酶聯(lián)免疫吸附劑測定ELISA檢測技術

1、酶聯(lián)免疫吸附劑測定ELISA檢測技術1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）用于IgG定量測定的文章，使得1966年開始用于抗原定位的酶標抗體技術發(fā)展成液體標本中微量物質的測定方法。這一方法的基本原理是：使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原

2、抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。ELISA的原理ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的

3、其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA的類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為結合物（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測

4、的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：2.2.1雙抗體夾心法測抗原雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1） 將特異性抗體與固相載體聯(lián)結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種

5、蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆 克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾

6、心復合物。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆 克隆抗

7、體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現(xiàn)出假陽性反應。采用F（ab）或Fab片段作酶結合物的試劑，

8、由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。2.2.2 雙抗原夾心法測抗體反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。2.2.3 間接法測

9、抗體間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標抗抗體?？捎妹笜丝谷薎g以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。4）加底

10、物顯色本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被

11、效果。間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:401:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。 2.2.4 競爭法測抗體當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結

12、合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。2.2.5 競爭法測抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行

13、測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。2.2.6 捕獲包被法測抗體IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多采用捕

14、獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。類風濕因子（RF）同樣能干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。2.2.7 ABS-ELISA法ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略

15、語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加

16、酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多方法類型和操作步驟ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。 （一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常

17、用的方法，操作步驟如下：1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據(jù)顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。（二）雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如

18、應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆 克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆 克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單 HYPERLINK /Search.asp?Field=Title&ClassID=&keyword=克隆 克隆抗體的應用使測

19、定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低于實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現(xiàn)假陰性結果。（三）間接法測抗體間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免

20、疫球蛋白及血清中的雜質由于不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 （四）競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。（2）待測管中

21、加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由于結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。（五）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。

22、因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。（六）應用親和素和生物素的ELISA親和素是一種糖蛋白，

23、可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合?，F(xiàn)在使用更多的是從鏈霉菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學方法制成的衍生物，生物素羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩(wěn)定。由于1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與

24、ELIS偶聯(lián)起來，就可大提高ELISA的敏感度。親和素生物素系統(tǒng)在ELISA中的應用有多種形式，可用于間接包被，亦可用于終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規(guī)ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然后連接親和素酶結合物，以放大反應信號。ELISA 普遍用作非放射性同位素的成鍵化驗. 在這種方法中, 通常標準配體是固定的, 通過加入溶液相受體或蛋白質來使之成鍵. 通過加入與受體特異性反應的抗體來定量成鍵的受體, 而且

25、最初抗體的量以加入第二種能顯色的抗體測量. 第二種抗體能識別抗體的末端, 在其末端的堿性磷酸酯或過氧化物酶等與酶發(fā)生反應, 從而使溶液顯色. 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)1. ELISA的原理 ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定

26、的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。2. ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：（1）固相的抗菌素原或抗體，即免疫吸附劑（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為結合物（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：2.2.1 雙抗

27、體夾心法測抗原 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：1）將特異性抗體與固相載體聯(lián)結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。2）加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。 洗滌除去其他未結合物質。3）加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。4）加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。 在臨床檢驗中，此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用

28、于包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物。類同于沉淀反應中抗原過剩的后帶現(xiàn)象，此時反應后顯色的吸光值（位于抗原過剩帶上）與標準曲線（位于抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低于實際的含量，這種現(xiàn)象被稱為鉤狀效應（ho

29、ok effect），因為標準曲線到達高峰后呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現(xiàn)假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。 雙抗體夾心法測抗原的另一

30、注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現(xiàn)出假陽性反應。采用F（ab）或Fab片段作酶結合物的試劑，由于去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。 雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。2.2.2 雙抗原夾心法測抗體 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相

31、應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據(jù)抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。2.2.3 間接法測抗體 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，

32、血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。3）加酶標抗抗體?？捎妹笜丝谷薎g以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。4）加底物顯色 本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。 間接法成功的關鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.

