第2章DNA重組(限制性內(nèi)切酶與DNA片段化)ppt課件

1、第二章 DNA重組1.天然DNA的種類染色體DNA病毒和噬菌體DNA質(zhì)粒DNA線粒體和葉綠體DNATMVT4噬菌體染色體DNA天然DNA的提取自學(xué)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南2.限制性內(nèi)切酶和DNA片段化核酸內(nèi)切酶和DNA銜接酶的發(fā)現(xiàn)與運(yùn)用，才真正使DNA分子的體外切割和銜接成為能夠。這兩種酶是基因工程賴以創(chuàng)建的重要的酶學(xué)根底。限制性內(nèi)切酶一類能識別dsDNA分子內(nèi)部的特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈構(gòu)造的核酸酶來源：主要從原核生物中分別純化而來II型核酸內(nèi)切酶：2300種以上，可識別230種不同的DNA序列1994年，美國，分子生物學(xué)百科全書目前發(fā)現(xiàn)有限制性內(nèi)切酶的生

2、物主要是細(xì)菌，少數(shù)霉菌和藍(lán)藻。這種大自然賦予基因工程學(xué)家的了不起的禮物是如何發(fā)現(xiàn)的呢2.1 寄主控制的限制與修飾景象大多數(shù)的細(xì)菌對于噬菌體的感染都存在這一些功能性妨礙。如：目前尚未發(fā)現(xiàn)有任何一種既可感染假單胞菌又可感染大腸桿菌的噬菌體，且非寄主細(xì)菌的RNA聚合酶不可以識別“外源噬菌體的啟動子，即使噬菌體的吸附和轉(zhuǎn)錄能進(jìn)展，也依然存在這另一種功能妨礙即為寄主控制的限制和修飾景象這種景象類似于人體的免疫系統(tǒng)，它可區(qū)分本身的DNA和外來的DNA，并使后者降解吳乃虎，基因工程第二版，上冊，P122限制修飾景象K B K B：可以在大腸桿菌B菌株上生長的噬菌體第一次感染K菌株，構(gòu)成的噬菌斑很少，生長受寄

3、主限制K K存活下來的噬菌體再次感染K菌株，那么構(gòu)成的噬菌斑很多，不受限制K菌株曾經(jīng)對其進(jìn)展了修飾產(chǎn)生這種景象的緣由何在甲基化酶：能使細(xì)胞本身核酸的內(nèi)切酶識別序列的堿基甲基化，從而使本身核酸免受內(nèi)切酶水解細(xì)菌的“防御系統(tǒng)核酸內(nèi)切酶：識別并水解外源DNA外來核酸在內(nèi)切酶識別序列上沒有甲基化修飾作維護(hù)研討發(fā)現(xiàn)：原來是由兩種酶配合完成，一種是起修飾作用的甲基化酶，另一種是核酸內(nèi)切酶1962年限制修飾限制修飾體系K B K B：可以在大腸桿菌B菌株上生長的噬菌體K K再次感染K菌株，那么構(gòu)成的噬菌斑很多，不受限制K菌株曾經(jīng)對其進(jìn)展了修飾 B噬菌體感染大腸桿菌K菌株后，其DNA大部分被內(nèi)切酶降解了，但有

4、極少部分能在特定序列甲基化，防止被酶解，因此有少量噬菌斑構(gòu)成。 在限制修飾系統(tǒng)中限制造用是指一定類型的細(xì)菌可以經(jīng)過限制性酶的作用，破壞入侵的外源DNA(如噬菌體DNA等)，使得外源DNA對生物細(xì)胞的入侵遭到限制； 而生物細(xì)胞(如宿主)本身的DNA分子合成后，經(jīng)過修飾酶的作用：在堿基中特定的位置上發(fā)生了甲基化而得到了修飾，可免遭本身限制性酶的破壞，這就是限制修飾系統(tǒng)中修飾作用的含義。2.2 分類核酸外切酶exonuclease 核酸內(nèi)切酶(endonuclease) 核酸酶從核酸鏈的一端開場，一個接一個地消化降解核苷酸從核酸鏈分子內(nèi)部切割3，5磷酸二酯鍵，使之?dāng)嗔褬?gòu)成小片段核酸內(nèi)切酶(endon

