材料特性表征：第2節(jié) 光學顯微技術(shù)

1、材料特性表征Characteristic Technique of Materials第二章 光學顯微技術(shù)第一: 組織形貌分析的三個階段第二: 提高光學顯微鏡的分辨率的手段第三：電子顯微鏡的照明光源第四： 掃描探針顯微鏡家族上節(jié)課的重點內(nèi)容一 背景簡介二 光學顯微鏡成像原理三 光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖四 顯微鏡相關(guān)參數(shù)五 樣品制備六 比較重要的顯微鏡 本節(jié)課的重點內(nèi)容1590 荷蘭眼鏡制造商J.Janssen和Z.Janssen父子制作了第一臺復式顯微鏡，盡管其放大倍數(shù)不超過10倍，但具有劃時代的意義。一、背景簡介羅伯特虎克制造的顯微鏡（1665）放大倍數(shù)：140倍 一、背景簡介一、背景簡介觀

2、察了軟木（櫟樹皮)的薄片，第一次描述了植物細胞的構(gòu)造，并首次用拉丁文cella（小室)這個詞來稱呼他所看到的類似蜂巢的極小的封閉狀小室（實際上只是觀察到到纖維質(zhì)的細胞壁)。 一、背景簡介列文虎克和他的顯微鏡（約1680）一生中制作了200多臺顯微鏡和500多個鏡頭。他是第一個看到活細胞的人，觀察過原生動物、鮭魚的紅細胞、牙垢中的細菌等等。一、背景簡介一、背景簡介The microscope illustrated in Figure 5 was manufactured by Hugh Powell and Peter Lealand about 1850. The tripod base p

3、rovided a sturdy support for the microscope, which many people consider the most advanced of its period. 1590年，荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類似顯微鏡的放大儀器。 1610年前后，意大利的伽利略和德國的開普勒在研究望遠鏡的同時，改變物鏡和目鏡之間的距離，得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu)。16731677年期間，列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡。19世紀，高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn)，使顯微鏡觀察微細結(jié)構(gòu)的能力大為提高。 19世紀70年代，德國人阿貝Ernst Abbe奠定了顯微鏡成像的

4、古典理論基礎。1.1 顯微鏡發(fā)展史一、背景簡介一、背景簡介恩斯特卡爾阿貝（Ernst Karl Abbe，1840年1月23日1905年1月14日）德國物理學家、光學家、企業(yè)家。他出生于德國埃森納赫(Eisenach)。格丁根大學博士。1870年任耶拿大學物理學教授。1878年任耶拿天文臺主任。后來恩斯特阿貝加入蔡司公司從事顯微鏡的設計和研究，對顯微鏡理論有重要的貢獻，因此成為卡爾蔡司的合作人。恩斯特阿貝對光學玻璃有奠基的研究。一、背景簡介1884年，恩斯特阿貝和奧托肖特在耶拿創(chuàng)建肖特玻璃廠。1886年，恩斯特阿貝聘請光學設計家保羅儒道夫Dr. Paul Rudolph為光學設計部主任。188

5、8年，卡爾蔡司逝世，恩斯特阿貝成為了蔡司公司的東主。1905年恩斯特阿貝在耶拿逝世，終年64歲。一、背景簡介卡爾蔡司公司（Carl Zeiss AG）是一家制造光學系統(tǒng)、工業(yè)測量儀器和醫(yī)療設備的德國企業(yè)。公司的名稱來源于它的創(chuàng)始人之一-德國光學家卡爾蔡司（1816年-1888年）。它由卡爾蔡司(Carl Zeiss)、恩斯特阿貝(Ernst Abbe)和奧托肖特(Otto Schott)于1846年在耶拿(Jena)建立。由于二戰(zhàn)的關(guān)系，這家公司一度被分裂為兩家公司-卡爾蔡司股份公司(Carl Zeiss AG)和卡爾蔡司耶拿有限公司(VEB Carl Zeiss Jena)，直到1990年重

