分子生物學(xué)技術(shù)精講(共15頁)

1、5.1重組(zhn z)DNA技術(shù)(jsh)回顧本章(bn zhn)內(nèi)容介紹了DNA重組研究的發(fā)現(xiàn)歷史以及2個(gè)基本概念，粘性末端和載體粘性末端，眾所周知，就是一段DNA雙分子結(jié)構(gòu)末端突出的只有一條邊的幾個(gè)bp長的DNA短片段，有特定的酶與之對應(yīng)，能夠?qū)λM(jìn)行切割，即斷裂堿基互補(bǔ)配對的分子間作用力，并且切斷特定幾個(gè)堿基組合的一個(gè)磷酸二酯鍵，使之片段分離。而載體就是一個(gè)質(zhì)粒了，之所以它能夠成為載體，必然有其必須的一面，即：能夠自我復(fù)制和表達(dá)，有特定的酶切位點(diǎn)。大多數(shù)還有其特定的篩選標(biāo)記，如氨芐抗性等等。現(xiàn)代常用的克隆載體為大腸桿菌DH5，表達(dá)載體BL21，這兩種在分子生物學(xué)上比較通用。本章內(nèi)容還涉

2、及了氯化鈣處理后的大腸桿菌能夠變成感受態(tài)細(xì)胞。氯化鈣能夠打通細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而能夠讓質(zhì)粒載體進(jìn)入細(xì)胞。另外，T4連接酶能夠連接片段和T載體。他們之間連接不靠粘性末端，而靠taq酶的一種特性。Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物末端加一個(gè)A，而T載體剛好是有T在外部暴露的，從而很容易連接。5.2DNA基本操作技術(shù)5.21核酸凝膠電泳技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)是利用DNA分子在凝膠中的阻滯效果而實(shí)現(xiàn)的。從分子層面來看，瓊脂糖或者聚丙烯酰胺一個(gè)分子和一個(gè)分子之間是有空隙的，不同大小的DNA片段通過同一種空隙的能力是不一樣的，大的過空隙的時(shí)候，就慢，小的就快，就像胖子和瘦子穿過一個(gè)過道是一個(gè)效果。所以就在通過空

3、隙的時(shí)候DNA不同大小的片段就被分離開了。而凝膠的濃度，決定了這種空隙的大小，越濃，那么空隙就越小，“胖子”穿過空隙就會越慢。從而會有凝膠濃度不同，能分離的DNA片段大小不一樣的效果。核酸染料溴乙錠EB，結(jié)合在DNA分子相鄰堿基之間，它在紫外熒光下可以顯示顏色，便于我們識別DNA在凝膠上的位置。脈沖場凝膠電泳用于分離超大的DNA片段，因?yàn)?.3%的瓊脂糖最多分離50000bp的長度，（太胖了，跑得太慢，就基本不動了）所以當(dāng)我們需要分離的更大，就不得不讓DNA在凝膠中反復(fù)跑，如果只是像普通電泳中那種直線跑膠方法，那么需要的膠長度，就超乎了你的想象了，所以通過不同的變換方位延長跑膠的長度，一般走的

4、是Z字形，而之所以用脈沖場，就是他太胖了，需要很大的力量推著他走，所以增加了大的電壓。5.22細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增值細(xì)胞轉(zhuǎn)化介紹了2中細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法，一種是大腸桿菌的氯化鈣改變細(xì)胞膜通透性的方法，一種是電轉(zhuǎn)化。兩種都是通過將細(xì)胞的膜和細(xì)胞壁打透，從而能讓分子質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞。氯化鈣法處理細(xì)胞是通過低溫(dwn)下氯化鈣造成細(xì)胞膨脹，增加了細(xì)胞膜通透性，能夠粘附DNA分子在其表面熱激的時(shí)候，黏附的分子由于分子熱運(yùn)動加快，細(xì)胞膜透性好，就進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)部。熱激完了以后冷激，細(xì)胞膜的通透性就會再次下降，成了包含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌，能夠用細(xì)菌復(fù)制和生長(shngzhng)，得到大量所需要的質(zhì)粒。電

5、擊(din j)轉(zhuǎn)化是電脈沖打透了細(xì)胞壁，DNA從孔洞中進(jìn)入細(xì)胞。5.23聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)PCRPCR，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于體外擴(kuò)增所需要的目的片段，接下來直入正題。首先回顧PCR的基礎(chǔ)原理：PCR儀，個(gè)人認(rèn)為就是一個(gè)能夠?qū)崿F(xiàn)快速變溫的溫度控制裝置，別無他用，而在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，溫度的快速改變，是控制DNA結(jié)構(gòu)改變所必須的。1，DNA一般為雙鏈，首先，我們需要把它進(jìn)行解鏈，從而產(chǎn)生兩條單鏈，讓引物結(jié)合上去，達(dá)到復(fù)制的目的。一開始我們設(shè)置的高溫，剛好能夠使得DNA雙鏈解體。約9498，用3到5min即可。此反應(yīng)中我們用的TAQ酶（嗜熱桿菌中提取的DNA聚合酶）也是高溫啟動的，初始的高溫適合其