5、uclease) ：按限制性酶的組成、限制和修飾活性、切斷核酸的情況不同，分三類(I， II ，III)，通常指的是II型。 教材P34希臘文exo為外部之意，endo為內(nèi)部之意。限制性核酸內(nèi)切酶的類型24-26bp處特異性切割隨機(jī)性切割距識別序列下游識別序列內(nèi)或附近距識別序列1kb處切割位點(diǎn)無規(guī)律旋轉(zhuǎn)對稱序列無規(guī)律 識別序列ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 輔助因子異源二聚體同源二聚體異源三聚體蛋白構(gòu)造雙功能單功能多功能限制修飾III 型II 型I 型主要特性2.3 命名H i n d III同一菌株中所含的多個不同的限制性核酸內(nèi)切酶如從流感嗜血桿菌d菌株Haem

6、ophilus influenzae d先后發(fā)現(xiàn)3種限制性酶，那么分別命名為HindI， HindII，HindIII大腸桿菌R菌株REscherichia嗜血流感桿菌d株dinfflluenzaeHaemophiillus株名型號種名屬名coli2.4 根本特性識別并切割雙鏈DNA環(huán)狀或線狀分子中48bp的特定序列回文序列切割產(chǎn)生的單鏈斷裂部位在DNA分子上的分布通常并不彼此直接相對粘性斷裂構(gòu)成的DNA片段，往往具有互補(bǔ)的單鏈延伸末端2.5 內(nèi)切酶識別序列的特征長度：48bp構(gòu)造特征：雙重旋轉(zhuǎn)對稱的回文構(gòu)造切割后產(chǎn)生的末端：粘性末端3-OH，5P或平末端EcoR I的識別序列5G C T G

7、 A A T T C G A G 33C G A C T T A A G C T C 5EcoR I的切割位點(diǎn)序列長度：多數(shù)為6bp4： Sau3AI GATC 5：EcoRII CCWGG W=A or T NciI CC SGG S=C or G 6：EcoRI GAATTC HindIII AAGCTT BamHI GGATCC 6 Not I GCGGCCGC 8 BbvCI CCTCAGC 7 PpuMI RGGWCCY 7R=A or GY=C or T構(gòu)造多為雙重旋轉(zhuǎn)對稱的回文構(gòu)造，產(chǎn)生的末端為平末端或粘性末端。如：ABCCBAABCCBA大寫字母代表核苷酸，帶撇的大寫字母代表互

8、補(bǔ)的核苷酸，垂直線代表對稱軸或ABNBAABNBA或ABBAABBA回文序列：指在雙鏈DNA序列中按確定的方向閱讀，雙鏈中的每一條鏈的序列都是一樣的。二重旋轉(zhuǎn)對稱EcoRI GAATTC CTTAAG HindIII AAGCTT TTCGAA粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下構(gòu)成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端構(gòu)造，它們可以經(jīng)過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來。平末端的DNA片段那么不易于重新環(huán)化。5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5EcoR I的切割位點(diǎn)1：5粘性末端：突出的單鏈末端為5端5P2：3粘

9、性末端：突出的單鏈末端為3端3OH5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5Pst I的切割位點(diǎn)5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5PvuII的切割位點(diǎn)3：平末端：無突出的單鏈非對稱AccBSI CCGCTC GGCGAG識別序列出現(xiàn)頻率 1/4n4Nt=44=256 6Nt=46=4096稀切酶rare cutting enzymes在DNA分子中出現(xiàn)的幾率低，故稱之為稀切酶識別序列：比較長；富含AT；富含GC同裂酶(iso

10、schizomer)酶來源不同，但具有一樣的識別序列切割位點(diǎn)可一樣，也可不同切割位點(diǎn)不同，是不同的酶切割位點(diǎn)一樣，是一樣的酶，來自不同生物同尾酶isocaudamer來源各異，識別的靶序列也不一樣，但切割后的DNA片段具有一樣的黏性末端，這樣的一組限制性內(nèi)切酶稱為同尾酶。2.6 切割位點(diǎn)DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下，使多聚核苷酸上磷酸二酯鍵斷開的位置 EcoRII CCWGG 10(N)CGA(N)6TGC(N)12 部分在兩翼少數(shù)兩側(cè)/端多數(shù)在內(nèi)部偏愛位點(diǎn) P42切割位點(diǎn)兩側(cè)序列的核苷酸組成亦與切割效率有關(guān)，即某些限制酶對同一介質(zhì)中的有些位點(diǎn)表現(xiàn)出偏愛性切割2.7 反響系統(tǒng)底物：純，線性，有