6、新合并。蔡司是現(xiàn)存最古老的光學產(chǎn)品制造商之一。一、背景簡介Dr. Paul Rudolph憑借其天才的思想，結(jié)合Otto Schott新研制高折射率的玻璃，設計出了這個前所未有的采用四片光學元件的鏡頭。由于其卓越的高解像力，于是獲得了“照相機的鷹眼”的美譽。Tessar在希臘語是Tessares就是四的意思。Tessar鏡頭可能是生產(chǎn)量最大的鏡頭，Carl Zeiss為自己的照相機就生產(chǎn)了幾百萬支。實際上，世界上所有的鏡頭制造商都生產(chǎn)過Tessar鏡頭有些獲得Carl Zeiss授權(quán)，而一些則沒有。1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù)；1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù)；1935年荷蘭物理學家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯

7、顯微術(shù)，他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學獎。 1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，獲得了美國的專利。1967年，Egger和Petran成功地應用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個光學橫斷面。顯微鏡發(fā)展史一、背景簡介二、光學顯微鏡成像原理2.1 衍射的形成物理光學把光視為一種電磁波，具有波粒二像性，即波動性和粒子性。由于光具有波動性質(zhì)，使得光波相互之間發(fā)生干涉作用，產(chǎn)生衍射現(xiàn)像。二、光學顯微鏡成像原理2.1 衍射的形成屏幕上的P1點到狹峰上邊緣的距離和它到狹峰下邊緣的距離之差為一個波長。從狹峰上緣和從狹峰下緣發(fā)出的兩列光波在P1點相互增強，但這兩列光波不過是從連

8、線b上發(fā)出的無數(shù)光波中的一對，其他任意兩列光波到達P1點的波程差均小于一個波長。整個狹峰內(nèi)發(fā)出的光波的累計相干效果，是在P1點兩側(cè)造成一個光強的低谷，P1點位于谷底位置。相反，在P2點處，從狹縫上緣和下緣發(fā)出的光波的波程差1 個波長，P2成為相干增強區(qū)的中心，稱為第一級衍射極大值。二、光學顯微鏡成像原理2.1 衍射的形成 點光源通過透鏡產(chǎn)生的埃利斑第一暗環(huán)半徑,式中n為介質(zhì)折射率，照明光波長，透鏡孔徑半角，M透鏡放大倍數(shù),說明埃利斑半徑與照明光源波長成正比，與透鏡數(shù)值孔徑成反比 由斑點光源衍射形成的埃利斑（a）及其光強分布圖（b）衍射使物體上的一個點在成像的時候不會是一個點，而是一個衍射光斑。

9、如果兩個衍射光斑靠得太近，它們將無法被區(qū)分開來。阿貝成像原理可以簡單地描述為衍射和干涉作用：平行光束受到有周期性特征物體的散射作用形成衍射譜，各級衍射波通過干涉重新在像平面上形成反映物的特征的像2.2 阿貝成像：衍射相干二、光學顯微鏡成像原理2.2 阿貝成像：衍射相干二、光學顯微鏡成像原理對于周期性結(jié)構(gòu)的物體，圖像的形成用阿貝成像原理來解釋。光線通過細小的網(wǎng)孔時要發(fā)生衍射，衍射光線向各個方向傳播，凡是光程差滿足 k=0，1，2，的，互相加強。同一方向的衍射光則成為平行光束。平行光束通過物鏡在后焦面上會聚；形成衍射花樣。衍射花樣上的某個衍射斑點是由不同物點的同級衍射光相干加強形成的；同一物點上的

10、光由于衍射分解，對許多衍射斑點有貢獻。從同一物點發(fā)出的各級衍射光，在產(chǎn)生相應的衍射斑點后繼續(xù)傳播，在像平面上又相互干涉，形成物像物與像之間的相似性 物像是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不讓衍射光通過就不能成像，參與成像的衍射斑點愈多，則物像與物體的相似性愈好。二、光學顯微鏡成像原理物像是由直射光和衍射光互相干涉形成的，不讓衍射光通過就不能成像，參與成像的衍射斑點愈多，則物像與物體的相似性愈好。二、光學顯微鏡成像原理物與像之間的相似性 三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖光學顯微鏡基本結(jié)構(gòu)：1. 照明燈(Lamp)2. 聚光器(Condenser)3. 載物臺和切片夾(Mechanical stage