6、開始在體系中的活性，但是約15分鐘的高溫會導(dǎo)致其半衰期，從而失去活性，使得反應(yīng)效率降低，所以高溫的時(shí)間不宜過長。2，在24步驟中，我們進(jìn)行循環(huán)，以達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增的作用，大量得到所需DNA產(chǎn)物。3，在2步循環(huán)中，第一次的高溫是進(jìn)行預(yù)變性，在每一次的開鏈中都需要在進(jìn)行一次變性，從而達(dá)到開鏈的目的。預(yù)變性同樣是9498，時(shí)間控制在30S到2min之間，根據(jù)片段不同長度而不同。4，在第三步循環(huán)中，我們進(jìn)行退火，使得溫度控制在引物和模板鏈剛好能夠結(jié)合的溫度使得引物和模板鏈進(jìn)行結(jié)合。溫度約為3770，引物是個(gè)人根據(jù)基因片段不同而自行設(shè)置的，具體設(shè)置方法參見引物設(shè)計(jì)的內(nèi)容。設(shè)計(jì)引物的時(shí)候會給出相應(yīng)的參考TM值

7、，一般小于TM值5算作本次PCR的退火溫度。如果不行，則根據(jù)具體情況調(diào)整，梯度PCR，tallPCR反應(yīng)都是可以嘗試的。5，第四步延伸，在引物結(jié)合在模板上進(jìn)行合成，復(fù)制得到引物起始和模板鏈尾部的新片段。溫度約為72，時(shí)間： taq酶的活力是1000bp/min，根據(jù)所需片段，自行計(jì)算延伸時(shí)間。Pfu酶延伸速率為500BP/min在多次循環(huán)以后，得到的片段大多是兩個(gè)引物控制的部分。即目的片段。在第二步到第四步的過程(guchng)中每次經(jīng)過解鏈，引物結(jié)合目的片段，延伸，這三個(gè)過程，就新生成一次的目的片段，所以按照推測，PCR產(chǎn)物應(yīng)該是成對數(shù)增長的。即一變二二變四的反應(yīng)過程。但是酶的活力和反應(yīng)體系

8、等的影響，并不能保證(bozhng)每一次都能夠完全反應(yīng)，所以PCR產(chǎn)物(chnw)的增長曲線，實(shí)際上更接近于細(xì)菌的生長期，對數(shù)期成熟期和消亡期的增長曲線。6，第五步進(jìn)行補(bǔ)齊延伸，因?yàn)槊傅幕盍Σ⒉皇欠€(wěn)定的，我們的條件也不一定能夠達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，所以酶的效果并不一定能夠達(dá)到最好的情況，最后設(shè)置7到10分鐘的補(bǔ)齊延伸，能夠讓得到產(chǎn)物完整性更加好。程序的編寫很大程度上取決于酶的使用說明書，參照說明書來寫。最后需要設(shè)置4恒久保存，在來不及收樣的時(shí)候能夠保持其片段不變性。PCR體系設(shè)計(jì)：一般PCR采用50微升體系，加入以下試劑PS Buffer（5X） 5LdNTP 4L模板 1g（cDNA200ng

9、足夠，基因組400ng一般可以）正向引物 10M的加入1L反向引物 同上酶 活力達(dá)到5U即可，一般0.5L足夠水（ddH2O） 補(bǔ)齊50L體系PCR體系根據(jù)酶的不同而不同，每一種酶的說明書上都有標(biāo)明體系和所需程序。5.24實(shí)時(shí)定量PCR本書是從實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行分類的，我們對于實(shí)時(shí)定量不好理解是因?yàn)椴恢浪歉墒裁吹?，為了克服這一點(diǎn)，筆者從源頭開始給大家說起。實(shí)時(shí)定量PCR，應(yīng)用以上PCR反應(yīng)，求測cDNA底物的濃度。但是為什么要測cDNA底物的濃度呢？因?yàn)閏DNA是從mRNA反轉(zhuǎn)錄而來的。我們提取了總mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過特異引物，定量某些基因的cDNA量，也就是定量那些基因在細(xì)胞

10、內(nèi)的轉(zhuǎn)錄量，即mRNA量。得到轉(zhuǎn)錄量，就知道在這個(gè)水平上，這個(gè)基因的基本情況，如果我們做某些條件對這些基因的影響，只需要改變條件，測定轉(zhuǎn)錄量的變化，就能夠確定他在這個(gè)水平上，是否有一定影響。實(shí)時(shí)定量中選用了SYBR Green作為熒光底物，它能夠結(jié)合在到DNA分子，從而通過熒光量，確定DNA分子的含量。通過光學(xué)元件的測定，判斷生成DNA的分子量，由PCR基本原理，反推底物量。（實(shí)際上不是按照對數(shù)算的，機(jī)器自動設(shè)置了一個(gè)效率，如果有興趣，可以參看附件中的PPT）那么，為什么能夠確定(qudng)所生產(chǎn)的片段為目的片段呢？實(shí)際上，定量PCR所合成(hchng)的產(chǎn)物，并非是目的基因本身，而只是其一

