分子生物學(xué)課程(現(xiàn)代生物學(xué)精要速覽中文版)

1、分子生物學(xué)課程教案2007口2008學(xué)年第1學(xué)期授課專業(yè)：生物技術(shù)課程名稱：分子生物學(xué)主講教師：何寧佳查幸福趙愛春課時教案一、課程名稱：分子生物學(xué)二、總課時數(shù)：45三、先修課程：基因工程原理四、使用教材：科學(xué)出版社，年月第八次印刷五、教學(xué)參考書：特納、麥克倫南、貝茨、懷特，分子生物學(xué)現(xiàn)代生物學(xué)精要速覽中文版，科學(xué)出版社，200年48月第七次印刷。朱玉賢，李毅編著現(xiàn)代分子生物學(xué)第二版，高等教育出版社，年月第次印刷。六、考核方式：理論課采用閉卷考試的方法，總成績，平時成績30，%中期考試10，%期末考試60%七、教案編寫說明：教案又稱課時授課計劃,是任課教師的教學(xué)實施方案。任課教師應(yīng)遵循專業(yè)教學(xué)計

2、劃制訂的培養(yǎng)目標，以教學(xué)大綱為依據(jù)，在熟悉教材、了解學(xué)生的基礎(chǔ)上，結(jié)合教學(xué)實踐經(jīng)驗，提前編寫設(shè)計好每門課程每個章、節(jié)或主題的全部教學(xué)活動。教案可以按每堂課（指同一主題連續(xù)12節(jié)課）設(shè)計編寫。教案編寫說明如下：1、編號：按施教的順序標明序號。2、教學(xué)課型表示所授課程的類型，請在相應(yīng)課型欄內(nèi)選擇打“叮。3、題目：標明章、節(jié)或主題。4、教學(xué)內(nèi)容：是授課的核心。將授課的內(nèi)容按邏輯層次，有序設(shè)計編排，必要時標以“*”、“#”“？”符號分別表示重點、難點或疑點。5、教學(xué)方式既教學(xué)方法，如講授、討論、示教、指導(dǎo)等。教學(xué)手段指教科書、板書、多媒體、模型、標本、掛圖、音像等教學(xué)工具。6、討論、思考題和作業(yè)：提出

3、若干問題以供討論，或作為課后復(fù)習(xí)時思考，亦可要求學(xué)生作為作業(yè)來完成，以供考核之用。7、參考書目：列出參考書籍、有關(guān)資料。8、日期的填寫系指本堂課授課的時間。講授人查幸福課時1.5序號1課題內(nèi)容教學(xué)時m2007.09.03教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1了解原核細胞和真核細胞結(jié)構(gòu)、亞細胞及分子組成上的差異2.了解真核細胞亞細胞器的結(jié)構(gòu)與功能掌握細胞和大分子的分類，及用以分析的一些方法重點難點細胞分類、亞細胞器教學(xué)內(nèi)容備注A1Cellularclassification（細胞分類）Eubacteria（真細菌）和Archaea（古細菌）屬原核細胞生物，它們

4、一般由cellwall（細胞壁）、plasmamembrane（細胞膜）、cytoplasm（細胞質(zhì)）和nucleoid（類核體）構(gòu)成，細胞中有質(zhì)粒、核糖核酸、核糖體及各種蛋白質(zhì)，沒有亞細胞器。古細菌雖然在結(jié)構(gòu)上與真細菌相似，但是其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯更接近真核生物。Eukaryotes（真核生物）包括動物、植物、真菌和原生生物（藻類和原生動物），其細胞體積較大，細胞質(zhì)中含有細胞器、核糖體和由蛋白質(zhì)纖維組成的細胞骨架，細胞核由膜包繞。植物、許多真菌和原生生物也有細胞壁。真核生物大多是多細胞，在發(fā)育過程中不冋群細胞經(jīng)分化形成特定組織。A2Subcellularorganells（亞細胞器）Nucle

5、i（細胞核）攜帶細胞的遺傳信息，每條染色體含有一個DNA分子。有核膜包圍，內(nèi)有核仁，核仁是rRNA合成和核糖體進行部分組裝的場所。Mitochondriaandchloroplasts（線粒體與葉綠體）線粒體是細胞產(chǎn)能的場所，由外膜和內(nèi)膜組成，內(nèi)膜突出折疊成嵴，其內(nèi)含有一個小的環(huán)狀DNA分子、特異RNA和核糖體，可合成小部分線粒體蛋白，其所需要的大部分蛋白質(zhì)則由細胞核DNA編碼并在細胞質(zhì)中合成。植物的葉綠體是光合作用的場所，依靠光冋化C02與水形成碳水化合物和氧氣。葉綠體在內(nèi)膜腔內(nèi)有類囊體，類囊體上含有捕捉光能進行光合作用的葉綠素。葉綠體也能獨立合成小部分蛋白質(zhì)。Endoplasmicreti

6、culum（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）是細胞質(zhì)內(nèi)與核膜相連的膜體系，光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要合成脂類及用于氧化解毒的酶。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有許多核糖體，特異合成分泌性蛋白質(zhì)，經(jīng)過初步的糖基化修飾，轉(zhuǎn)運至高爾基體進一步修飾分檢并分泌。Microbodies（微體）溶酶體有膜包繞，從高爾基體出芽而成，含有豐富的消化酶，回收來自損傷細胞器或體外進入的大分子。過氧化物酶體含有破壞過氧化氫的酶，可防止過氧化氫和高活性自由基損傷細胞。乙醛酸循環(huán)體是特定的植物過氧化物酶體，進行乙醛酸循環(huán)。它們合稱微體。課時教案教學(xué)后記及，讓學(xué)生熟悉這些專業(yè)英語。Organelleisolation（細胞器的分離）大小和密度不同的細胞器，根據(jù)不同的沉降系數(shù)值

7、采用差速離心法相互分離，并用密度梯度離心進一步純化。A3Macromolecules（生物大分子）Proteinandnucleicacid（蛋白質(zhì)和核酸）蛋白質(zhì)是氨基酸以肽鍵連接而成的聚合體，它是體內(nèi)重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和功能物質(zhì)。核酸（DNA和RNA）是核苷酸以3/，5/-磷酸二酯鍵連接形成的聚合體，由含氮堿基、五碳糖和磷酸組成。核酸參與遺傳信息的儲存與加工，但這些信息的表達則需要蛋白質(zhì)。Polysaccharidesandlipids（多糖和脂類）也是重要的生物大分子。Complexmacromolecules（復(fù)雜大分子）核蛋白是核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合體，如端粒酶，核糖核酸酶P等。另外還有糖蛋白

8、、蛋白多糖、脂蛋白和糖脂。A4Largemacromolecularassemblies（大分子的組裝）Proteincomplexes（蛋白質(zhì)復(fù)合體）細胞中多個構(gòu)件和運動元件是由蛋白質(zhì)復(fù)合體構(gòu)成的。細胞骨架就是由微絲（肌動蛋白和肌球蛋白）、微管（微管蛋白）和中間纖維等多種蛋白質(zhì)構(gòu)成。微絲組構(gòu)細胞形態(tài)、控制細胞運動及亞細胞器在細胞內(nèi)的分布。微管是細胞骨架、真核生物纖毛、鞭毛及表面毛狀結(jié)構(gòu)的主要組分。肌動蛋白和肌球蛋白也是肌肉纖維的主要組分。Nucleoprotein（核蛋白）由核酸與蛋白質(zhì)組成。核糖體是較大的細胞質(zhì)核糖核酸蛋白質(zhì)復(fù)合體，是蛋白質(zhì)的合成場所。細菌70S核糖體含有大亞基（50S）和