11、 and specimen retainer)4. 推進器(Mechanical stage adjustment knob)5. 物鏡(Objectives)6. 粗細螺旋(Course and fine focus knob)7. 目鏡(Oculars)8. 照相機等接口(Connection to camera, etc.) 組成光學放大系統(tǒng)照明系統(tǒng)機械和支架系統(tǒng)物鏡光源折光鏡聚光鏡濾光片目鏡三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖物鏡低倍鏡 (8x, 10 x):0.25, 160高倍鏡 (40 x, 45x):0.65, 160/0.17油 鏡 (90 x,100 x

12、):1.25, 160/0.17其中10（40、100） 表示放大倍數(shù)；0.25（0.65、1.25）表示數(shù)值孔徑 （鏡口率）；160（mm）表示鏡筒長度；0.17（mm）表示要求蓋玻片的厚度 光學顯微鏡的極限放大是2000倍三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖目鏡的作用是把物鏡放大的實像再放大一級，并把物像映入觀察者的眼中，實質(zhì)上目鏡就是一個放大鏡。顯微鏡的分辨率能力是由物鏡的數(shù)值孔徑所決定的，而目鏡只是起放大作用。對于物鏡不能分辨出的結(jié)構(gòu)，目鏡放的再大，也仍然不能分辨出。目鏡 7，8 “5，10” 。光學顯微鏡的極限放大是2000倍三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖聚光鏡 2聚光鏡裝在載物臺的下方。小型

13、的顯微鏡往往無聚光鏡，在使用數(shù)值孔徑0.40以上的物鏡時，則必須具有聚光鏡。聚光鏡不僅可以彌補光量的不足和適當改變從光源射來的光的性質(zhì)，而且將光線聚焦于被檢物體上，以得到最好的照明效果。三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖 聚光鏡光欄作用（1）改變聚光鏡的數(shù)值孔徑以便與物鏡的數(shù)值孔徑相匹配，可調(diào)整圖像的分辨率和反差。（2）輔助調(diào)整亮度。清潔工具三、光學顯微鏡的構(gòu)造和光路圖清潔液配方：1份無水乙醇3份乙醚擦拭方法四、顯微鏡的重要光學技術(shù)參數(shù)4.1 數(shù)值孔徑4.2 分辨率4.3 放大率和有效放大率4.4 光學透鏡的像差4.5 其他參數(shù)：焦深、視場寬度、工作距離等4.1 數(shù)值孔徑數(shù)值孔徑（NA）是物鏡前透鏡

14、與被檢物體之間介質(zhì)的折射率（n）和半孔徑角（）的正弦之乘積。 NA= nsin孔徑角是物鏡光軸上的物點與物鏡前透鏡的有效直徑所形成的角度?？讖浇窃酱?，進入物鏡的光通亮就越大，分辨率越高。孔徑角與物鏡的有效直徑成正比，與焦點的距離成反比。根據(jù)阿貝成像原理，衍射光線反映了物體形貌的細節(jié)，因此一個物鏡要反映物體的細節(jié)，必須能夠接受盡量多的高階衍射光線。物鏡接收衍射光線的能力也強烈的依賴于在樣品與鏡頭之間的介質(zhì)。4.1 數(shù)值孔徑介質(zhì)空氣水香柏油溴萘折射率11.331.5151.66數(shù)值孔徑的概念更加能夠有效的描述物鏡的成像能力。 4.1 數(shù)值孔徑NA= nsin4.2 分辨率點光源經(jīng)過光學儀器的小圓孔

15、后，由于衍射的影響，所成的像不是一個點，而是一個明暗相間的衍射圖樣，中央為埃利斑。恰能分辨能分辨不能分辨瑞利判據(jù)：兩埃利斑中心間距等于第一暗環(huán)半徑R。此時, 兩中央峰之間疊加強度比中央峰最大強度低19，因此肉眼仍能分辨是兩個物點的像。 4.2 分辨率樣品上相應的兩個物點間距離r。定義為透鏡能分辨的最小距離，也就是透鏡的分辨本領。4.2 分辨率分辨本領是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定，NA值越大，照明光線波長越短，分辨率就越高。普通光線的波長為400700nm，因此顯微鏡分辨力數(shù)值0.2m左右，人眼的在明視距離分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數(shù)通常為1000X。提高