11、小部分。定量PCR所合成的片段(pin dun)是所給出定量引物之間的那一部分，定量后的產(chǎn)物不能作為完整的cDNA模板。定量PCR不要求產(chǎn)物是什么，有多少，只要求反推模板濃度，所以定量引物要確切的反映是目的基因，而并非要產(chǎn)物多少。定量引物一般非常特異，而合成片段總長度，或許只有100bp長。Taqman探針這是一種很簡單的熒光猝滅技術(shù)。探針的兩頭有兩個(gè)集團(tuán)，他們接近的時(shí)候能夠引發(fā)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光不會被檢測到，而探針大小保證兩個(gè)集團(tuán)足夠近。探針特異性結(jié)合在DNA鏈的某些位置（堿基互補(bǔ)配對），當(dāng)taq酶在延伸階段活動到探針一側(cè)，并因?yàn)槠渫馇谢钚?，將一個(gè)集團(tuán)切割下來，與另一個(gè)集團(tuán)分離較遠(yuǎn)的時(shí)候

12、，儀器就能夠檢測到熒光了。探針在taq酶延伸過程中被切得粉碎，兩個(gè)熒光集團(tuán)就會分布在整個(gè)空間，距離足夠遠(yuǎn)所以熒光會一直存在，根據(jù)最后熒光量，來判斷產(chǎn)生了多少產(chǎn)物。5.25基因組DNA文庫構(gòu)建構(gòu)建DNA文庫，其實(shí)就是將某生物的基因組放到細(xì)菌里，一個(gè)細(xì)菌的培養(yǎng)皿就是一個(gè)文庫。通過隨機(jī)切割酶，我們將基因組切成小一些的片段，然后將切好的片段，連接到質(zhì)粒載體上，然后把這些包含不同片段的載體，轉(zhuǎn)化到細(xì)菌里，就形成了一個(gè)基因文庫。培養(yǎng)皿上有各種菌落，雖然他們看起來是一樣的，但是所包含的某生物的基因組的片段是不一樣的。所有的菌落，構(gòu)成了一個(gè)完整的DNA文庫。5.3RNA上基本操作技術(shù)5.31，總RNA提取現(xiàn)最

13、常用的的RNA提取方法是trizol法，無論動物還是植物組織，都用異硫氰酸胍和苯酚來抽提RNA。RNA提取的方法不詳細(xì)介紹，基本流程為破裂細(xì)胞，萃取提取RNA，洗滌。OD（吸光度）在2。0純度最佳，看提取RNA質(zhì)量還可以用電泳。因?yàn)檎婧蜕?8s和18s的rRNA是高度保守的（在多種生物中是一樣的），如果瓊脂糖凝膠電泳檢測有這兩個(gè)，且比例（亮度）接近2:1，則是很好的。提取總RNA一般是為了反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA作為模板，從而進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄量。5.3.2mRNA的純化現(xiàn)在用纖維素柱色譜法來獲得純的mRNA，一般用試劑盒來做。用的物理原理的磁場吸附。這里不是重點(diǎn)考點(diǎn)，一般考試不會涉及，

14、所以本文不加以贅述。53.3cDNA的合成(hchng)用反轉(zhuǎn)錄(zhun l)酶來進(jìn)行cDNA的合成(hchng)常用引物為oligodT，引物凡是真核RNA，都會在末端有polyA(重復(fù)多個(gè)A)尾巴，而且在翻譯中，這個(gè)是不會產(chǎn)生蛋白的，所以反轉(zhuǎn)錄的時(shí)候我們就用很多T來做引物，從而擴(kuò)增cDNA的一條鏈。在合成中，很多人都以為只有一條引物是無法擴(kuò)增的，但是你可以想象，cDNA另一端當(dāng)酶走到的時(shí)候，會自然脫落，無法延長，不會產(chǎn)生錯(cuò)誤，所以一條引物足夠。而且PCR反應(yīng)中另一條引物并不是讓酶來脫落的，而是從另一端合成的開始。兩者相交部分退火時(shí)候相結(jié)合，從而產(chǎn)生大量的目的片段。OligodT是有酶切位

15、點(diǎn)在末尾的，從而能夠方便的連接到載體上。至于甲基化修飾，就是防止酶切割的，因?yàn)槊盖懈畹臅r(shí)候活性中心固定識別不帶甲基化的核苷酸，當(dāng)加入甲基化以后，這個(gè)位點(diǎn)原來能夠作用的酶產(chǎn)生了空間位阻，不容易結(jié)合了，從而導(dǎo)致不能切割。5.34cDNA文庫構(gòu)建同基因組文庫一樣，只是反轉(zhuǎn)錄后形成的轉(zhuǎn)錄基因庫。5.3.5基因文庫篩選1核酸雜交法：首先用纖維素膜來影印一個(gè)文庫的菌落，然后裂解了膜上的細(xì)菌，使質(zhì)粒暴露在膜上。用蛋白酶出去蛋白質(zhì)，只剩下質(zhì)粒DNA和細(xì)菌的基因組DNA，80考一下固定，然后用特異探針雜交，如果有相應(yīng)克隆的話，在放射自顯影下能夠看出，再從培養(yǎng)皿中找到相應(yīng)菌落提取質(zhì)粒，就能夠得到相應(yīng)的目的基因片段