9、小亞基（30S），50S亞基包含23S、5SRNA分子和31種蛋白質(zhì)，30S亞基包含16SRNA分子和21種蛋白質(zhì)。真核生物的80S核糖體含有60S（包括28S、5.8S和多種5SRNA）和40S（含18SRNA）兩個亞基。染色質(zhì)是構(gòu)成真核生物染色體的元件，由DNA與組蛋白組成的脫氧核蛋白復(fù)合體。病毒是核蛋白復(fù)合體的另一個例子。Membranes（膜）脂質(zhì)雙層分子與蛋白質(zhì)構(gòu)成細胞與細胞器的邊界。外圍膜蛋白結(jié)合在膜的外表或錨定在膜上。鑲嵌膜蛋白被埋在膜中，跨膜蛋白橫跨雙層膜，突出膜的內(nèi)外表面。膜蛋白有多種功能（參見教材P13）1.真核生物與原核生物的細胞結(jié)構(gòu)的差異有哪些2.細胞中各個亞細胞器分別

10、行使什么功能學(xué)生對這些知識點都容易接受，但對專業(yè)術(shù)語的英文不熟悉。在以后的教學(xué)中要經(jīng)常提課時教案講授人查幸福課時1.5序號2課題內(nèi)容ct2007.09.03教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1了解氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和分類2理解蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)3了解蛋白質(zhì)分析的常用方法和蛋白質(zhì)組學(xué)重點難點氨基酸、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能教學(xué)內(nèi)容備注B1Aminoacids（氨基酸）L-氨基酸是蛋白質(zhì)的基本構(gòu)成單元，它們都有一個共同的結(jié)構(gòu)，a-碳原子上連有一個羧基、一個氨基、一個質(zhì)子和一個R側(cè)鏈，氨基酸結(jié)構(gòu)的差異主要表現(xiàn)為R側(cè)鏈的區(qū)別。a-碳原子是手性碳原子，因此氨基酸具有D

11、-和L-兩種立體異構(gòu)體。組成蛋白質(zhì)的均為L-氨基酸。根據(jù)R-側(cè)鏈的極性將氨基酸分類極性帶電荷的氨基酸:酸性氨基酸-天冬氨酸、谷氨酸，堿性氨基酸-賴氨酸、精氨酸和組氨酸。極性不帶電的氨基酸；非極性氨基酸（參見教材）B2Proteinstructureandfunction（蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能）大小與形狀蛋白質(zhì)分為球蛋白和纖維蛋白兩類。酶多為球形蛋白，纖維蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，如羊毛和頭發(fā)中的角蛋白與絲蛋白。一些蛋白質(zhì)含有非蛋白成分，如酶中的輔基和脂蛋白中的脂類。一級結(jié)構(gòu)氨基酸的a-羧基與下一個氨基酸a-氨基縮合形成肽鍵，許多氨基酸以肽鍵相連形成的大分子多肽聚合物即為蛋白質(zhì)。多肽有方向性，游離氨基端

12、為N-端，游離羧基端為C-端。從N-端到C-端的氨基酸順序即為多肽的一級結(jié)構(gòu)。一級結(jié)構(gòu)CN鍵具有部分雙鍵性質(zhì)，使得C-0與N-H四原子形成剛性的肽鍵單元平面，肽鍵單元間以氫鍵相連，多肽鏈在空間折疊形成二級結(jié)構(gòu)，常見的有a-螺旋和B-折疊。三級結(jié)構(gòu)二級結(jié)構(gòu)進一步折疊形成多肽的三級結(jié)構(gòu)。親水基團位于蛋白質(zhì)外狽0,疏水基團埋在內(nèi)側(cè)，氫鍵、鹽鍵、范徳華力和疏水力維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。伴娘蛋白幫助蛋白質(zhì)正確折疊。課時教案四級結(jié)構(gòu)由多條多肽鏈（亞基）構(gòu)成的寡聚蛋白，穩(wěn)定三級結(jié)構(gòu)的力量可將亞基維系在一起構(gòu)成蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。如血紅蛋白是由兩個a球蛋白鏈和兩個B球蛋白鏈構(gòu)成的a2B2四聚體。蛋白質(zhì)的功能（參見教材P

13、22）結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)基序結(jié)構(gòu)域是冋一多肽中有限的咼度有序結(jié)構(gòu)片段相連而成。結(jié)構(gòu)基序也稱超二級結(jié)構(gòu)，是頻繁出現(xiàn)在球蛋白中的二級結(jié)構(gòu)元件群。蛋白質(zhì)家族不同物種的具有相同功能承擔(dān)相同生化角色的蛋白質(zhì)家族成員為直向冋源。進化不冋但功能相似的蛋白為共生冋源。B3Proteinanalysis（蛋白質(zhì)分析法）蛋白質(zhì)純化有根據(jù)蛋白質(zhì)大小進行分離的凝膠過濾層析；離子交換層析、等電聚焦和電泳則是根據(jù)蛋白質(zhì)所帶電荷的不同來分離。蛋白質(zhì)測序用特異的蛋白酶或化學(xué)試劑將多肽切割成教小的肽段，然后在自動測序儀中用Edmen降解法從N-端開始測序。通過不同酶切割產(chǎn)生的重疊片段的重排再現(xiàn)原始序列。更為簡單的方法是對蛋白質(zhì)的互補

14、DNA（cDNA）進行測序。測定分子量SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜法是最常用的方法。蛋白質(zhì)組學(xué)一個細胞在生存期或任何一個時間內(nèi)轉(zhuǎn)錄表達的全套蛋白稱為該細胞的蛋白質(zhì)組，對這些蛋白質(zhì)的分裂鑒定和研究即為蛋白質(zhì)組學(xué)。思考題與作業(yè)完成課后習(xí)題（參見教材P315316）教學(xué)后記與生物化學(xué)聯(lián)系有待加強。課時教案教學(xué)后記講超螺旋的時候，采用模型演示講解效果較好講授人查幸福課時1.5序號3課題內(nèi)容教Cl2007.09.10教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1了解核酸的種類組成和結(jié)構(gòu)2理解DNA雙螺旋和超螺旋結(jié)構(gòu)3了解核酸理化性質(zhì)，尤其是紫外吸收和變性重點難點核酸結(jié)構(gòu)、核

15、酸的理化特性教學(xué)內(nèi)容備注C1核酸結(jié)構(gòu)核酸是由核糖、堿基（嘌吟和嘧啶）、磷酸構(gòu)成。堿基與核糖構(gòu)成核苷，核苷與磷酸形成5/-核苷酸。核酸有兩類：（1）DNA（脫氧核糖核酸）：由脫氧核糖、堿基（A、G、C、T）、磷酸形成的5/-脫氧核苷酸構(gòu)成。RNA（核糖核酸）：由核糖、堿基（A、G、C、U）、磷酸形成的5-核苷酸構(gòu)成。在DNA和RNA分子中，核苷酸之間以3，5-磷酸二酯鍵連接形成長鏈大分子。核酸分子都有游離的5/端和游離3/端。核酸序列從左到右按5/端向3/端方向書寫核酸的堿基序列，其中的核苷酸用單個堿基字母A、G、C、T或U代表。DNA雙螺旋1953年沃森和克里克提出兩條DNA分子相互纏繞形成右