16、分辨能力方法：使用低波長光源，增大介質(zhì)n值，增大孔徑角，提高對比度。改變數(shù)值孔徑示意圖介質(zhì)空氣水香柏油溴萘折射率11.331.5151.664.2 分辨率當選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大，即分辨率不夠高時，顯微鏡不能分清物體的微細結(jié)構(gòu)，此時即使過度地增大放大倍率，得到的也只能是一個輪廓雖大但細節(jié)不清的圖像，稱為無效放大倍率。4.3 放大率和有效放大率由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應該是物鏡放大率和目鏡放大率1的乘積： =1顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。4.3 放大率和有效放大率由于經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大，所以顯微鏡總的放大率應該是物鏡放大率和目鏡放大率1的乘積： =1顯微

17、鏡放大倍率的極限即有效放大倍率。4.4 光學透鏡的像差球差像散慧差場曲負畸變正畸變（1）球面像差（簡稱球差）邊緣與中心部分的折射光不能通過會聚相交于一點4.4 光學透鏡的像差解決方法：1 組合透鏡2 控制入射光粗細 犧牲分辨率球面透鏡上，遠離光軸位置進入鏡頭的平行光線（邊緣光線、遠軸光線），入射角大，折射強，在光軸離鏡頭近處形成焦點；而離光軸近處進入鏡頭的平行光線（中心光線、近軸光線）折射弱，在光軸上離鏡頭遠處形成焦點。由于平行光束在光軸上前后分散形成焦點，形成了彌散光斑（一定直徑的模糊像），從而清晰度下降。（2）色像差 由于組成白光的各色光波長不同，折射率不同，因而成像的位置也不同 4.4

18、光學透鏡的像差解決方法：組合透鏡（3）像域彎曲。 垂直于光軸的直立的物體經(jīng)過透鏡后臺形成一彎曲的像面，稱為像域彎曲 像域彎曲是幾種像差綜合作用的結(jié)果 4.4 光學透鏡的像差解決方法：特殊透鏡焦點深度的簡稱，即在使用顯微鏡時，當焦點對準某一物體時，不僅位于該點平面上的各點都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度內(nèi)，也能看得清楚，這個清楚部分的厚度就是焦深。4.5 其他參數(shù)：焦深焦深與物鏡的數(shù)值孔徑及分辨率成反比，物鏡低倍到高倍切換再調(diào)焦，反之則不用。觀察顯微鏡時，所看到的明亮的圓形范圍叫視場 。視場直徑也稱視場寬度，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實際范圍。視場直徑愈大，愈便于觀

19、察。F=FN/ ，F(xiàn)-視場直徑，F(xiàn)N-視場數(shù)（Field Number），-物鏡放大率。 蔡司視場數(shù)是23mm ，用100X的物鏡，其視場直徑是23mm/1000.23mm，就是說把一個0.23mm的線段放在顯微鏡下觀察，線段兩端正好在視野邊緣。 4.5 其他參數(shù)：視場直徑工作距離也叫物距，即指物鏡前透鏡的表面到被檢物體之間的距離。鏡檢時，被檢物體應處在物鏡的一倍至二倍焦距之間。因此，它與焦距是兩個概念，平時習慣所說的調(diào)焦，實際上是調(diào)節(jié)工作距離。 4.5 其他參數(shù)：工作距離數(shù)值孔徑越大的物鏡，工作距離越短，對蓋玻片厚度有一定的要求。國際上規(guī)定，蓋玻片的標準厚度為0.17mm，許可范圍在0.16

20、-0.18mm，在物鏡的制造上已將此厚度范圍的相差計算在內(nèi)。物鏡外殼上標的0.17，即表明該物鏡所要求的蓋玻片的厚度。4.5 其他參數(shù)：工作距離四、顯微鏡的重要光學技術(shù)參數(shù)數(shù)值孔徑 NA= nsin分辨率放大率和有效放大率光學透鏡的像差焦深視場寬度工作距離=1F=FN/5.1 取樣5.2 鑲樣5.3 磨光5.4 拋光5.5 腐蝕五、樣品制備5.1 取樣取樣應選擇有代表性的部位對于軟材料，可以用鋸、車、刨等加工方法；對于硬材料，可以用砂輪切片機切割或電火花切割等方法；對于硬而脆的材料，如白口鑄鐵，可以用錘擊方法；在大工件上取樣，可用氧氣切割等方法。 5.2 鑲樣用專門的鑲樣機，在合適的加熱溫度和