16、的載體了。2 PCR篩選法：通過特異引物PCR特定目的片段，如果模板上存在目的片段，則有擴(kuò)增，否則無擴(kuò)增。3 免疫篩選法：此篩選法主要針對于表達(dá)文庫的篩選，抗體特異結(jié)合目的蛋白，以確定文庫中是否存在目的蛋白。5.4 SNP單核苷酸多態(tài)性這個(gè)指的就是(jish)每個(gè)堿基的不同。在生物體內(nèi)，并不是所有的AT,CG都是這樣(zhyng)配對的，也有可能AG,CT或者其他(qt)形式，當(dāng)發(fā)生了這些的時(shí)候，就算作一個(gè)SNP位點(diǎn)。SNP由于他的遺傳穩(wěn)定性而被提出來，因?yàn)樗阕饕环N突變，卻又是較為穩(wěn)定的突變（在染色體的部分位置上）5.42SNP檢測方法一般是酶切，因?yàn)楹芏嗝盖形稽c(diǎn)都是特定的堿基匹配，當(dāng)酶切不

17、能完成的時(shí)候，就證明位點(diǎn)改變了，而在基因組中，發(fā)現(xiàn)了這種改變，就看做一個(gè)SNP。當(dāng)然，也可能選取某些類酶切位點(diǎn)，與真正酶切位點(diǎn)不完全相同，但是切開的時(shí)候，也就發(fā)現(xiàn)了SNP。測序方法檢測SNP成本較高，一般實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)不起。1基因芯片技術(shù)：在固體物質(zhì)上加入特定分子，能夠和特意位點(diǎn)結(jié)合，通過熒光檢測來實(shí)現(xiàn)判斷。一般都由公司做好直接發(fā)回結(jié)果，所以方法學(xué)習(xí)參照公司的芯片介紹，考試內(nèi)容中基本不占比例。2 Taqman探針技術(shù)：同實(shí)時(shí)定量PCR的熒光共振能量轉(zhuǎn)移。3分子信標(biāo)：當(dāng)和特異物質(zhì)結(jié)合的時(shí)候有熒光，不經(jīng)過切割反應(yīng)，考試中基本不占比例。4焦磷酸測序法：每一輪反應(yīng)只有一種dNTP，所以當(dāng)結(jié)合的時(shí)候會產(chǎn)生能

18、量，放出熒光。這個(gè)本組不是很懂，基本過程如此，至于怎么加入的只有一種還能實(shí)現(xiàn)自動化，請參照公司的說明書。5.5基因克隆技術(shù)：RACE技術(shù)：此技術(shù)為經(jīng)典PCR技術(shù)之一。5RACE獲得5缺失序列：首先由mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用已知的臨近3端的序列設(shè)計(jì)特異引物GSP1，反轉(zhuǎn)錄出mRNA的互補(bǔ)鏈，此時(shí)互補(bǔ)鏈的3也就是原鏈的5部分是不知道的。降解掉mRNA，用末端轉(zhuǎn)移酶（此酶在末端，即3端加尾）加入大量dCTP。用錨定此dCTP的引物來和3端另一個(gè)知道的特異引物GSP2擴(kuò)增，就能得到未知區(qū)域的基因了。而未知區(qū)域，就是原mRNA的5端。在這里，有幾點(diǎn)解釋：兩次用不同的GSP1和GSP2能夠進(jìn)一步防止基

19、因的非特異性擴(kuò)增。因?yàn)槿绻鸊SP1能夠擴(kuò)增兩條鏈，（基于基因組的復(fù)雜性）那么有了GSP2則很可能排除一條鏈的影響，因?yàn)槟且粭l鏈，可能不包含GSP2所能結(jié)合的位置。之所以先反轉(zhuǎn)錄，是因?yàn)橄乱徊嚼媚┒宿D(zhuǎn)移酶的特性，來給產(chǎn)物加尾，從而特異擴(kuò)增未知區(qū)域。3RACE獲得3缺失序列：不必用GSP1了，因?yàn)閙RNA子代多聚A的尾巴，其他方法和5RACE相同。期間(qjin)需要去除甲基化帽子結(jié)構(gòu)，請參照課本。5.52 cDNA差示分析法1987年發(fā)表(fbio)的PCR經(jīng)典(jngdin)技術(shù)。此技術(shù)基于退火時(shí)候的特異結(jié)合，越穩(wěn)定，越互補(bǔ)，越能結(jié)合。既然要進(jìn)行差示分析，就必然需要2種存在差異的樣品。我們通

20、過過表達(dá)或者基因敲除等方法，獲得了兩種不同的樣品，他們大部分的序列都是一樣的，但是有一段序列，暫且稱之為A，一個(gè)有，另一個(gè)沒有，或者很少。那么，這個(gè)A就是差異了?，F(xiàn)在通過這個(gè)方法我們來放大這個(gè)差異，讓A在總體中特異性擴(kuò)增。首先將兩種總mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,然后把他們用4堿基內(nèi)切酶消化。用4堿基內(nèi)切酶是讓他們能夠成為均一的256bp長的片段，這樣其實(shí)A序列就被切碎了，如果他大于256bp的話。但是先不管這些，因?yàn)椴町怉片段，仍然是存在的。通過這次切割，方便以后的作業(yè)。（cDNA是mRNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，一般不會長）切割以后，兩種樣品分別加上12/24堿基接頭，就是在兩端加上如同前文所提到的o

