食源性致病菌血清學(xué)診斷技術(shù)ppt課件

1、食源性致病菌血清學(xué)檢驗技術(shù)福建省疾病預(yù)防控制中心馬群飛內(nèi)容一、血清學(xué)檢驗的概念二、血清學(xué)檢驗的類型三、國家規(guī)范運用的血清學(xué)檢驗技術(shù)四、血清學(xué)檢驗質(zhì)量控制根本概念：血清血液凝固析出的淡黃色透明液體。血液放入試管中，不加抗凝劑，那么血液迅速凝固，構(gòu)成膠凍。凝血塊收縮，其周圍析出血清，也可于凝血后經(jīng)離心獲得。在凝血過程中，纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成纖維蛋白塊，所以血清中無纖維蛋白原，這一點是與血漿最大的區(qū)別。而在凝血反響中，血小板釋放出許多物質(zhì)，各凝血因子也都發(fā)生了變化。這些成分都留在血清中并繼續(xù)發(fā)生變化，如凝血酶原變成凝血酶，并隨血清存放時間逐漸減少以致消逝。這些也都是與血漿區(qū)別之處。但大量未參與凝血反響的

2、物質(zhì)那么與血漿根本一樣。血清蛋白為防止抗凝劑的干擾，血液中許多化學(xué)成分的分析，都以血清為樣品。 血清學(xué)檢驗的概念利用抗原-抗體反響的顯著特異性，進展細菌的鑒別和血清學(xué)定型，已有半個多世紀的歷史。細菌菌體或鞭毛等抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。 血清學(xué)檢驗的概念體外抗原抗體反響中的抗體主要來源于血清，其檢測多以血清為實驗資料，故體外抗原抗體反響亦稱為血清學(xué)反響serologic reaction或血清學(xué)實驗、血清學(xué)檢驗。血清學(xué)檢驗的概念血清學(xué)檢驗指根據(jù)抗原與相應(yīng)的抗體在適宜的條件下，能在體外發(fā)生特異性結(jié)合的原理，在體外用知抗體或抗原檢測抗原或抗體。血

3、清學(xué)檢驗是微生物學(xué)檢驗的重要方法之一。也是細菌、病毒性疾病診斷和病原菌鑒定的重要手段之一。血清學(xué)反響的普通特點1抗原與抗體的結(jié)合具有高度特異性，但當(dāng)兩種不同抗原分子上有共同抗原決議簇存在時，那么與抗體結(jié)合時可出現(xiàn)交叉反響。2抗原與抗體結(jié)合是分子外表的結(jié)合。兩者的結(jié)合相當(dāng)穩(wěn)定，但是可逆的，在一定條件下可發(fā)生解離，解離后的抗原、抗體性質(zhì)不變。3抗原、抗體的結(jié)合按一定比例，只需在比例適當(dāng)時才會出現(xiàn)可見反響。假設(shè)抗原、抗體比例不適宜，就會有未結(jié)合的抗原或抗體游離于上清液中，不能構(gòu)成大塊免疫復(fù)合物，故不能呈現(xiàn)可見反響。4血清學(xué)反響可分兩個階段進展，但其間無嚴厲界限。在第一階段，抗原和抗體特異性結(jié)合，此階

4、段反響很快，幾秒鐘或幾分鐘即可完成，但無可見反響；在第二階段，反響進入可見階段，反響進展的很慢，往往需幾分鐘甚至幾非常鐘以致數(shù)日方可完成。而且常受電介質(zhì)、溫度、pH等諸多外界要素的影響。 血清學(xué)檢驗的類型血清學(xué)實驗可分為血清學(xué)鑒定和血清學(xué)診斷兩部分。血清學(xué)實驗既可定性，又可定量。 用知抗體即含特異抗體的免疫血清或單克隆抗體等檢測標(biāo)本中或分別培育物中未知細菌的種、型或細菌抗原，稱為血清學(xué)鑒定；而用知細菌或特異性抗原檢測患者血清中有無相應(yīng)抗體及其效價的動態(tài)變化，作為某些感染性疾病的輔助診斷，稱為血清學(xué)診斷。血清學(xué)鑒定血清學(xué)鑒定常用的血清學(xué)實驗是凝集實驗直接凝集實驗和間接凝集實驗、沉淀實驗、莢膜腫脹