33、Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應?？乖幸膊荒芎信c酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標本須先行

34、稀釋（1:401:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。2.2.4 競爭法測抗體 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺于陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然后再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELIS

35、A一般采用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌后再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應?？笻Be的檢測一般采用此法。2.2.5 競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。2.2.6 捕獲包被法測抗體 IgM抗體的檢測用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定I

36、gM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，后者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然后加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式見圖。 類風濕因子（RF）同樣能

37、干擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。2.2.7 ABS-ELISA法 ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法制成的衍生物素-羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩(wěn)定。由于一個親和素可與4個

38、生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯(lián)親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然后再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為堿性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。 在臨床檢驗中一

39、般采用商品試劑盒進行測定。前文（2.2）已述，ELISA中有三個必要的試劑：免疫吸附劑、結合物和酶的底物。 完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標記的抗原或抗體（結合物）；（3）酶的底物；（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；（5）結合物及標本的稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應終止液。3.1 免疫吸附劑 已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（28）干燥的條件下一般可保存6個月。有些不完整的試盒，僅供應包被用抗原或抗體，檢測人員需自行包被。以下簡述固相載體和包被過程。3.1.1 固相載體 固相載體在

40、ELISA測定過程中作為吸附劑和容器，不參與化學反應?？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強的吸附蛋白質的性能，抗體或蛋白質抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學活性，加之它的價格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。 ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專用于EILSA的產品稱為ELISA板，國際上標準的微量滴定板為812的96孔式。為便于作少量標本的檢測，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標準ELISA板相同。ELISA板的特點是可以同時進行大量標本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結果?，F(xiàn)

41、在已有多種自動化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標準化極為有利。聚苯乙烯經射線照射后，其吸附性能特別是對免疫球蛋白的吸附性能增加，應用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增多，但用于間接法測抗體時空白值較大。 良好的ELISA板應該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產品的質量差異很大，因此，每一批號的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內加入適當稀釋

42、度的酶標抗人IgG抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應后，分別測每孔溶液的吸光度?？刂品磻獥l件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計算全部讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù)之差，應小于10%。 與聚苯乙烯類似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點為質軟板薄，可剪割，價廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對蛋白質的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣，可應用如下的試驗：用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本，將它們進行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預定的ELISA操作步驟進行測定，然

43、后比較結果。在哪一種載體上陽性結果與陰性結果差別最大，這種載體就是這一ELISA測定項目的最合適的固相載體。 在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結合位點的暴露面處于最佳反應狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應往往更為靈敏。小珠的另一特點是更易于使洗滌徹底，使用特殊的洗滌器，使小珠在洗滌過程中滾動淋洗，其洗滌效果遠較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難

44、度較大，小珠的均一性較差。 小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標本的反應量也相應增加。板式及珠式ELISA的標本量一般為100-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應體積，標本反應量的增加有助于試驗敏感性的提高。小試管還可以當作比色杯，最后直接放入分光光度計中比色。 也有應用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點是表面積極大，反應在懸液中進行，其速率與液相反應近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應后用磁鐵的吸引進行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。3.1.2 包被的方式 將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原

45、或抗體結合到固相載體表面的過程。蛋白質與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結合的，靠的是蛋白質分子結構上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用于。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質的分子量、等電點、濃度等的影響。載體對不同蛋白質的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質較小分子蛋白質通常含有更多的疏水基團，故更易吸附到固相載體表面。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力，其聯(lián)結多發(fā)生在Fc段上，抗體結合點暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當抗原決定簇存在于或鄰近于疏水區(qū)域時，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包

46、被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對該抗原的特異抗體作預包被，其后通過抗原抗體反應使抗原固相化。此間接結合在固相上的抗原遠離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質較多的抗原也可采用捕獲包被法（見2.2.4），試驗的特異性、敏感性均由此得以改善，重復性亦佳。間接包被的另一優(yōu)點是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測抗DNA抗體時，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結合?？蓪⒕郾揭蚁┌逑冉涀贤饩€照射

47、（例如30W紫外燈，75cm照射12小時），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質，如聚賴氨酸、魚精蛋白等作預包被，也可提高核酸的結合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴大應用于各種抗原物質的定量測定。 脂類物質無法與固相載體結合，可將其在有機溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質自然干固在固相表面?？剐牧字贵w的ELISA試劑一般采用這種包被方式。3.1.3 包被用抗原 用于包被固相載體的抗原按其來源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原可

48、取自動物組織、微生物培養(yǎng)物等，須經提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提?。?。重組抗原是抗原基因在質粒體中表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質粒體。重組抗原的優(yōu)點是除工程菌成份外，其他雜質少，而且無傳染性，但純化技術難度較大。以大腸桿菌為質粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應中可出現(xiàn)假陽性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點是能用基因工程制備某些無法從天然材料中分離的抗原物質。例如丙型肝炎病