21、ligo(dT)一類的東西，用做引物，這里加的接頭是帶有粘性末端的，這是為了方便以后的工作，以便除去一個(gè)接頭，方便PCR擴(kuò)增。兩種樣品的接頭是不一樣的，讓他倆分別通過自己的接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣兩種樣品的cDNA就有了較為大量的樣品了。此時(shí)，將兩個(gè)樣品分別去除原有接頭，再把包含有A的那個(gè)樣品連上新的接頭，并把二者混合。這時(shí)候會出現(xiàn)什么情況呢？我們在做下一步PCR的時(shí)候，底物中有大量的各種DNA片段，但是A樣品是有完全的接頭的，而其他的各種DNA片段，有很多是有接頭的，也有很多是沒有接頭的，在PCR退火的過程中，有接頭的部分和沒有接頭的部分都很多，可以互相退火，相互結(jié)合這樣，他們只有一部分的

22、退火產(chǎn)物有接頭。當(dāng)我們將沒有接頭的部分取了100倍多于有接頭的部分，那么退火過后，很多有接頭的雜質(zhì)片段（即不是A的片段）就會和沒有接頭的雜志片段相結(jié)合，因?yàn)樗麄兂私宇^以外全都一樣。但是僅有A這一種片段是必然有接頭的，所以以接頭為引物進(jìn)行PCR，得出的指數(shù)擴(kuò)增的目的片段，就只有A了，其他的片段在PCR過程中均沒有得到指數(shù)擴(kuò)增，所以量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于A，這樣就得到了A這個(gè)差異片段。但是前文中可以看出，得到的片段不只有一條，通過測序，他們這些256bp長的片段互相拼接，就得到了全長的A。5.53 GATEway大規(guī)?？寺〖夹g(shù)此技術(shù)的重點(diǎn)在于TOPO反應(yīng)和LR反應(yīng)TOPO反應(yīng)：entry載體上有ccctt的

23、堿基序列，它能夠被拓?fù)洚悩?gòu)酶識別，能夠切成課本上的那個(gè)圖的左半邊的那種樣子，然后做PCR的時(shí)候需要你在末端加入如圖中紅色的那樣的堿基，載體的粘性末端會自動攻擊PCR產(chǎn)物的末端，然后就能夠按照他所說的那種方向連入載體了。Entry載體之所以叫這個(gè)名字，主要還是因?yàn)長R反應(yīng)，如圖所示，attl1和attR1能夠彼此互換，而另外兩個(gè)位點(diǎn)也會產(chǎn)生同樣效應(yīng)，這樣形成的attb和attp就能夠?qū)⒒蚝蚦mR ccdB的標(biāo)記相互交換，讓標(biāo)記轉(zhuǎn)入entry載體而基因轉(zhuǎn)入表達(dá)載體了。5.5.4 基因(jyn)的圖位克隆法這種方法用來分離未知性狀的目的(md)基因，這句話并不好理解，實(shí)際上，我們對于這個(gè)基因必然是

24、有一定了解(lioji)的，圖位克隆法的重點(diǎn)，在于尋找這條基因，并把它克隆出來。這條基因的性狀其實(shí)我們是知道的，但是不知道控制這個(gè)性狀 的基因，在哪里，就是說，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)性狀，為了尋找這個(gè)基因，而用圖位克隆法。首先介紹一下RFLP和RAPD標(biāo)記，標(biāo)記，就是位于染色體上的一段序列，他們是基因連鎖圖上的一部分，是經(jīng)過專業(yè)人士篩選并定位的，具體生物學(xué)意義并不重要，重要的是他們存在于染色體上的位置是很固定的。例如06年SCIENCE上發(fā)表的關(guān)于標(biāo)記YR36的小麥染色體定位，用染色體步移做出的，就是一個(gè)定位準(zhǔn)確的標(biāo)記。課本上所提到的RFLP標(biāo)記，即限制性內(nèi)切酶多態(tài)性的標(biāo)記價(jià)格昂貴，雖然穩(wěn)定但是不常用

25、，而基于PCR的RAPD標(biāo)記，則是較為常用的。首先可以進(jìn)行缺體鑒定，缺失掉某一條染色體，然后觀察表型性狀，如果目的性狀的基因被消除了，表型也就發(fā)生了相應(yīng)變化，從而確定了此基因在哪一條染色體上。不過這個(gè)方法不穩(wěn)定，所以一般不用。然后，我們找到基因連鎖圖，上面會有很多很多的標(biāo)記，在遺傳學(xué)上，染色體存在交叉互換，遺傳距離相近的基因，在一塊交叉互換的幾率就越大。在進(jìn)行初步定位的時(shí)候，由于染色體會進(jìn)行交叉互換，你所定位的基因也會在染色體交叉互換的過程中被換，通過針對每一條染色體上的標(biāo)記設(shè)計(jì)特異引物，我們特異擴(kuò)增不同表型的群體。例如，A和B是一對相對性狀，我們對其1號染色體上的標(biāo)記進(jìn)行篩選。首先，我們拿到