5、實驗和毒素-抗毒素中和實驗等。凝集反響一、直接凝集反響二、間接凝集反響1、正向間接凝集反響2、反向間接凝集反響3、凝集抑制反響4、協(xié)同凝集反響顆粒性抗原凝集素直接凝集反響直接凝集反響指顆粒性抗原與相應(yīng)抗體直接結(jié)合出現(xiàn)的凝集景象。一玻片凝集實驗一種常規(guī)的定性實驗方法。原理是用知抗體來檢測未知抗原。常用于鑒定菌種、血型。取知抗體診斷血清滴加在載玻片上，直接從培育基上刮取待檢菌混勻于診斷血清中，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)細菌凝集成塊或肉眼可見的顆粒，即為陽性。方法簡便、快速、特異性強，現(xiàn)行國標(biāo)用于沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌等的鑒定，但不能進展定量測定。 一玻片凝集實驗如將含有沙門氏菌抗體的血清與待

6、檢菌液各一滴，在玻片上混勻，數(shù)分種后假設(shè)出現(xiàn)肉眼可見的凝集塊，即為陽性反響，證明該菌是沙門氏菌。一玻片凝集實驗自臨床初分別的細菌中，有些細菌外表含有某種外表抗原(如傷寒沙門氏菌的Vi抗原和志賀氏菌屬的K抗原等)，這些抗原能阻止菌體抗原(O抗原)與相應(yīng)抗體發(fā)生凝集反響，從而導(dǎo)致錯誤的斷定。此時應(yīng)將菌懸液于100中隔水煮沸(Vi抗原10030 min、K抗原1001 h)，待細菌外表抗原破壞后，再進展實驗。一玻片凝集實驗用于鑒定細菌的診斷血清有以下幾類：1、多價診斷血清：即混合診斷血清，血清中含有兩種以上細菌的相應(yīng)抗體。普通用于細菌定屬或群。2、單價診斷血清：僅含一種(或型)細菌的相應(yīng)抗體?？捎糜?/p>

7、細菌的定種(或型)。3、因子診斷血清：僅含一種細菌的型特異性抗體的診斷血清稱為因子血清。可用于細菌分型。 玻片凝集結(jié)果察看沙門氏菌的生物學(xué)性狀目前根據(jù)對某一特定O抗原共同具有的規(guī)范，將沙門氏菌屬分為AZ和O51 O67共42個O群，58種O抗原，63種H抗原。到1987年底為止，已有2213個血清型。我國已發(fā)現(xiàn)26個菌群、161個血清型。沙門氏菌的血清分型沙門氏菌主要有O和H兩種抗原。少數(shù)菌具有外表抗原Vi。在這些菌群中，對人致病的沙門氏菌，通常為屬于AF各O群的常見菌型。故用AF多價O血清對沙門氏菌進展的菌型鑒定，只是對于O抗原的第一步鑒定。假設(shè)待測菌型不屬于A到F群，仍要繼續(xù)運用其他沙門氏

8、菌因子血清中的多價O血清繼續(xù)鑒定。而在確定了所屬O群之后，還要進展H抗原的鑒定。必要時，還需進展Vi抗原的鑒定。 沙門氏菌血清實驗致病性的沙門氏菌絕大多數(shù)血清歸在A-F群內(nèi)，所以檢出疑似菌株應(yīng)先凝集A-F群O多價血清，假設(shè)凝集可按常見O因子檢出頻率，按照O4O10O9O7O8O19O2O11順序凝集，可節(jié)省時間。H抗原可先凝集H多價1H多價4，再逐個凝集某個H多價凝集所含的H單因子血清。傷寒和丙型副傷寒桿菌在A-F群多價血清不凝集情況下，還應(yīng)做Vi血清凝集。沙門氏菌血清學(xué)實驗結(jié)果察看二試管凝集法一種定量實驗方法。多用知抗原來檢測血清中有無相應(yīng)抗體及其含量。常用于協(xié)助診斷某些傳染病及進展流行病學(xué)