16、手雙螺旋，螺旋有大溝和小溝戊糖-磷酸骨架位于分子外側(cè)，雙鏈間對應(yīng)堿基靠氫鍵形成堿基對，其中A與T配對（2個氫鍵），G與C配對（3個氫鍵）。雙螺旋的每一匝螺旋含約10個堿基對。兩條鏈反向平行排列。雙螺旋的兩條鏈為互補鏈，任意一條鏈的序列可確定另條鏈的序列，它暗示出DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的分子機制。A型、B型及Z型螺旋沃森和克里克提出的為B-DNA結(jié)構(gòu)，是適用于所有DNA的穩(wěn)定形式，堿基對與螺旋軸垂直，每匝10bp堿基對，有一條主溝和一條小溝。低溫條件下，DNA可被誘導(dǎo)形成A型螺旋。A型與B型一樣均為右手螺旋，但較寬而緊密，堿基對傾斜于螺旋軸，每匝為11個堿基對，A型的主要意義在于它是RNA及RNA與D

17、NA雜合體的主要形式。在單一交替的嘧啶-嘌吟序列的合成雙鏈DNA中，形成左旋Z-DNA，它有Z字型外觀，每匝12堿基對，嘌吟核苷酸形成順式構(gòu)象。RNA二級結(jié)構(gòu)RNA通常為單鏈,可以通過分子內(nèi)氫鍵形成局部螺旋結(jié)構(gòu)。課時教案教學(xué)后記講超螺旋的時候，采用模型演示講解效果較好C2核酸的理化性質(zhì)氫鍵堿基堆積力和疏水作用維持核酸的穩(wěn)定性。但在強酸條件下，核酸完全水解為堿基、核糖及磷酸，在略稀的酸中則產(chǎn)生脫嘌吟核酸。DNA化學(xué)測序法是用化學(xué)方法移去特定堿基或?qū)NA在特定堿基處斷裂。堿性環(huán)境中嘌吟產(chǎn)生由酮式向烯醇式轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致氫鍵斷裂，雙鏈解離，DNA變性。一些化學(xué)物質(zhì)能使核酸在中性PH下變性，如尿素和甲酰胺

18、。DNA為細長分子，水溶液具有咼黏性，機械力或超聲波易損傷DNA，使其黏度下降。將DNA放入咼濃度高分子鹽溶液（如氯化銫）中高速離心，DNA最終沉降于與其浮力密度相應(yīng)的位置，形成狹帶，這種技術(shù)稱為平衡密度梯度離心或等密度梯度離心。DNA的沉降可用來確定其（G+C）含量和分離具有不同（G+C）含量的片段。C3核酸的光譜學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)紫外光吸收和減色性DNA和RNA最大紫外光吸收波長為260nm,與蛋白質(zhì)的280nm相區(qū)別，用于核酸定性定量和純化。單核苷酸光吸收值最大，其次是單鏈DNA（ssDNA）,雙鏈DNA（dsDNA）最小，這種變化稱為減色性。DNA純度dsDNA的大致純度可由A260/A2

19、80的比值來確定，純dsDNA該值為1.8,純RNA為2.0，蛋白質(zhì)則小于1，如果DNA樣品的A260/A280大于1.8,說明有RNA污染，小于1.8，說明含有蛋白質(zhì)。變性和復(fù)性加熱使DNA中氫鍵斷裂，雙鏈DNA的螺旋結(jié)構(gòu)變成不規(guī)則的線團，稱為DNA變性。變性核酸的紫外光吸收值增大，其變化值一半時對應(yīng)的溫度稱為解鏈溫度（Tm）,它隨DNA中G+C含量的增加而增大。退火處理（慢速冷卻）使得互補鏈互相配對，恢復(fù)雙鏈結(jié)構(gòu)為DNA復(fù)性。不同核酸鏈互補部分的復(fù)性稱為雜交。C4DNA超螺旋閉環(huán)DNA大多DNA為閉環(huán)雙鏈，兩條鏈相互纏繞，纏繞的數(shù)目稱為連接數(shù)（Lk）。分子中沒有游離斷。超螺旋超螺旋是DNA

20、雙鏈軸線的高度卷曲，如果扭曲方向與雙螺旋方向相同,為正超螺旋，反之為負超螺旋。幾乎所有細胞中的DNA都是負超螺旋。超螺旋的水平可以用連接數(shù)的變化（ALk）來衡量，如負超螺旋約6圈超螺旋/100圈雙螺旋，表示為Lk/LkO=0.06。拓撲異構(gòu)體堿基順序相同但連接數(shù)不同的DNA分子稱為拓撲異構(gòu)體。纏繞和扭曲纏繞（Tw）是指雙螺旋一股鏈繞另一股旋轉(zhuǎn)；扭曲（Wr）則是雙螺旋軸在空間的盤繞。Lk=ATw+AWr（參見教材P47）。嵌入劑如溴化乙錠能插到雙螺旋的堿基對中，使之解旋。對負超螺旋分子，（負）扭曲減少，分子構(gòu)型發(fā)生變化。超螺旋有扭轉(zhuǎn)應(yīng)力，比松散分子具有更高能量，對負超螺旋，這一能量有助于DNA螺

21、旋的局部解旋。拓撲異構(gòu)酶調(diào)控DNA超螺旋水平的酶稱為拓撲異構(gòu)酶。有兩類：1型在DNA一股鏈上產(chǎn)生一個切口，使另一條鏈得以穿越，連接數(shù)每次改變1；II型酶在雙鏈上產(chǎn)生切口，使另一雙鏈DNA片段得以穿過，連接數(shù)每次改變2。對所有的生物體，拓撲異構(gòu)酶都是一種必要的酶，涉及復(fù)制重組和轉(zhuǎn)錄。思考題DNA雙螺旋模型的主要內(nèi)容是什么與作業(yè)課時教案教學(xué)后記講超螺旋的時候，采用模型演示講解效果較好講授人查幸福課時1.5序號4課題內(nèi)容教eu2007.09.10教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1理解原核生物和真核生物染色體的結(jié)構(gòu)，掌握真核生物染色體結(jié)構(gòu)特點2理解核小體的組成及

22、組蛋白的類型3理解異染色質(zhì)、CpG島、COt曲線及基因組復(fù)雜度的含義重點難點原核生物的染色體結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、真核生物的染色體結(jié)構(gòu)教學(xué)內(nèi)容備注D1原核生物的染色體結(jié)構(gòu)原核生物的基因組可以大腸桿菌染色體為例，其為單一閉環(huán)DNA分子，集中分布在擬核區(qū)域內(nèi)。生長時，DNA持續(xù)復(fù)制，生長速率最大時，每個細胞平價有基因組的兩個拷貝。DNA有50100個環(huán)或結(jié)構(gòu)域，各個結(jié)構(gòu)域可保持不同水平的超螺旋，整個染色體為負超螺旋。結(jié)構(gòu)域被非特異結(jié)合蛋白如HU和H-NS等類組蛋白纏繞，使一半超螺旋被束縛。RNA聚合酶及mRNA等有助于類核的組構(gòu)。尚未發(fā)現(xiàn)核小體D2染色質(zhì)結(jié)構(gòu)染色質(zhì)真核生物DNA總長度比原核生物大數(shù)千倍

23、，并由一定數(shù)目分散的染色體組成，每條染色體中的DNA為單一線性分子。染色質(zhì)是緊密組裝高度有序的DNA蛋白質(zhì)復(fù)合體。組蛋白是染色質(zhì)中主要的結(jié)合蛋白，分5類：H2A、H2B、H3、H4，以及H1。所有組蛋白帶有大量正電荷，序列中20%30%由精氨酸和賴氨酸組成，這樣組蛋白與帶負電的DNA緊密結(jié)合。H1在不同種間在序列上比其他組蛋白具有更多的差異。核小體是染色質(zhì)的基本構(gòu)成單位。長約200bp,與由H2A、H2B、H3、H4各2分子構(gòu)成的八聚體核心緊密結(jié)合有，以及1分子H1松散結(jié)合。除去H1,剩下與組蛋白八聚體結(jié)合的146bp的核小體核心。圍繞核小體的DNA左手環(huán)繞形成負超螺旋（扭曲）。H1的功能H1

