利用SeqMan進(jìn)行序列拼接（PPT34頁(yè))

1、利用SeqMan進(jìn)行序列拼接1簡(jiǎn)介DNAStar是分子生物實(shí)驗(yàn)室常用的序列分析軟件。 該軟件由EditSeq， MegAlign，GeneQuest， MapDraw， PrimerSelect， Protean， SeqMan七個(gè)模塊組成，功能主要有：序列的格式轉(zhuǎn)換，序列拼接和重疊克隆群的處理；基因?qū)ふ?；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的查找；多重序列的比較和兩兩序列比較；寡核苷酸設(shè)計(jì)（PCR引物，測(cè)序引物，探針）。2SeqManSeqMan主要用于多序列的拼接，可以將成千上萬(wàn)的序列（最多可以支持64000多序列）裝配成contigs，同時(shí)在拼接前，可以修整質(zhì)量差的序列以及清除自動(dòng)測(cè)序的序列結(jié)果中的污染序列或載

2、體序列。seqman還提供完善的編輯和輸出功能。3Step1:打開Seqman軟件4點(diǎn)擊Add sequences查找并選中要拼接的序列點(diǎn)擊Add按鈕填加填加完后點(diǎn)擊done注：最好用測(cè)序的圖譜（*.abi)盡量不要直接用測(cè)序得到的序列(.seq)Step2:加入你要拼接的序列5Step3:進(jìn)行序列拼接點(diǎn)擊Assemble按鈕12點(diǎn)擊拼接好的contig16Step3:進(jìn)行序列拼接Alignment of contig1 窗口中點(diǎn)擊 左三角顯示序列的測(cè)序圖譜7測(cè)序準(zhǔn)確的峰形圖峰形規(guī)則，一般在序列的中部，如下圖所示8測(cè)序不準(zhǔn)確的峰形圖峰形較亂，很難判斷是哪個(gè)堿基，一般位于序列兩端， 如下圖所示9

3、Step4:查找拼接錯(cuò)誤點(diǎn)擊菜單contig-strategy view可以觀察序列拼接的宏觀圖1勾選Conflicts，可以看見測(cè)序序列中有沖突的地方10標(biāo)尺下面的條帶，顯示了序列的數(shù)量和覆蓋程度。條帶的顏色和厚度代表覆蓋序列的數(shù)量。中間的藍(lán)線表示只有一條鏈被測(cè)序的區(qū)域。出現(xiàn)于contig 兩邊的細(xì)紅線表示這個(gè)區(qū)域只測(cè)過(guò)一次序。11點(diǎn)擊菜單Edit -find conflict或Find Next查找接接中 出現(xiàn)的錯(cuò)誤還可用左下角的快捷按鈕查找錯(cuò)誤的拼接12Step5：修改拼接錯(cuò)誤兩條序列的測(cè)序結(jié)果不一致并明顯一條測(cè)序質(zhì)量好而另一條質(zhì)量差 處理：直接將該處修改為正確的堿基錯(cuò)誤拼接的類型13S

4、tep5：修改拼接錯(cuò)誤2. 兩條序列的測(cè)序結(jié)果不一致并兩條測(cè)序質(zhì)量都比較差 處理：重新測(cè)序或用新的合適引物重新測(cè)定錯(cuò)誤拼接的類型14Step5：修改拼接錯(cuò)誤3. 兩條序列的測(cè)序結(jié)果不一致并明顯兩條測(cè)序質(zhì)量都好 處理：測(cè)序過(guò)程出現(xiàn)問(wèn)題，重新測(cè)定錯(cuò)誤拼接的類型類型315Step6:導(dǎo)出拼接的序列可選擇合適的格式，導(dǎo)出拼接好的序列12316通過(guò)以上幾步我們就能很快將幾個(gè)測(cè)序片段進(jìn)行拼接，大家可以拿著自己的序列試試!當(dāng)然如果兩個(gè)測(cè)序片段的拼接片段太短可能利用默認(rèn)的參數(shù)不能完成拼接，大家可以試 著修改一下拼接參數(shù)試試! 如降低Match size 及Minimum Match Percentage的值!

5、1718SeqMan進(jìn)階手工及自動(dòng)去除末端消除載體或污染的序列網(wǎng)絡(luò)比對(duì)下載同源相似序列19手動(dòng)修改序列末端SeqMan根據(jù)trace數(shù)據(jù)的質(zhì)量和載體序列在裝配之前可以自動(dòng)地進(jìn)行末端修整。然而有時(shí)候修改的程度難以掌握，下面我們將用手工的方法找回修整過(guò)的末端。20手動(dòng)修改為了區(qū)分修整過(guò)和沒(méi)有修整過(guò)的數(shù)據(jù)，我們給修整過(guò)的數(shù)據(jù)加一個(gè)有顏色的背景。選擇菜單ProjectParametersEditing Color打開下面的對(duì)話框。確定use consensus match color和use other color已被選中。21手動(dòng)修改修整完畢后 Alignment View 中在序列的左邊會(huì)有一個(gè)黑

6、色的垂直棒，右邊有一個(gè)小的黑三角形。要找回修整去掉的序列末端，只需把垂直棒向序列的兩端拖動(dòng)即可，以前修整去掉的序列有明亮的黃色背景。22Pre-Assembly Options 操作及序列裝配在拼接前面，可以將所要拼接的片段中清除載體和污染序列，優(yōu)化裝配順序，設(shè)定片段末端和標(biāo)記重復(fù)序列23去除載體序列24去除載體序列25去除載體序列seqman在拼接前，有-點(diǎn)擊Unassembled Sequences窗口的右上角的“options“按鈕選擇相應(yīng)功能。默認(rèn)設(shè)定Trim sequence ends，scan for vector，optimize sequence assembly order.

7、。26去除載體序列單擊 Scan All按鈕，將出現(xiàn)一個(gè)report窗口?，F(xiàn)在載體欄顯示：載體名字前都有一個(gè)檢測(cè)通過(guò)的標(biāo)志，說(shuō)明Janus 載體在全部14 序列中都已經(jīng)檢測(cè)到了。單擊assemble按鈕，進(jìn)行序列拼接。27查看末端修整和載體序列去除細(xì)節(jié)報(bào)告選擇Project 菜單的Trim Report打開Trim report窗口。28查看修整序列前后的跟蹤數(shù)據(jù)右鍵選擇6 號(hào)樣本，然后Show Original Trace Data,打開Trace：Sample 6.abi 窗口從 5末端起變淡的部分是載體序列，將不會(huì)用于序列裝配，故被清除。垂直的黑棒出現(xiàn)于修整和未修整的序列之間，根據(jù)需要拖動(dòng)垂直黑棒，可以調(diào)整用于裝配的序列末端。29自定義載體序列點(diǎn)擊Vector Catalog選項(xiàng)自定義實(shí)驗(yàn)室常用的載體序列1、掃描載體插入位