26、表現(xiàn)型是A的一個(gè)群體，如100個(gè)，然后表現(xiàn)型是B的群體，同樣是100個(gè)。針對于這兩個(gè)群體上的1號染色體上的幾個(gè)標(biāo)記，特異性擴(kuò)增。我們發(fā)現(xiàn)，A和B兩個(gè)表現(xiàn)型的相同的某個(gè)標(biāo)記，擴(kuò)增出來的條帶大小是不一樣的，這樣我們就認(rèn)為這個(gè)標(biāo)記和我們控制這個(gè)表現(xiàn)型的基因，是連鎖的。通過以上方法，我們就能找到距離我們想要的目的基因最近的兩條標(biāo)記。如果這兩個(gè)群體足夠大，例如10000個(gè)樣本，你會發(fā)現(xiàn)有一部分的A性狀的個(gè)體，會有B性狀大部分個(gè)體的條帶，而B中也是如此，這樣的差異就是這個(gè)標(biāo)記和目的基因的不共同交叉互換而形成的。通過三點(diǎn)測驗(yàn)，就能計(jì)算兩者不共同重組的重組率，從而確定這個(gè)基因和兩個(gè)最近距離標(biāo)記之間的遺傳距離。

27、這時(shí)候，在這兩個(gè)標(biāo)記之間存在這個(gè)基因(jyn)，就是一定的了，我們?nèi)∧骋粋€(gè)帶有此基因的樣品，進(jìn)行染色體步移。染色體步移，就是一步一步來確定這個(gè)(zh ge)基因的。例如他們兩個(gè)之間有10Kb那么(n me)長的區(qū)段，首先我針對前5Kb設(shè)計(jì)引物，克隆這部分基因，然后把它連入載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染入不帶有這個(gè)基因的樣本，如果樣本表現(xiàn)型發(fā)生了變化，就說明，這個(gè)基因存在于這前5Kb中，如果沒有變化，則是剩下的5Kb或者，這個(gè)基因被切斷了。如果是前5Kb，那么我們在縮短到3Kb,繼續(xù)重復(fù)試驗(yàn)，直到縮短到不能再短為止，就找到了這條基因，這就是染色體步移技術(shù)。通過以上方法，我們就找到了帶有這種性狀的基因，完成了這個(gè)實(shí)

28、驗(yàn)。5.6蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)5.61 雙向電泳技術(shù)顧名思義，雙向電泳，就是兩個(gè)方向的電泳，一個(gè)橫向，一個(gè)縱向，從而建立了二維分離蛋白的一個(gè)圖像。橫向上，通過SDS電泳技術(shù)，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小不同而進(jìn)行，在這個(gè)方向上，距離最初越近，蛋白質(zhì)的=分子量大小越大?？v向上，設(shè)置PH梯度，讓蛋白質(zhì)根據(jù)等電點(diǎn)不同，停留在各自的等電點(diǎn)上，從而能夠雙向分離蛋白，得到更加純正的蛋白。5.62 蛋白質(zhì)印跡法western blot免疫印跡法，是表達(dá)水平檢測的一種很好的方法。首先制備蛋白樣品，然后用SDS蛋白電泳，分離蛋白樣品。此時(shí)，蛋白質(zhì)根據(jù)自己的分子量大小不同，排列在蛋白膠上，我們用硝酸纖維素膜，通過電轉(zhuǎn)

29、移，讓帶有電荷的蛋白質(zhì)，平行轉(zhuǎn)移到能夠結(jié)合蛋白質(zhì)的硝酸纖維素膜上。這時(shí)候，蛋白膠上的蛋白就被轉(zhuǎn)移了，但是蛋白膠上，并不是所有的位置都有蛋白，也就是說電轉(zhuǎn)膜以后，硝酸纖維素膜上有大片區(qū)域沒有蛋白。這時(shí)候，我們用價(jià)格便宜的奶粉來結(jié)合膜上空白的部分，讓硝酸纖維素膜上不能再非特異性結(jié)合蛋白。下一步，我們對于我們的蛋白結(jié)合特異性的一抗，這個(gè)抗體有兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，一個(gè)特異性結(jié)合我們所需要的蛋白樣品，一個(gè)特異性結(jié)合二抗。由于硝酸纖維素膜上已經(jīng)沒有可以結(jié)合蛋白的位置，所以一抗只能結(jié)合在目的蛋白上。此后，我們要洗去未結(jié)合的一抗，因?yàn)橐豢钩颂禺愋越Y(jié)合以外，還有可能通過電荷吸附或者分子間作用力，并不牢固的存在于膜

30、上，通過洗除，我們能夠降低背景，排除非特異性結(jié)合所謂背景，就是本不該著色的部分。按正說，除了特異性結(jié)合一抗的位點(diǎn)以外，沒有地方能夠結(jié)合二抗，但如果一抗沒有洗除，那么二抗結(jié)合在本不該有的地方，背景顏色就被加深了。如果距離目的片段很近，有可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。洗去一抗以后(yhu)，我們特異性結(jié)合二抗。二抗特異性結(jié)合在一抗上，帶有熒光標(biāo)記。再洗一次二抗以后，就可以進(jìn)行曝光或者顯色了。曝光顯色以后就能夠半定量鑒定蛋白的量，與對照組對比，就能夠得到(d do)表達(dá)水平上的變化。如果想要得到完全的定量結(jié)果，可以(ky)通過軟件實(shí)現(xiàn)。這里需要解釋的是，為什么要用一抗和二抗來顯示熒光而不直接一抗制成熒光一抗。首