9、調(diào)查。如肥達氏反響就是診斷傷寒、副傷寒的試管凝集實驗。由于要測定抗體的含量，故將待檢查的血清用等滲鹽水倍比稀釋成不同濃度，然后參與等量抗原，37或56，24 h察看，血清最高稀釋度仍有明顯凝集景象的，為該抗血清的凝集效價。 間接凝集反響是將可溶性抗原或抗體吸附于某種與免疫無關(guān)一定大小的顆粒載體外表，制成致敏載體，再與相應(yīng)抗體或抗原作用，在電解質(zhì)存在的適宜條件下，被動地使致敏載體凝集，稱為間接或被動凝集反響。根據(jù)載體不同，還可以分為乳膠凝集、血球凝集、炭凝集、SPA協(xié)同凝集等。間接血凝實驗表示圖：紅細胞堆積于孔底；：紅細胞堆積于孔底，周圍有散在少量凝集；：紅細胞構(gòu)成層凝集，邊緣較松散；：紅細胞構(gòu)

10、成片層凝集，面積略大；：紅細胞構(gòu)成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣伸展如花邊狀凝集反響可溶性抗原載體顆粒正向間接凝集反響即將知可溶性抗原吸附于載體顆粒上，然后與相應(yīng)抗體結(jié)合產(chǎn)生顆粒凝集景象，用以檢測未知抗體。 抗體可溶性抗原載體顆粒反向間接凝集反響是將知抗體吸附于載體顆粒外表，以檢測相應(yīng)可溶性抗原的凝集反響。 空腸彎曲菌的間接血凝實驗間接血凝實驗IHA是將抗原或抗體包被于紅細胞外表，成為致敏的載體，然后與相應(yīng)的抗體或抗原結(jié)合，從而使紅細胞聚集在一同，出現(xiàn)可見的凝集反響。 葡萄球菌腸毒素的乳膠凝集實驗乳膠敏化抗體加鹽水，再加等體積乳膠制劑，混勻孵育，然后加牛血潔白蛋白。待檢菌液制備瓊脂上挑取待檢菌

11、落，制成菌懸液，離心沉淀細胞，上清液待檢。正式實驗 在玻片上加待檢上清和致敏乳膠，混勻，悄然搖動3min，在斜射光下察看結(jié)果，斷定規(guī)范同普通凝集實驗。靈敏度高，且無假陽性結(jié)果。間接凝集抑制反響是將知抗體或可溶性抗原先與被測的抗原或抗體混合，然后參與有關(guān)抗原或抗體致敏的載體顆粒，如知抗體或可溶性抗原與被測的抗原或抗體相結(jié)合，那么不出現(xiàn)顆粒凝集景象。故也可稱為正向間接凝集抑制實驗或反向間接凝集抑制實驗。 凝集凝集抑制待檢樣品待檢樣品間接凝集抑制反響協(xié)同凝集實驗 運用載體是含SPA葡萄球菌A蛋白金黃色葡萄球菌。SPA能與人及多種哺乳動物血清中IgG類抗體的Fc段結(jié)合，IgG的Fc段與SPA結(jié)合后，I

12、gG的兩個Fab段暴露于葡萄球菌菌體的外表，并仍堅持正常的抗體活性，當(dāng)結(jié)合于葡萄球菌外表的知抗體與相應(yīng)細菌、病毒或毒素抗原接觸時，那么出現(xiàn)肉眼可見的凝集景象。方法簡便、快速、敏感性高，易于察看結(jié)果，已廣泛用于細菌的快速鑒定和分群型，如腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、溶血性鏈球菌、布魯氏菌、沙門氏菌及志賀氏菌等。 沉淀反響可溶性抗原如細菌的培育濾液、含細菌的患者血清、腦脊液及組織浸出液等與相應(yīng)抗體相混合，在比例適宜和適量電解質(zhì)的存在等條件下，構(gòu)成肉眼可見的沉淀物，稱沉淀反響。利用沉淀反響進展血清學(xué)實驗的方法稱為沉淀實驗。沉淀反響有環(huán)狀、絮狀和瓊脂分散法3種根本類型。抗血清抗原絮狀沉淀反響

13、指可溶性抗原與抗體在試管內(nèi)以適當(dāng)比例混合后，在電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)絮狀的沉淀物。將知抗原與抗體在試管如凹玻片內(nèi)混勻，如抗原抗體對應(yīng)，而又二者比例適當(dāng)時，會出現(xiàn)肉眼可見的絮狀沉淀，此為陽性反響。 抗原抗體環(huán)狀沉淀反響將知的抗血清加于細管中，然后沿管壁徐徐參與已適當(dāng)稀釋的待測抗原溶液，使成為分界明晰的二層，孵育530 min后，如在兩液面交界處構(gòu)成肉眼可見的白色環(huán)狀沉淀物為陽性反響。瓊脂分散實驗 用瓊脂制成半固體的凝膠，使抗原和抗體在凝膠中分散，假設(shè)兩者比例適當(dāng)，那么在相遇處構(gòu)成肉眼可見的白色沉淀物線或環(huán)，為陽性反響。每對抗原抗體可構(gòu)成一條沉淀線。有幾對抗原抗體，就可分別構(gòu)成幾條沉淀線。由于方