24、與核小體結(jié)合，對DNA起穩(wěn)定作用，免受核酸酶的降解。核小體核心與H1構(gòu)成染色小體。在有些細胞中H1可被極度變異的組蛋白H5所取代。連接DNA核小體間由連接DNA串聯(lián)，平均長度為55bp，不同組織中其長度在0100bp內(nèi)變化。30nm纖絲核小體進一步被組裝成咼度有序的左手螺旋（螺線管），即30nm纖絲，每圈螺旋約6個核小體。高級結(jié)構(gòu)30nm纖絲構(gòu)成100kb的環(huán)，被蛋白和核基質(zhì)所固定。教學(xué)后記在復(fù)性動力學(xué)部分要講更易懂些教學(xué)后記在復(fù)性動力學(xué)部分要講更易懂些D3真核生物染色體結(jié)構(gòu)有絲分裂染色體呈高度濃縮狀態(tài)，兩個姐妹染色單體在著絲粒處相連，染色體末端是端粒。酵母著絲粒僅由88bp長的富含AT的序列

25、組成，而哺乳動物的著絲粒序列很長，其側(cè)翼是大量的重復(fù)序列，即衛(wèi)星DNA。端粒是染色體DNA末端特化的序列，由大量的短重復(fù)序列構(gòu)成,由端粒酶合成。間期染色體在間期，染色體的基因被轉(zhuǎn)錄，DNA被復(fù)制，染色體呈松散狀態(tài)。異染色質(zhì)是間期染色體內(nèi)保持高度濃縮的部分。它大部分由靠近著絲粒的重復(fù)衛(wèi)星DNA構(gòu)成，無轉(zhuǎn)錄活性。雌性哺乳動物的兩條X染色體都呈異染色質(zhì)狀態(tài)。DNaseI超敏性DNaseI可切割裸露DNA，較長的敏感區(qū)域代表著那里正在進行轉(zhuǎn)錄，因此染色質(zhì)對DNaseI的敏感性可被用來定位細胞中具轉(zhuǎn)錄活性的染色質(zhì)。CpG甲基化哺乳動物DNA中5/CG3/序列通常在胞嘧啶堿基處被甲基化，它與染色質(zhì)中的非轉(zhuǎn)

26、錄區(qū)相連?；蚪M中還有未甲基化的CpG“島”，包圍著持家基因的啟動子區(qū)域，形成DNaseI敏感區(qū)。組蛋白變異體和修飾被包裝的染色質(zhì)的快速變化可通過組蛋白的化學(xué)修飾來調(diào)控，如核心組蛋白N端賴氨酸殘基的乙?；?；而有絲分裂中染色體的濃縮伴隨著組蛋白H1的磷酸化。D4基因組復(fù)雜度非編碼DNA復(fù)雜的真核生物基因組DNA是原核生物的1000多倍，但大部分不編碼蛋白質(zhì),其編碼區(qū)被內(nèi)含子中斷。這些非編碼DNA大部分由多重拷貝組成，這些拷貝可以是串聯(lián)重復(fù)的（如衛(wèi)星DNA）或是分散于基因組中（如分散的Alu元件）。復(fù)性動力學(xué)DNA加熱變性后在低濃度下復(fù)性，在一定時間內(nèi)（t）,DNA復(fù)性的比例由初始DNA濃度（CO

27、）決定的。用剩余單鏈DNA的比例（f）對C0t作圖，得到的曲線代表了DNA樣品的復(fù)性動力學(xué)，即C0t曲線。多個拷貝的單鏈片段比單一序列的復(fù)性快。DNA復(fù)性速率可用光譜法（紫外吸收值降低）和羥基磷灰石層析法測量。人類DNA復(fù)性分3個階段：高度重復(fù)中度重復(fù)）單一序列。E.coli的復(fù)性僅有一個階段。單一序列DNA在單倍體基因組中只有一個或幾個拷貝的序列。在E.coli基因組中，所有DNA都是單一序列，但由于DNA較短，其復(fù)性較快，C0t值相對較小。串聯(lián)基因簇由串聯(lián)重復(fù)的基因或基因簇構(gòu)成中度重復(fù)DNA區(qū)段。如rRNA基因和組蛋白基因簇，18S、5.8S、28SrRNA基因及間隔區(qū)組成的單位在DNA鏈

28、上串聯(lián)重復(fù)約5000次，這些基因位于核仁區(qū)。5個組蛋白基因同在一個基因簇，串聯(lián)重復(fù)達數(shù)百次。分散重復(fù)DNA中度重復(fù)DNA大部分由短散布元件（SINES,有幾百個堿基）和長散布元件（LINES有幾千個堿基）重復(fù)上千次構(gòu)成，并分散于基因組中。如Alu元件和L1元件，它們幾乎占了人類基因組的10%。衛(wèi)星DNA由極短的序列高度重復(fù)串聯(lián)排列而成，在CsCl密度梯度離心中，在主帶DNA附近出現(xiàn)的衛(wèi)星帶。衛(wèi)星DNA又分小衛(wèi)星DNA（不確定數(shù)目串聯(lián)重復(fù)，VNTR）和微衛(wèi)星DNA（簡單串聯(lián)重復(fù)，STR），前者出現(xiàn)在染色體末端，后者則平均分布在染色體上。鑒定親緣關(guān)系的DNA指紋技術(shù)的基礎(chǔ)就是小衛(wèi)星DNA的重復(fù)排列

29、。基因多態(tài)性基因或基因座上堿基變化能使該基因座產(chǎn)生多種形式。什么是衛(wèi)星DNA.?課時教案教學(xué)后記這個部分是分子生物學(xué)的重要章節(jié)，要講仔細講授人查幸福課時3序號5課題內(nèi)容教i間2007.09.21教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1理解DNA復(fù)制的半保留機制和半不連續(xù)復(fù)制2掌握細菌DNA復(fù)制過程及有重要作用的酶和蛋白質(zhì)了解細胞周期了解真核生物DNA復(fù)制的特點重點難點原核和真核生物的復(fù)制機制教學(xué)內(nèi)容備注E1DNA復(fù)制概述半保留機制DNA兩條親代鏈分別作為模板催化新生子鏈的合成，新生DNA的一條鏈是原來的舊鏈，另一條是新合成的，為半保留復(fù)制。Meselson和S

30、tahl（1958年）用實驗證明了該機制（見教材P71）。親代鏈分開及新生DNA開始復(fù)制處稱為復(fù)制叉。DNA合成的底物是脫氧核苷三磷酸（dNTP）:dATPdGTP、dCTP、dTTP。合成的能量來自dNTP的水解。復(fù)制子、復(fù)制起始與終點以單一單位復(fù)制的任一段DNA都稱為復(fù)制子。每個復(fù)制子都有固定的起始點，原核生物許多病毒的DNA呈環(huán)形，為單一復(fù)制子，通常兩個復(fù)制叉從一個起始點向兩個方向復(fù)制，復(fù)制的起始和細胞生長周期調(diào)節(jié)都在起始點處調(diào)節(jié)。真核生物的線性染色體由多復(fù)制子構(gòu)成，每個復(fù)制子都有自己的起始點，起始點在最初解鏈處富含AT序列，它比富含GC的起始點更易解鏈。半不連續(xù)復(fù)制由于DNA新鏈合成只