31、先，第一點(diǎn)，熒光一抗的成本就很高了，所以大都不用。第二點(diǎn)，一抗要求是對于目的蛋白特異，而所需要研究的蛋白基因太多，特異一抗就會有很多，但是一抗的另一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即結(jié)合二抗的結(jié)構(gòu)域，只需要幾個(gè)，這樣更利于熒光二抗的商品化。第三點(diǎn)，也是最重要的一點(diǎn)，在免疫學(xué)上，蛋白熒光具有級聯(lián)放大的效應(yīng)，一抗結(jié)合二抗后所產(chǎn)生的熒光，比熒光一抗熒光強(qiáng)34倍，這樣反應(yīng)更加靈敏，更加準(zhǔn)確。因?yàn)橥ㄟ^SDS作用，蛋白已經(jīng)變性，選擇一抗的時(shí)候需要考慮他能夠結(jié)合變性后的蛋白。5.63 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析技術(shù)質(zhì)譜部分在本科階段一般不考，而研究生階段也不作為重點(diǎn)。蛋白質(zhì)譜通過激光反應(yīng)激發(fā)蛋白電子，從而離子化蛋白肽段。激發(fā)后，高能汽化

32、肽分子，根據(jù)其飛行島檢測器的時(shí)間，判定它的分子量。本人在此不詳細(xì)介紹。6.1 基因表達(dá)研究技術(shù)6.11 基因表達(dá)系列分析技術(shù)這個(gè)技術(shù)好難啊，筆者不得不這樣說。SAGE測定的是轉(zhuǎn)錄組，定量分析全基因組的轉(zhuǎn)錄。首先，將提取到的樣品RNA反轉(zhuǎn)錄為雙鏈cDNA,同前文所敘述過的方法，用4堿基內(nèi)切酶切開，形成256BP的片段，并得到3端的片段，將他們分成兩份。這里要介紹2個(gè)問題，第一個(gè)，書上有句話很重要，任何長度超過910個(gè)堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。從而這里用的4堿基內(nèi)切酶，即錨定酶AE，的識別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)是不一致的，如書上的例子，它識別GGGAC切的卻是后面的未知序列。切完以后

33、，必然足夠910個(gè)堿基。也就是說，這個(gè)片段能夠代表一種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。即mRNA.第二個(gè)，為什么要分成兩份，是為了用連接子1和2，共同進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如果只有一份，只能連入一個(gè)連接子，因?yàn)檫B接子能夠特異識別的只有錨定酶切割的那一端，如果只有一個(gè)連接子，那么就是說，只有一種PCR引物，可能會導(dǎo)致PCR效率降低。 下一步，連接(linji)接頭連接子1和2 ，這兩個(gè)連接子，實(shí)際上就是(jish)兩段不同的DNA序列，以后(yhu)方便作為PCR引物使用。用標(biāo)簽酶2再切一次，這一步是方便識別標(biāo)簽，進(jìn)行多一次的驗(yàn)證。因?yàn)闆]人能保證酶切完完整整的全切得是你所需要的片段，另外有同一種標(biāo)簽的可能性，但由于總量的m

34、RNA極大，所以兩種標(biāo)簽全部重復(fù)的可能性就很小了，能夠排除很大的干擾成分。下一步是末端補(bǔ)平，補(bǔ)平以后能夠方便用平末端連接酶進(jìn)行連接，從而讓連接子1和2能夠形成一條DNA片段。這一步中需要說明的是，連接子1的片段可能和連接子1的片段末端相連，但是理論上來說這樣的片段是可以擴(kuò)增的，因?yàn)閮啥说囊锸嵌及?。這時(shí)候，需要說明為什么要進(jìn)行PCR，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量雖然貌似很多，但是對于需要進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析的我們，量就很少了，為了方便計(jì)算機(jī)分析，我們進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。但是根據(jù)模板量不同，即cDNA數(shù)量不同，PCR效率也會有所不同，這樣導(dǎo)致了差異的放大，量的差別更大，卻不準(zhǔn)確了。我們一般需要的計(jì)算機(jī)分析的數(shù)據(jù)，是

35、半定量的，只要知道各種比例的分布即可，所以差異的放大有利于我們的判斷，雖然和原來的量有所區(qū)別。PCR過后用錨定酶酶切掉兩端的引物，并連接，這樣，所有標(biāo)簽全部因?yàn)殄^定位點(diǎn)而串聯(lián)成為一條，我們把它連入載體就能夠測序了。測序完成以后，我們用標(biāo)簽進(jìn)行比對，從而判定各種產(chǎn)物的量。6.1.2 RNA的選擇性剪切技術(shù)這個(gè)技術(shù)其實(shí)就是PCR方法驗(yàn)證mRNA差異的一種方法。不同細(xì)胞中不但mRNA的表達(dá)量是不同的，他們的本身也有可能不同。就是說，從同一基因片段轉(zhuǎn)錄而來的樣本，他們切除不同的內(nèi)含子，甚至拋棄部分外顯子進(jìn)行拼接，經(jīng)過選擇性剪切，形成了不同的mRNA產(chǎn)物。提取不同的組織樣品，針對于全長cDNA設(shè)計(jì)引物，

