xì)胞 染色；電泳prestain；氬-離子和He-Ne激光甲醇6H2O;DMF 421 11 431/498不滲透膜；AT選擇；高親合DNA標(biāo)記甲醇16探針序號溶解性max/nm*103/（1mol-1*cm-1）(ex/em)/nm性能及應(yīng)用溶劑10H2O,DMF 352 40 352/461滲透膜；AT選擇，小溝槽鍵合，選擇鍵合dsDNA；活細(xì)胞染色；細(xì)胞周期研究；染色體和細(xì)胞計數(shù)染色 水或甲醇 11 H2O,DMF 350 45 350/461滲透膜；AT選擇，小溝槽鍵合，活細(xì)胞染色；細(xì)胞周期研究；染色體和細(xì)胞計數(shù)染色水或甲醇 12H2O,DMF 358 21 358/461半滲