21、壓力下，將試樣鑲嵌在固化的樹脂或塑料基體中。還可以采用機械鑲嵌法，即用夾具夾持試樣。5.3 磨光金相試樣的磨光除了要使表面光滑平整外，更重要的是應盡可能減少表層損傷。每一道磨光工序必須除去前一道工序造成的變形層，而不是僅僅把前一道工序的磨痕除去。手工磨光時，本道工序的磨痕應與上一道工序的磨痕方向垂直，這樣可以使試樣磨面保持平整并平行于原來的磨面。5.4 拋光（1）機械拋光。粗拋，精拋。（2）電解拋光。電解拋光時，在試樣表面上形成一層具有較高電阻的薄膜，試樣凸起部分的膜比凹下部分薄，膜越薄電阻越小，金屬溶解速度越快，從而使凸起部分漸趨平坦。（3）化學拋光?；瘜W拋光的原理與電解拋光類似，是化學藥劑

22、對試樣表面不均勻溶解的結(jié)果。 5.5 腐蝕（1）化學腐蝕。純金屬及單相合金的腐蝕是一個化學溶解的過程。由于晶界上原子排列不規(guī)則，具有較高的自由能，所以晶界易受腐蝕而呈凹溝，使組織顯示出來，若腐蝕較深，則由于各晶粒位向不同，不同的晶面溶解速率不同。兩相合金的腐蝕主要是一個電化學腐蝕過程。（2）電解腐蝕 電解腐蝕所用的設備與電解拋光相同，只是工作電壓和工作電流比電解拋光時小。在微弱電流的作用下各相腐蝕程度不同，因而顯示出組織。DIC原理光路示意圖相差顯微鏡用于觀察無色透明活細胞形態(tài)，分辨細胞輪廓及其結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)。最大的特點是可以觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。DIC可以使被檢物體產(chǎn)生三維立體感覺，觀察效果

23、更直觀，無須特殊物鏡，與熒光觀察配合更好，適合觀察一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作。6.1 微分干涉像差顯微鏡 DIC滑膜細胞的相差拍攝效果圖滑膜細胞相DIC拍攝效果圖普通明場滑膜細胞拍攝效果圖6.1 微分干涉像差顯微鏡 DIC將普通光改變?yōu)槠窆膺M行鏡檢,以鑒別某一物質(zhì)具有單折射性(各向同性)或雙折射性(各向異性)。在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細胞的化學研究。偏光顯微鏡光學原理6.2 偏光顯微鏡偏光顯微鏡光學原理6.2 偏光顯微鏡聚乙烯球晶的偏光顯微鏡照片帶消光同心圓環(huán)的聚乙烯球晶的偏光顯

24、微鏡照片熒光顯微鏡的基本構(gòu)造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發(fā)濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。6.3 熒光顯微鏡熒光顯微鏡是利用一個高發(fā)光效率的點光源，經(jīng)過濾色系統(tǒng)發(fā)出一定波長的光作為激發(fā)光，激發(fā)標本內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結(jié)構(gòu)和功能以及化學成分分析等的研究。透射式熒光顯微鏡落射式熒光顯微鏡6.3 熒光顯微鏡6.3.1 透射式熒光顯微鏡透射式熒光顯微鏡光路原理圖目鏡物鏡吸收濾色鏡暗場聚光鏡激發(fā)濾色鏡汞燈落射式熒光顯微鏡光路原理圖吸收濾色鏡分色鏡物

25、鏡 標 本激發(fā)濾色鏡汞 燈6.3.2 落射式熒光顯微鏡高壓汞燈擁有313, 337, 365, 405, 436, 546, and 577 納米的峰值譜。高壓 Xenon燈有連續(xù)的可見光光譜范圍, 光源強度比較平均。具有多套激發(fā)濾色塊：激發(fā)濾色鏡（Excitation Filter），分光鏡（Dichromatic Mirror），發(fā)射濾色鏡（Emission Filter）。汞燈光譜激發(fā)濾色塊6.3.3 激發(fā)光源及濾色塊6.3.4 常用的染料6.3.5 熒光顯微鏡的缺點6.3.5 熒光顯微鏡的缺點共聚焦原理Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。共聚焦光路原理圖6.4 激光掃描共聚焦顯微鏡 LCSM共聚焦原理計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