36、發(fā)現(xiàn)不同組織中產(chǎn)物大小不一致，從而看出差異來自選擇性剪切。6.13原位雜交技術(shù)用核酸探針經(jīng)過放射自顯影(xin yng)技術(shù)來觀察。之所以成為 原位雜交，是將細(xì)胞固定后，在原來位置(wi zhi)上觀察探針?biāo)幬恢门卸ê藘?nèi)核外的位置。6.14基因的定點(diǎn)(dn din)突變技術(shù)本部分僅介紹PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變。重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變，是很常用的突變方法。當(dāng)我們獲取了一條片段時(shí)，想要針對于某幾個(gè)bp的片段進(jìn)行突變，便可以用這種方法。首先有如下完整序列我們想要突變其中的位點(diǎn)，這個(gè)位點(diǎn)的長度我們暫定為10bp，我們?nèi)缦逻x取引物兩端引物為普通兩頭引物，包含酶切位點(diǎn)，而中間為突變引物不包含酶切位點(diǎn)。突變引

37、物中，大部分序列是匹配的，而所需要突變的10bp是完全不匹配的，遵循A-C,T-G互換原則。突變引物總長度要求和正常引物類似，在1838bp之間，根據(jù)所突變位點(diǎn)大小不同而不同。重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)突變就是先分別用一條普通引物和一條突變引物克隆一半的鏈，再用兩條鏈互為模板與引物，進(jìn)行退火延伸因?yàn)閴A基互補(bǔ)配對當(dāng)突變引物兩頭都能結(jié)合，而中間不能結(jié)合的時(shí)候，仍然是可以退火的，這樣，經(jīng)過第一輪PCR，位點(diǎn)就被克隆出來（引物延伸出一條鏈），當(dāng)進(jìn)行第二輪PCR，突變引物會自動尋找最適合他的模板，就是突變后的那條序列了。經(jīng)過30+次的擴(kuò)增，突變鏈的量就很大了。之后(zhhu)以兩條突變鏈互為模板，進(jìn)行PCR，延

38、伸成功后就能得到(d do)突變后的模板， 再用兩頭(lingtu)的普通引物進(jìn)行pCR擴(kuò)增，就能夠得到新的突變鏈。重疊延伸的功能不僅限于突變，還可以克服高級結(jié)構(gòu)，PCR較長片段，至于PCR的各種方法，需要讀者自己慢慢體會，掌握PCR原理，就能夠自己開發(fā)新方法。6.2基因敲除技術(shù)6.21基本原理：1完全基因敲除：完全基因敲除通過打靶載體進(jìn)行同源置換，將目的基因功能區(qū)從基因組中置換到載體上，而載體上沒有相應(yīng)的表達(dá)原件，從而導(dǎo)致目的基因失活。類似于前文所講的gateway大規(guī)?？寺∷玫腖-R反應(yīng)。完全基因敲除添加負(fù)向選擇標(biāo)記，因?yàn)榇虬休d體不見得只置換目的基因，還有可能置換錯(cuò)誤，或者置換區(qū)域不對。

39、當(dāng)載體由于差錯(cuò)將載體上的負(fù)向選擇標(biāo)記插入基因組并進(jìn)行了表達(dá)，那么細(xì)胞就會死亡。通過上述敘述，大家都明白，其實(shí)完全基因敲除會有很大的偶然性，因?yàn)檩d體剛好不置換目的片段又置換了負(fù)向選擇標(biāo)記的幾率并不大，所以假陽性的概率較高，這樣的基因組包含了未敲除的基因，也不包含負(fù)向選擇標(biāo)記。6.2條件性基因敲除敲除某些基因具有致死性，從而研究無法進(jìn)行，所以在培養(yǎng)過程中，這些基因仍需要表達(dá)，當(dāng)開展實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，在進(jìn)行基因敲除。將loxp位點(diǎn)和neo標(biāo)記插入到目的基因內(nèi)含子中，表達(dá)的時(shí)候仍然會被切除，從而無影響。通過neo標(biāo)記即可篩選相應(yīng)中標(biāo)細(xì)胞。當(dāng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，將這個(gè)基因與EII-cre細(xì)胞雜交，重組酶就會把lo

40、p位點(diǎn)之間的目的基因片段刪除，就可以進(jìn)行研究了。6.22動物基因敲除技術(shù)圖示，前半部分為完全基因敲除，不再贅述，從顯微注射開始，顯微注射是將細(xì)胞植入胚胎，這樣胚胎長成的時(shí)候，既包含了正常細(xì)胞，也包含了敲除細(xì)胞，從而成長為黑白嵌合體。嵌合體和白色小鼠回交，產(chǎn)生后代中即會有黑色也會有白色，通過表型鑒定（看黑色還是白色），判定插入率。基因捕獲(bhu)法很簡單，看圖就能明白，不做贅述。6.23T-DNA插入(ch r)失活技術(shù)T-DNA插入失活最重要(zhngyo)的就是記住他無專一整合位點(diǎn)，需要大量突變株作為樣本。6.3蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)6.31酵母單雜交研究DNA及蛋白質(zhì)之間的相互作用。酵母單雜交主要是通過構(gòu)建融合表達(dá)蛋白進(jìn)行的。他將目的蛋白序列和轉(zhuǎn)錄起始原件的序列放到同一個(gè)載體，同一個(gè)啟動子之后，這樣就能夠?qū)蓚€(gè)蛋白變成一個(gè)蛋白表達(dá)出來。測定的是目的蛋白和圖中順式作用元件（DNA序列）的關(guān)系，他將DNA序列插入到啟動子前面，然后將融合蛋白序列的載體導(dǎo)入酵