MRC-5體外培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線測定 - 詳細(xì)

1、MRC-5體外培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線測定實驗?zāi)康恼J(rèn)識細(xì)胞接種和傳代培養(yǎng)中細(xì)胞生長增殖規(guī)律。實驗原理在培養(yǎng)接種或每一次傳代培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物都要經(jīng)歷相似的恢復(fù)和生長過程。細(xì) 胞生長曲線反映的是培養(yǎng)細(xì)胞從接種到傳代之前的生長狀況，也是判定細(xì)胞活力的重要 指標(biāo)。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過短暫的懸浮然后貼壁，隨后度過長短不同的潛伏期，緊 接著進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生長，進(jìn)入平臺期，然 后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個過程中細(xì)胞數(shù)目的動態(tài)變化，典型的生長曲線可分為生 長緩慢的潛伏期，斜率較大的指數(shù)生長期，呈平臺狀的平臺期及退化衰亡4個部分。以 培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞的

2、生長曲線坐標(biāo)圖。實驗準(zhǔn)備3.1實驗人員用品工作服、帽子、口罩、手套、肥皂、醫(yī)用手臂消毒桶、0.1%新潔爾滅消毒液；3.2消毒和滅菌用品電爐、高壓蒸汽滅菌鍋、鋁盒、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、移液管、槍頭、洗耳球、 離心管(規(guī)格：1.5mL/5mL/10mL)；3.3藥品和試劑DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液(10%血清)、0.25%胰蛋白酶-0.53Mm EDTA、PBS(-)；3.4細(xì)胞MRC-5人二倍體細(xì)胞；3.5設(shè)備與器材CO2培養(yǎng)箱、離心機(jī)、移液槍(規(guī)格：1000uL、200uL)、二級生物安全柜、 血細(xì)胞計數(shù)板、顯微鏡、記號筆、廢液瓶；實驗步驟4.1細(xì)胞接種4.1.1選擇生長良好的MRC-5人二倍體細(xì)胞，

3、移液管移除原細(xì)胞培養(yǎng)液至廢液瓶中；4.1.2 DPBS潤洗三次，每次5mL；4.1.3吸管吸取1mL胰蛋白酶溶液浸潤培養(yǎng)層細(xì)胞，37C恒溫消化210min；4.1.4用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液4mL終止消化；4.1.5將終止消化后的細(xì)胞懸液用移液管轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心8min，棄上清；4.1.6吸管吸取2mLDMEM細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；4.1.7對細(xì)胞懸浮液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；4.1.8調(diào)整懸浮液的細(xì)胞濃度分別為5X103個/mL(A)、2X104個/mL(B)、5X104個/mL(C)3種不同的細(xì)胞濃度(細(xì)胞理論數(shù)：1.575X 104個)；4.2細(xì)胞培養(yǎng)4.2.1依次將濃度

4、為5X103個/mL(A)、2X104個/mL(B)、5X104個/mL(C)的細(xì)胞懸液 分裝于3個有蓋的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分別按每孔接種1mL，每種濃度各接21孔， 進(jìn)行細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)；4.3細(xì)胞換液細(xì)胞接種培養(yǎng)后，分別按照每間隔3d和5d換液一次。4.3.1吸管吸取細(xì)胞懸液并將其移入1.5mL離心管中，1000r/min離心8min；4.3.2離心后，用移液管將上清液移至廢液瓶；4.3.3吸管吸取1mL新鮮的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，吹打混勻；4.3.4將離心管中的細(xì)胞懸液移入相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中繼續(xù)培養(yǎng)；4.4細(xì)胞生長計數(shù)每隔24小時計數(shù)一次，每次每個濃度各取3孔，細(xì)胞計數(shù)后取平均

5、數(shù)，如此 操作至第7d結(jié)束。4.4.1吸管吸取細(xì)胞懸液于已標(biāo)記好的離心管中吹打混勻；4.4.2微量加樣器取混勻后的細(xì)胞懸液100uL于1.5mL離心管中，加入100uL臺盼蘭混 合均勻，進(jìn)行細(xì)胞染色2min；4.4.3將染色后的細(xì)胞懸液加于已蓋好蓋玻片的血細(xì)胞計數(shù)板的計數(shù)室；4.4.4顯微觀察：100倍的倒置顯微鏡下觀察記錄計數(shù)板4角大方格中的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞 壓邊線時，只記壓上線和左邊線者，將計數(shù)結(jié)果代入下式進(jìn)行細(xì)胞密度計算。細(xì)胞密度：（個/mL） = （4個大方格細(xì)胞總數(shù)/4）X2X1044.5生長曲線繪制以培養(yǎng)時間（d）為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞密度（個/mL）為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線并 按下面的公

6、式計算細(xì)胞倍增時間。也2Td =；-lg Nt lgN0Td：細(xì)胞倍增時間；t :培養(yǎng)時間；Nt： Td時的細(xì)胞數(shù)；N0:接種后細(xì)胞數(shù)。注意事項：在制備細(xì)胞懸液時一定要勻速吹打，混合均勻，防止產(chǎn)生氣泡；計數(shù)前細(xì)胞懸液制備（若細(xì)胞貼壁需進(jìn)行）計數(shù)前，吸除培養(yǎng)孔內(nèi)的培養(yǎng)液，PBS（-）洗3次，加入200uL細(xì)胞消化液，于37C、 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化310min min。用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液800uL終止消化，輕 輕吹打均勻，制成單細(xì)胞懸液。預(yù)實驗：1、細(xì)胞貼壁性驗證制備細(xì)胞懸液（培養(yǎng)液為DMEM，細(xì)胞濃度為：5X104個/mL），吸取5 mL細(xì)胞懸 液于消毒后的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于37C、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，每隔半天觀察 細(xì)胞是否貼壁。2、細(xì)胞濃度調(diào)整：根據(jù)起始濃度進(jìn)行濃度由大到小的濃度依次稀釋，稀釋完成一定要混勻后再分裝。3、細(xì)胞生長情況預(yù)實驗:1mL細(xì)胞懸液離心管另一種細(xì)胞生長曲線測定法：MTT法1 .制備1 mL細(xì)胞懸液?？瞻讓φ找? mL培養(yǎng)基代替細(xì)胞懸液。加入0. 1 mL MTT于37C孵育4 h。使MTT還 原為藍(lán)紫色甲月贊結(jié)晶。加1 mL DTW脫色液，37C至少