31、允許以51-31方向進行，而兩條親本鏈反向平行，因而一條新鏈從起始點按5/-3/方向連續(xù)合成（前導(dǎo)鏈），另一條新鏈（后隨鏈）從復(fù)制叉開始按51-31方向先合成一些短的DNA片段（岡崎片段），再由連接酶連成一條連續(xù)的DNA。即前導(dǎo)鏈連續(xù)合成為長鏈，后隨鏈則是間斷合成的，這種合成方式為半不連續(xù)復(fù)制。RNA引導(dǎo)在每一片段的5/端先合成一小段RNA（引物），引導(dǎo)DNA合成。E2細菌的DNA復(fù)制起始E.coli的起始點位于遺傳基因座oriC,大腸桿菌編碼的蛋白DnaA首先識別和結(jié)合于oriC的9bp重復(fù)序列形成復(fù)合物，約45bp成為單鏈，DnaB進入，它是DNA解旋酶，利用ATP水解產(chǎn)生的能量解開雙鏈D

32、NA，形成的單鏈泡被單鏈結(jié)合蛋白Ssb所覆蓋。DNA引發(fā)酶結(jié)合到DNA上并合成引物RNA。解旋DNA解旋酶沿模板鏈前進，打開雙螺旋使復(fù)制順利進行，在閉環(huán)DNA中復(fù)制叉處解旋所形成的正超螺旋可通過II型拓撲異構(gòu)酶即DNA旋轉(zhuǎn)酶的作用而釋放。延伸DNA聚合酶III的全酶二聚體引發(fā)體和DNA解旋酶結(jié)合成復(fù)合體（復(fù)制體），以每秒900bp的速率合成DNA。引發(fā)體含有DnaB解旋酶和DNA引物酶，在后續(xù)鏈上間斷合成RNA引物。DNA聚合酶III催化合成DNA，該酶含有聚合酶a亞基和一個3/-5/外切核酸酶亞基。課時教案教學(xué)后記這個部分是分子生物學(xué)的重要章節(jié)，要講仔細DNA聚合酶I負責(zé)切除引物并填補缺口，

33、該酶具有5/-3/聚合酶、5/-3/外切核酸酶及3/-5/校正外切核酸酶活性。DNA連接酶填補片段間的缺口。終止與分離兩個復(fù)制叉在oriC約1800的對面相遇。該區(qū)域有終止子位點，它們與DnaB抑制劑（tus基因的產(chǎn)物）結(jié)合，阻止復(fù)制叉移動。復(fù)制結(jié)束后兩個相扣的子鏈DNA由拓撲異構(gòu)酶IV（種II型拓撲異構(gòu)酶）解聯(lián)，分配到兩個子細胞。E3細胞周期細胞周期細胞分裂為兩個子細胞的全部過程為細胞周期，它包括DNA的復(fù)制和細胞分裂。細胞周期分4個時期：G1期一細胞為復(fù)制作準備；S期一DNA復(fù)制；G2期一S期后有絲分裂前的短暫期；有絲分裂期一染色體對等分配到兩個子細胞，它又有前、中、后期之分。G1、S、G

34、2共同組成間期。有絲分裂后，增殖的細胞進入下一個細胞周期的G1期，也可脫離細胞周期進入非增殖的休眠狀態(tài)G0期（沉默期）。檢驗點及其調(diào)控在G1期有決定細胞進入下一個分裂周期的限制點（R點），細胞分裂周期起始還需促細胞分裂原，若細胞在到達R點之前缺乏促細胞分裂原，細胞將重進G0期。細胞周期中終止細胞分裂的那些點叫檢驗點，它在間歇期發(fā)生以保證細胞分裂之前完成DNA復(fù)制。細胞周期蛋白和CDK蛋白磷酸化是調(diào)控細胞周期進程的一個主要機制，由一個調(diào)節(jié)亞基（細胞周期蛋白）和依賴細胞周期蛋白的激酶（CDK）來完成，細胞周期蛋白一CDK復(fù)合物決定將被磷酸化的目標蛋白。E2F和RB的調(diào)控由G1期進入S期主要依靠對E

35、2F這一轉(zhuǎn)錄因子的激活，E2F的活性又受與其結(jié)合的蛋白RB的抑制，在G1中后期，細胞周期蛋白一CDK復(fù)合物使RB磷酸化從而釋放E2F進而激活轉(zhuǎn)錄。細胞周期的激活、抑制和癌癥小的抑制蛋白如CIP蛋白和INK4蛋白可通過抑制細胞周期蛋白一CDK復(fù)合物的活性來延遲細胞周期的進程。細胞周期與癌癥間有著根本的聯(lián)系，G1到S期的過渡受到原癌基因和抑癌蛋白的調(diào)控。B細胞的癌變與細胞周期蛋白D1基因的過表達相關(guān)。人類癌癥中兩個重要的抑癌基因產(chǎn)物一抑癌蛋白RB和P53均與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)，RB調(diào)控E2F的活性，當(dāng)DNA損傷時，P53誘導(dǎo)P21WAF1/CIP1的合成。E4真核生物的DNA復(fù)制實驗系統(tǒng)僅有40

36、0個復(fù)制子的酵母，更為簡單的猿猴病毒（SV40）病毒都是很好的模型。非洲爪蟾卵提取物廣泛用于外加DNA或整個細胞核的復(fù)制。起始點和起始約2050個復(fù)制子串聯(lián)成簇在S期同時開始復(fù)制，常染色質(zhì)先復(fù)制，其次為異染色質(zhì)，最后是著絲粒和端粒。酵母的起始點都有一個11bp長的保守序列（自動復(fù)制序列ARS），它可結(jié)合起始點識別復(fù)合體（ORC），被CDK激活后引導(dǎo)DNA復(fù)制。每個復(fù)制子僅起始一次，特許因子在作用后失活能防止復(fù)制的再次起始。復(fù)制叉真核生物復(fù)制叉移動速度為每秒50bp，該過程需要解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白（復(fù)制蛋白A）和3種DNA聚合酶。聚合酶a引發(fā)復(fù)制的起始，聚合酶6延伸前導(dǎo)鏈，聚合酶完成后續(xù)鏈的復(fù)制

37、。DNA及復(fù)制所需的蛋白質(zhì)均固定在核基質(zhì)上。端粒的復(fù)制真核染色體末端（端粒）由多個簡單重復(fù)序列構(gòu)成，不帶遺傳信息，且3/端突出于5/端以防止半不連續(xù)復(fù)制不能復(fù)制線性染色體末端而造成遺傳信息的丟失。端粒酶負責(zé)端粒DNA的復(fù)制，它帶有與端粒重復(fù)序列互補的RNA分子。該酶在體細胞中處于抑制狀態(tài)，但在許多癌細胞中處于激活狀態(tài)。什么是半保留機制，什么是半不連續(xù)復(fù)制，復(fù)制的主要過程有哪些?課時教案教學(xué)后記這個部分是分子生物學(xué)的重要章節(jié)，要講仔細講授人查幸福課時3序號6課題內(nèi)容on2007.09.28教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1了解突變的種類和產(chǎn)生的因素2理解D