14、法簡便易行，常用于測定分析和鑒定復(fù)雜的抗原成分。 (1)單向瓊脂分散實驗 (2)雙向瓊脂分散實驗(3)對流免疫電泳 (4)免疫電泳 免疫分散技術(shù)免疫電泳技術(shù)單向分散實驗雙向分散實驗火箭電泳對流電泳免疫電泳分散實驗單向分散實驗是一種定量實驗雙向分散實驗多用于定性實驗。單向分散實驗將抗體預(yù)先在瓊脂中混勻，制成凝膠板，凝固后在瓊脂上打孔，孔中參與待試抗原，經(jīng)一定時間分散后，假設(shè)抗原與抗體對應(yīng)，那么在孔周圍比例適當(dāng)處構(gòu)成白色沉淀環(huán)。 雙向分散實驗先制備瓊脂凝膠板，待凝固后，根據(jù)需求在其上面多少個孔，孔間堅持一定間隔，然后將抗原和抗體分別注入小孔中，使兩者相互分散。如抗原與抗體相對應(yīng)，濃度比例適當(dāng)，經(jīng)一

15、定時間分散后，在抗原抗體孔之間出現(xiàn)明晰的白色沉淀線。一對相應(yīng)的抗原抗體只能構(gòu)成一條線。雙向分散實驗因此，根據(jù)沉淀線的數(shù)目即可推測抗原液中有多少種抗原成分，根據(jù)沉淀線交融與否及交叉關(guān)系，還可鑒定兩種抗原能否完全一樣，還是部分一樣。本法可用于檢測未知抗原或抗體、分析和鑒定抗原成分、檢測抗體或抗原的純度、滴定抗血清的效價等。缺點是需時長，敏感性差。 抗原分子量抗體分子量抗原分子量抗體分子量抗原分子量抗體分子量抗原、抗體相對含量測定抗原、抗體相對分子量分析抗原性質(zhì)分析耐熱，經(jīng)100煮沸30 min不被破壞，也不受胰蛋白酶的影響。食物中的腸毒素耐熱性更強，普通烹調(diào)溫度不能將其破壞。218248的油中需3

16、0 min才干被破壞?？梢鸺毙晕改c炎。以猛烈嘔吐為特征。葡萄球菌腸毒素根據(jù)腸毒素的血清型，可分A、B、CC1、C2、D、E 5 個型。A型腸毒素引起的食物中毒較多，約占50%左右。其他依次為D、C、B和E型。也有AD、AB、AC、BC等。葡萄球菌腸毒素葡萄球菌腸毒素雙向瓊脂分散該方法也用在GB/T 4789.62003腸毒素檢驗。溶血反響與補體結(jié)合實驗一、溶血反響溶血反響與補體結(jié)合實驗二、補體結(jié)合實驗是一種在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素為指示系統(tǒng)的抗原抗體反響。 血清學(xué)診斷血清學(xué)診斷是指用知抗原或知抗體檢測患者血清中相應(yīng)抗體的方法，以診斷感染性疾病?？贵w效價必需明顯高于正常人群的程度或隨

17、病程遞增才有診斷價值。多數(shù)血清學(xué)診斷需取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本，假設(shè)后者的抗體效價比前者升高4倍或4倍以上才有診斷意義。在患者血清中檢出病原微生物的抗原有診斷意義。國家規(guī)范運用的血清學(xué)檢驗技術(shù)GB/T 4789.4-2021沙門氏菌檢驗GB/T 4789.5-2003志賀氏菌檢驗GB/T 4789.62003致瀉大腸埃希氏菌檢驗GB/T 4789.72021副溶血性弧菌檢驗GB/T 4789.8-2021 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗GB/T 4789.9-2021 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 空腸彎曲菌檢驗GB/T 4789.10-2021 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗GB/T 4789.11-20