49、毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達而制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質抗原分子的某一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無關蛋白質如牛血清白蛋白質（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結合到固相載體表面。應用多肽抗原的另一注意點為他僅能檢測與其相應的

50、抗體。一種蛋白質抗原往往含有多個不同的能引起抗體產生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應。另外，某些微生物發(fā)生變異時往往發(fā)生抗原結構變化，在這種情況下，用個別多肽抗原進行包被可引起其他抗體的漏檢。3.1.4 包被用抗體 包被固相載體的抗體應具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質（即便是極微量的），在抗血清中將出現(xiàn)雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗的特異性?？寡宀荒苤苯佑糜诎?，應先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和Sephadex凝膠過濾法。一般經硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純

51、化的IgG性質不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗的敏感性，則可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當稀釋后直接包被，必要時也可用純化的IgG。應用單抗包被時應注意，一種單抗僅針對一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。3.1.5 包被的條件 包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據(jù)試驗的特點和材料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH78的Tris-HCL緩沖液作為

52、稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8冰箱中放置過夜，37中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的最適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協(xié)調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。3.1.6 封閉 封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程?？乖蚩贵w包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用

53、10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。 封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的（

54、見2.2.2）。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。3.2 結合物 結合物即酶標記的抗體（或抗原），是ELISA中最關鍵的試劑。良好的結合物應該是既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當?shù)姆肿颖壤?，在結合試劑中應盡量不含有或少含有游離的（未結合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 3.2.1 酶 用于ELISA的酶應符合以下要求：純度高，催化反應的轉化率高，專一性強，性質穩(wěn)定，來源豐富，價格不貴，制備成酶結合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標本中不存在相同的酶。另外，它的相應

55、底物易于制備和保存，價格低廉，有色產物易于測定等。 在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 國產ELISA試劑一般都用HRP制備結合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結合而成，是一種卟啉蛋白質。主酶無色糖蛋白在275nm波長處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長處有最高吸收峰。HRP的純度用RZ

56、(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ?.0。 HRP除符合上述的ELISA中標記酶的要求外，更有價格低廉和性質較穩(wěn)定的特點。值得注意的是，在選用酶制劑時，除其純度RZ外，更應注意酶的活力。高純度的酶如保存不當，活力也會降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對底物作用后生成產物量的測定進行試驗。 國外很多ELISA試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標記酶。常用的AP有兩個來源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的AP分子量為80000，酶作用的最適合pH為8.0；

57、用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，最適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價格昂貴，制備結合物所得率也較HRP低。3.2.2 抗原和抗體 制備結合物時所用抗體一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結時其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進行反應，實驗結果本底淺淡。如用F(ab)2進行標記，則更可避免標本中RF的干擾。在ELISA中用酶標抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.3 結合物的制備 酶標記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。 （1

58、）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與蛋白質的氨基通過它而聯(lián)結。堿性磷酸一般用此法進行標記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應后即得酶標記抗體。 ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡便、有效（結合率達60%-70%）和重復性好等優(yōu)點。缺點是交聯(lián)反應是隨機的，酶與抗體交聯(lián)時分子間的比例不嚴格，結合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結。兩步法的產物中絕大部分的酶與蛋白質是以1:1的

59、比例結合的，較一步法的酶結合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。 （2）過碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。酶標記物按克分子比例聯(lián)結，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡便有效，一般認為是HRP最可取的標記方法，但也有人認為所有試劑較為強烈，各批實驗結果不易重演。 按以上方法制備的酶結合物一般都混有未結合物的酶和抗體。理論上，結合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測定，因經過徹底洗滌，游離酶可被除去，并不影響

60、最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會與酶標抗體競爭相應的固相抗原，從而減少了結合到固相上的酶標抗體的量。因此制備的酶結合物應予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應用。硫酸銨鹽析法最為簡便，但效果并不理想，因為此法只能去除留在上清中的游離酶，但相當數(shù)量的游離抗體仍與酶結合物一起沉淀而不能分開。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結合物清晰地分成三個部分：游離酶、游離抗體和純結合物而取得最佳的分離效果，但費用較貴。 結合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當?shù)墓ぷ鳚舛?。使用過濃的結合物，既不經濟，又可使本底增高；