38、NA復(fù)制忠實性的機制3掌握DNA修復(fù)的機制4掌握DNA重組的方式及原理重點難點突變、修復(fù)、重組教學(xué)內(nèi)容備注F1誘變突變指DNA堿基序列發(fā)生的永久的可遺傳的改變。一個單一堿基的改變?yōu)辄c突變，它包括轉(zhuǎn)換（嘌吟與嘌吟，嘧啶與嘧啶間的互換）或顛換（嘌吟與嘧啶間的互換）。如果點突變發(fā)生在DNA的非編碼區(qū)、非調(diào)節(jié)區(qū)或密碼子的第3個堿基，它不會影響滲入蛋白質(zhì)中的氨基酸，為沉默突變；如果發(fā)生氨基酸的改變，則為錯義突變。形成新的終止密碼的突變?yōu)闊o義突變，產(chǎn)生截短的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。一個或多個堿基的增加或丟失，會引起移碼突變。群體中許多沉默突變及非致死性突變的積累會產(chǎn)生遺傳多態(tài)性。復(fù)制忠實性復(fù)制的精確性有3種機制：互補

39、堿基配對原則（模板鏈和進入核苷酸在DNA聚合酶的作用位點正確配對）;聚合酶的31-51外切酶活性有校對功能，它能回走從3/端切掉錯配核苷酸，引物是DNA聚合酶發(fā)揮自我校正功能的必要條件；逃脫校對的錯誤可被錯配修復(fù)機制所糾正。誘變劑常見的物理誘變劑為紫外線，它引起相鄰嘧啶核苷酸產(chǎn)生嘧啶一聚體?；瘜W(xué)誘變劑種類很多，堿基類似物可改變堿基配對特性，誘發(fā)直接突變（如5溴尿嘧啶是胸腺嘧啶的類似物）。亞硝酸使胞嘧啶脫氨變成尿嘧啶，引起復(fù)制中AT向GC轉(zhuǎn)化。烷化劑能在DNA不同位置加上烷基，造成堿基脫落，經(jīng)修復(fù)才能防止DNA損傷，細胞對損傷的處理有可能會由于間接誘變而導(dǎo)致突變。直接誘變和間接誘變DNA中存在穩(wěn)

40、定的、配對特性發(fā)生改變的堿基而導(dǎo)致的突變?yōu)橹苯诱T變；在有些情況下，一些損傷DNA聚合酶為了保證染色體的完整性在損傷對應(yīng)的位點上插入錯誤的堿基，導(dǎo)致間接誘變；突變發(fā)生在損傷的位點上為定點突變，發(fā)生在其它位點為非定點突變。原核生物中轉(zhuǎn)移損傷DNA合成屬于對DNA損傷的SOS反應(yīng)（有時也叫“易錯修復(fù)”）F2DNA損傷堿基的損傷和丟失DNA的一些損傷是自發(fā)的，如胞嘧啶會自發(fā)水解脫氨變?yōu)槟蜞奏ぃ鼤诮酉聛淼膹?fù)制中與腺嘌吟配對。生理溫度下，哺乳動物的基因組每天約失去10000嘌吟和幾百個嘧啶。許多已改變的堿基會被專一性的DNA糖基化酶所除去，形成無嘌吟和無嘧啶位點或AP位點。氧化性損傷自由基可攻擊DNA

41、，產(chǎn)生氧化產(chǎn)物造成氧化損傷烷基化烷化劑為親電化學(xué)試劑，可將烷基加到核酸的各種位點，導(dǎo)致DNA損傷。有些是致死性的，多數(shù)導(dǎo)致間接誘變損傷。聚化加合物紫外線使相鄰嘧啶，尤其是胸腺嘧啶形成環(huán)丁烷嘧啶二聚體；煤焦油中的苯并芘在肝臟產(chǎn)生的一種產(chǎn)物可與鳥嘌吟殘基共價結(jié)合；芳香族烷化劑、黃曲霉毒素B1均可與DNA共價結(jié)合。F3DNA修復(fù)光復(fù)活DNA中的嘧啶二聚體可通過可見光的光解作用而恢復(fù)為單體，催化此過程的酶是DNA光解酶（光復(fù)活酶）。E.coli的光解酶有兩個發(fā)色團：蝶吟和FAD。這是一種無差錯的“直接修復(fù)”烷基轉(zhuǎn)移酶該酶可直接從突變的06烷基鳥嘌吟上除去烷基，酶作用后即失活。它也屬于無差錯直接修復(fù)。切

42、除修復(fù)為普遍的無差錯的修復(fù)機制。有兩種形式：核苷酸切除修復(fù)（如E.coli中的UvrABC內(nèi)切核酸酶識別并切除嘧啶二聚體和其他大塊損傷，缺口可由DNA聚合酶I和連接酶填補）；堿基切除修復(fù)（專一的DNA糖基化酶識別修飾堿基，切除修飾堿基與糖基間的N糖苷鍵，留下一個脫嘌吟或脫嘧啶的AP位點，AP內(nèi)切核酸酶在該位點切開DNA。錯配修復(fù)是一種特殊的切除修復(fù)，它是按模板的遺傳信息來修復(fù)錯配堿基的，因此修復(fù)時首先要區(qū)別模板鏈和新合成的DNA鏈。它通過堿基的甲基化來實現(xiàn)的。大腸桿菌DNA的5/GATC序列中A的N6都是甲基化的（Dam甲基化酶負責(zé)），復(fù)制后的一個短暫時間內(nèi)，新合成鏈的GATC中的A未被甲基化

43、，故子代DNA暫時是半甲基化的，這是識別的基礎(chǔ)。錯配的堿基被MutS和MutL組合的復(fù)合體識別并與之結(jié)合，再與MutH內(nèi)切核酸酶結(jié)合，后者在子代鏈GATC附近的位點上產(chǎn)生缺刻，啟動對損傷區(qū)的切除修復(fù)。遺傳性非息肉結(jié)腸癌就是一種錯配修復(fù)酶突變丟失引起的。著色性干皮?。╔P）患者缺乏對紫外線引起的大塊DNA損傷的切除功能，對陽光極度敏感，易患皮膚癌F4重組同源重組也稱一般重組，即兩個雙螺旋DNA分子間同源序列進行交換。雙倍體真核生物發(fā)生在減數(shù)分裂過程，非姐妹染色單體交換相對應(yīng)的區(qū)域，產(chǎn)生的單倍體配子會包含父母本兩方的遺傳信息。單倍體細菌也可重組，如發(fā)生在部分已復(fù)制DNA間或染色體DNA與外源DNA

44、（質(zhì)粒或噬菌體）間。重組的過程和機制包括斷裂復(fù)合、異源雙鏈、分支遷移、Holiday結(jié)構(gòu)、拆分（見教材P98圖）。大腸桿菌的核酸酶和RecBCD結(jié)合在chi序列上并產(chǎn)生切口形成單鏈末端，單鏈DNA被RecA蛋白包裹，4條單鏈形成Holiday結(jié)構(gòu)。同源重組對DNA修復(fù)也很重要（復(fù)制后修復(fù)或重組修復(fù)）。位點特異性重組非同源DNA的特異片段間的交換，它是在結(jié)合序列部位由特異的酶來催化斷裂重接，而同源重組則是由能與RecA蛋白結(jié)合的DNA序列隨機斷裂引發(fā)的。入噬菌體可將自身基因組插入大腸桿菌染色體的特定位點，噬菌體編碼的整合酶與細菌編碼的整合宿主因子（IHF）促成重組結(jié)果和入DNA進入宿主染色體。入

45、噬菌體編碼的切除酶被激活時，整合作用發(fā)生逆轉(zhuǎn)，入一DNA脫離細菌基因組。在真核生物中，免疫球蛋白有3個基因段編碼重鏈和輕鏈的可變區(qū)：V、D和J。這些基因段間的重組產(chǎn)生大量的不同重鏈和輕鏈基因序列，導(dǎo)致抗體種類的多樣化。轉(zhuǎn)座作用又稱非常重組，一些短的DNA片段（轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)座兀件）可轉(zhuǎn)移進基因組的幾乎任何位置。轉(zhuǎn)座子均有兩個結(jié)構(gòu)特征：兩端有2040bp的反向重復(fù)序列；具有編碼轉(zhuǎn)座酶的基因，該酶催化轉(zhuǎn)座子插入新的位置。E.coli中的IS元件（插入序列）是最為簡單的轉(zhuǎn)座子。Tn轉(zhuǎn)座子系列除了轉(zhuǎn)座酶，還攜帶其它基因（如抗性基因），其中的B內(nèi)酰胺酶可使生物體抗青霉素。酵母中的Ty元件編碼的蛋白與反轉(zhuǎn)錄病

46、毒的反轉(zhuǎn)錄酶和整合酶相似，Ty元件兩側(cè)為長末端重復(fù)序列，它先轉(zhuǎn)錄成RNA再反轉(zhuǎn)錄到DNA雙螺旋中，然后插入到其它地方，果蠅的copia轉(zhuǎn)座子與其相似，稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。高等真核生物中的一些分散重復(fù)序列（如LINES和SINES）很可能是通過轉(zhuǎn)座作用在基因組內(nèi)傳播的。思考題與作業(yè)DNA修復(fù)有哪些類型？機制各是什么?教學(xué)后記DNA修復(fù)機理用模型來講解會清楚一些。課時教案講授人查幸福課時3序號7課題內(nèi)容at2007.10.05教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1了解DNA克隆及常用宿主和載體2掌握基因組文庫和cDNA文庫3掌握DNA克隆的一般步驟重點難點克隆策略

47、及其基本方法教學(xué)內(nèi)容備注G1DNA克隆概述DNA克隆將生物體基因組DNA片段作為自主復(fù)制載體的一部分進行獨立復(fù)制，對其進行分離和操作即為DNA克隆?；蚪M的較小片段連接到一段可以自主復(fù)制的DNA（載體）上，形成重組DNA，帶有重組DNA的宿主細胞增殖構(gòu)成一群具有遺傳一致性的個體為單克隆。宿主和載體載體應(yīng)具有整合特性、獨立復(fù)制特性和易被篩選的選擇標志，常用的載體有細菌質(zhì)粒、噬菌體（入噬菌體和噬菌體M13）和一些病毒，還有人工改造的載體如黏粒、細菌人工染色體、酵母人工染色體等。常用宿主有大腸桿菌和酵母菌。亞克隆將已克隆的DNA片段從一載體向另一載體轉(zhuǎn)移的過程為亞克隆。它可用來對較大的克隆片段上的較

48、短區(qū)段進行仔細研究。DNA文庫是一套DNA克隆，它是帶有不冋DNA片段的載體在宿主中擴增后的產(chǎn)物。由基因組DNA構(gòu)建的為基因組文庫，由細胞mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA插入載體構(gòu)成cDNA文庫。篩選含有目的基因的克隆通常用DNA探針經(jīng)雜交來測出，并用限制性酶切圖譜來分析DNA片段。G2質(zhì)粒DNA的制備質(zhì)粒載體大腸桿菌的質(zhì)粒是染色體外的環(huán)狀DNA，有復(fù)制起點（ori），能獨立復(fù)制，含有抗生素抗性基因（bla或ampr基因一抗青霉素，tetA基因一抗四環(huán)素）。是常用的載體。質(zhì)粒的制備堿裂解法最常用：菌體沉淀懸浮于緩沖液中，加入含有SDS的氫氧化鈉溶液使DNA變性RNA水解，再用高濃度pH5的乙酸鉀

49、沉淀變性蛋白質(zhì)和染色體DNA，離心，上清中含質(zhì)粒DNA。用酚抽提法除去殘余蛋白，留在水相中的DNA和RNA可由乙醇沉淀得濃縮并用核糖核酸酶A降解殘余RNA。也可用氯化銫密度梯度離心純化，這是獲的極純的超螺旋質(zhì)粒DNA的最佳方法。課時教案G3限制酶與電泳限制性內(nèi)切核酸酶細菌含有限制修飾系統(tǒng)，有兩個主要組分：限制性內(nèi)切核酸酶（識別一小段對稱的DNA序列，在識別位點處切割）和甲基化酶（對細胞DNA識別序列內(nèi)的C或A加上一個甲基，保護宿主細胞DNA不被內(nèi)切酶降解）識別序列限制性內(nèi)切核酸酶僅識別6bp的回文序列，在該位點酶切DNA形成兩個片段，每個片段有5/突出末端（帶磷酸基團）和帶游離羥基的3/端。黏

50、末端限制性酶解反應(yīng)產(chǎn)物的突出末端被稱為黏末端，它可與其它任何具有相冋突出序列的末端結(jié)合。酶解切割的DNA片段可用溴化乙錠染色的瓊脂糖凝膠電泳來分離。G4連接、轉(zhuǎn)化、與重組體分析DNA連接來自T4噬菌體的連接酶可將目的基因與載體的黏性末端退火堿基斷裂的磷酸二酯鍵閉合。重組DNA分子目的基因插入載體DNA的酶切位點處形成的環(huán)狀分子為重組DNA分子。轉(zhuǎn)化重組體進入宿主（大腸桿菌）一般采用轉(zhuǎn)化方式，用Ca2+處理大腸桿菌，細胞易吸收外源DNA，這一過程為轉(zhuǎn)化，預(yù)處理的細胞被稱為感受態(tài)細胞篩選感受態(tài)細胞在瓊脂平板上生長出的克隆大多不含質(zhì)粒，要對含質(zhì)粒的克隆進行篩選，通常利用質(zhì)粒含有的抗性基因來篩選。篩選

51、的轉(zhuǎn)化子進行增殖保存和分析。思考題與作業(yè)DNA克隆的主要過程有哪些？如何鑒定陽性克隆?教學(xué)后記講一些DNA克隆的實例更能幫助學(xué)生理解課時教案講授人查幸福課時3序號8課題內(nèi)容t學(xué)時間2007.10.12教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的了解和熟悉常用的適用于各種用途的克隆載體重點難點質(zhì)粒載體的設(shè)計、噬菌體載體教學(xué)內(nèi)容備注H1Designofplasmidvectors（質(zhì)粒載體的設(shè)計）克隆過程中最重要的步驟之一就是鑒別環(huán)化載體分子與重組質(zhì)粒,已形成了許多方便于鑒定的方法。當(dāng)載體分子上具有雙抗生素抗性基因時，就可以用插入片段插入某個抗性基因而使其失活的方式來篩

52、選重組體。質(zhì)粒上的lacZ基因的插入失活被用來在含有IPTG和X-gal的平板上篩選重組體。多克隆位點即具有多個限制酶酶切位點的一段DNA序列，為選擇限制酶或克隆中所使用的酶提供更多的選擇性。許多載體被設(shè)計成使插入片段內(nèi)的基因可從強啟動子起始轉(zhuǎn)錄并表達。如用T7表達載體。H2Bacteriophagevectors噬菌體對大腸桿菌的侵染以及隨后的細胞裂解過程可用來擴增克隆的片段。將目的片段連接于侵染所必須的基因的末端，形成重組噬菌體。經(jīng)過包裝與侵染，最后噬菌體斑形成。噬菌體在大腸桿菌細胞內(nèi)以雙鏈環(huán)狀形式復(fù)制，可以像質(zhì)粒一樣操作，但產(chǎn)生的噬菌體顆粒內(nèi)僅含有環(huán)狀。H3Cosmids,YACsand

53、BACs真核生物基因和基因組結(jié)構(gòu)的分析需要比質(zhì)粒和噬菌體更能容納大片段載體。經(jīng)常使用的有黏粒載體、酵母人工染色體和細菌人工染色體等。許多基因克隆的應(yīng)用都需要將基因轉(zhuǎn)入真核細胞并獲得表達。轉(zhuǎn)染真核細胞可以采用電穿孔、微注射和固體粒子轟擊。經(jīng)常使用的載體有穿梭載體、酵母附加型質(zhì)粒、根癌農(nóng)桿菌質(zhì)粒、桿狀病毒和哺乳動物病毒載體等。課時教案思考題與作業(yè)常用的載體有哪幾類？性質(zhì)、插入片段大小等如何？表達載體與克隆載體的有哪些不同？教學(xué)后記學(xué)生反應(yīng)內(nèi)容較抽象。課時教案講授人查幸福課時3序號9課題內(nèi)容e學(xué)s間2007.10.19教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的1了解基因

54、文庫的種類及區(qū)別2掌握基因文庫基本的制作方法重點難點基因組文庫、文庫制作教學(xué)內(nèi)容備注I1基因組文庫基因文庫某生物不同DNA序列的總集構(gòu)成基因文庫，它包括基因組文庫和cDNA文庫，基因組文庫的DNA來自基因組，由細胞mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的互補DNA（cDNA）構(gòu)成的為cDNA文庫。cDNA文庫不包括不能轉(zhuǎn)錄的核基因序列文庫大小計算公式見P140基因組DNA純化的基因組DNA需要用物理剪切或限制性酶解切割成載體適用的片段（1525Kb或更大）。常用的酶是Sau3A，該酶產(chǎn)生的酶切黏性末端與BamHI酶解載體產(chǎn)生的末端相同載體較小的生物如大腸桿菌可用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫；較大的生物用入一噬菌體、黏

55、粒、細菌人工染色體（BAC）或酵母人工染色體（YAC），它們依次容納23、45、350、1000kb的插入片段I2cDNA文庫mRNA分離和純化主要用于真核生物。用結(jié)合有寡聚（dT）的磁珠加到細胞裂解液，在用強磁鐵吸出磁珠并洗出mRNA。再用無細胞翻譯系統(tǒng)（如麥胚抽提液或兔網(wǎng)織紅細胞裂解液）來檢測mRNA的完整性，也可用凝膠電泳直接檢測，用雜交法分離mRNA。cDNA的合成用反轉(zhuǎn)錄酶通過向引物（一般為寡聚dT）的3/末端添加dNTP來合成cDNA的第一條鏈。用末端轉(zhuǎn)移酶對cDNA的第一條鏈的3/末端加尾很容易合成全長的第二鏈。也可用反轉(zhuǎn)錄酶或Klenow酶延伸引物來合成第二鏈cDNA末端的處理

56、先用單鏈特異性核酸酶切掉凸出的3/端，再用Klenow酶補平后加上接頭。為避免限制性內(nèi)切核酸酶切割cDNA內(nèi)部，在添加接頭前先用EcoRI甲基化酶甲基化。最后用T4DNA連接酶連接。與載體的連接載體先用堿性磷酸酶去磷酸化以防止載體自連接，T4DNA連接酶連接載體與cDNA。噬菌體入gt11是構(gòu)建表達文庫的最適載體課時教案13篩選流程篩選用核酸探針雜交。制作探針的方法常用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）制成PCR探針。將菌落或噬菌斑轉(zhuǎn)移到膜上，將其置入含放射性標志探針溶液中保溫，檢出相應(yīng)克隆。表達篩選通過抗體篩選來檢測cDNA編碼的蛋白質(zhì)雜交扣留和釋放cDNA與mRNA雜交后可抑制某些mRNA的翻譯（雜交

57、扣留翻譯）。雜交的mRNA被純化后進行翻譯（雜交釋放翻譯）可鑒定cDNA克隆編碼的蛋白染色體步移從文庫中分離相鄰基因組的克隆來克隆目的基因為染色體步移。思考題與作業(yè)什么是基因組文庫？主要流程有哪些步驟？教學(xué)后記文庫的構(gòu)建是本節(jié)課的中心內(nèi)容。課時教案講授人查幸福課時3序號10課題內(nèi)容教u時s2007.10.26教學(xué)方法講授教學(xué)課型理論實驗習(xí)題實踐復(fù)習(xí)其它教學(xué)手段板書、多媒體教學(xué)目的了解核酸測序的基本方法了解限制圖譜，序列分析，基因組測序計劃理解PCR反應(yīng)的原理及操作掌握克隆技術(shù)的應(yīng)用重點難點克隆的鑒定、核酸測序、聚合酶鏈式反應(yīng)教學(xué)內(nèi)容備注J1克隆的鑒定（一般了解）J2核酸測序DNA測序有Maxa

58、m和Gilbert的化學(xué)法及Sanger的酶學(xué)法RNA測序用能切割3/端特異核苷酸的RNase來酶解具5/端標記的RNA進行序列測定。測定的DNA或RNA序列均輸入序列數(shù)據(jù)庫（如EMBL和Genbank），還要用計算機對序列進行分析檢索，找出其特征。基因組測序計劃測定某種生物基因組的全部序列。如人類基因組測序基本完成。大部分人類基因組測序使用的是BAC克隆。J3聚合酶鏈式反應(yīng)PCR利用與DNA模板兩端互補的一對引物來擴增一段DNA的過程為聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR循環(huán)目的DNA加熱至950C變性分為兩條鏈，當(dāng)降溫至550C,引物與模板退火，再升溫至720C進行聚合反應(yīng)（消耗dNTP和Mg2+

59、），對目標分子不斷拷貝，直至溫度再次升到950C，變性、退火、聚合不斷循環(huán)，使分子數(shù)目迅速增長。通常循環(huán)2040次已知一些序列信息從而能設(shè)計出引物的DNA都能應(yīng)用于PCR。引物通常為1830個核苷酸，如果克隆一個只知道部分氨基酸序列的蛋白質(zhì)的cDNA，可利用遺傳密碼的簡并性設(shè)計簡并引物，這種應(yīng)用簡并寡核苷酸引物的PCR有時也叫DOPPCR；從嗜熱菌中分離的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶被用于PCR，常用Taq聚合酶。PCR還有一些派生技術(shù)。課時教案J4克隆基因的組構(gòu)以寡聚dT為引物合成的cDNA通常在3/端有poly(A)標志來推導(dǎo)出編碼區(qū)。基因組克隆中基因的存在和極性不明顯，可通過作圖和雜交實驗來確定

60、J5克隆基因的誘變?nèi)笔дT變從一端逐漸刪除DNA以確定特定序列的特性為缺失誘變。對于cDNA克隆通常從編碼區(qū)一端刪除，產(chǎn)生N端或C端截短的蛋白；基因組克隆逐步刪除起始點上游的序列以發(fā)現(xiàn)具有啟動子和調(diào)控功能的最短上游序列。外切核酸酶III可從凹進的3/端沿3/至5/方向移去一條鏈形成單向缺失，再用S1或綠豆核酸酶除去突出部分形成平末端進行連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生缺失的克隆。定點誘變改變序列中特定核苷酸的誘變PCR誘變J6克隆技術(shù)的應(yīng)用包括重組蛋白的生產(chǎn)、遺傳修飾生物體的構(gòu)建、DNA指紋分析、診斷試劑盒及基因治療思考題與作業(yè)什么是PCR?如何鑒定陽性克?。拷虒W(xué)后記PCR在日常生活中的應(yīng)用更能表明分子生物學(xué)對