11、維護(hù)序列酶：樣品，識別序列的密度，容積活性反響緩沖液反響條件大部分II型核酸內(nèi)切酶需求類似的反響條件：Tris-HCl50 mM pH 7.5MgCl210 mMNaCl0-150 mMDTT1 mMVolume20 - 100 l反應(yīng)溫度、時間37 ，1 - 1.5 hr0-50 mM 低鹽酶100 mM 中鹽酶150 mM 高鹽酶1 DNA純度：要求較純 要素： 蛋白質(zhì)、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿以及某些高濃度金屬離子 措施： 添加酶的用量；擴(kuò)展反響系統(tǒng)體積 延伸反響時間 ；添加亞精胺2.7.1 底物2) DNA的甲基化程度核酸內(nèi)切限制酶是原核生物限制修飾體系的組成部分，因此識別序列

12、中特定核苷酸的甲基化作用，便會劇烈地影響酶的活性。為防止產(chǎn)生這樣的問題，在基因克隆中，質(zhì)粒DNA是來源于甲基化酶缺陷型的大腸桿菌菌株。 這樣制備的質(zhì)粒DNA，其中的內(nèi)切酶識別序列沒有甲基化，不受限制。3 DNA分子構(gòu)型 效率：線性DNA分子 大于 超螺旋質(zhì)粒DNA 環(huán)狀病毒DNA4識別序列的側(cè)面序列 限制酶切割DNA，對識別序列兩側(cè)的非識別序列有長度要求，只含識別序列的寡核苷酸是不會被酶切的，故通常要在識別序列兩側(cè)多加假設(shè)干個核苷酸試劑公司提供的包裝闡明書會標(biāo)明酶活性單位數(shù)和容積活性，最正確作用條件2.7.2 內(nèi)切酶決議酶的用量酶本身的催化活性底物DNA的樣品1.用量2 酶活單位1個酶活單位：

13、在最適反響條件下，在20l反響液中反響1小時，使1g DNA規(guī)范DNA完全消化所需的酶活性稱為1個單位。教材P431U核酸內(nèi)切酶的酶活性：在最正確反響條件下反響1小時，完全水解1g規(guī)范DNA DNA 所需的酶量容積活性：1L酶液中具有的酶活性單位，即U/L。Q：某公司產(chǎn)品內(nèi)切酶a標(biāo)注為200 U/L，現(xiàn)有提取到50 ug的DNA，問：在最正確反響條件下反響1小時，需求多少體積的內(nèi)切酶a？常規(guī)緩沖液 pH， Mg+， DTT/-ME， (10X)pH 7.0-7.9 (at 25) Tris-HCl， 乙酸離子強(qiáng)度： NaCl 高 中 低 100mM 50mM 0 Mg+ 10mM MgCl2

14、， MgAc2.7.3 反響緩沖液對絕大多數(shù)限制酶來說，在pH=74的條件下，其功能最正確。大多數(shù)核酸內(nèi)切限制酶的規(guī)范反響溫度都是37一部分為50-65 少數(shù)25-30 高溫作用酶于37時活性多數(shù)10-50% TaqI (65) 10% ， ApoI(50)50% 銷售商在產(chǎn)品闡明中會標(biāo)明最正確反響溫度2.7.4 反響溫度2.8 star activity1、概念高濃度的酶100U/g、高濃度的甘油5%、低離子強(qiáng)度pH8.0)等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即所謂的star activity景象低特異性：可在不是原來的識別序列處切割DNA是限制內(nèi)切酶的普通性質(zhì)，任何一種限制

15、酶在極端非規(guī)范條件下都能切割非典型位點(diǎn)2、抑制star activity的措施 減少酶的用量，防止過量酶切，減少甘油濃度 保證反響體系中無有機(jī)溶濟(jì)或乙醇 提高離子強(qiáng)度到100150mM (假設(shè)不會抑制的話) 降低反響pH至pH7.0 運(yùn)用Mg+作為二價陽離子 2.9 DNA分子片段化單酶切雙酶切部分酶切2.9.1 單酶切法環(huán)狀DNA分子產(chǎn)生與識別序列數(shù)n一樣的DNA片段且DNA片段的兩末端一樣線形DNA分子產(chǎn)生n+1的DNA片段2.9.2 雙酶切法 環(huán)狀DNA分子完全酶切 DNA片段數(shù)為兩種限制酶識別序列之和 n1+n2線狀DNA分子完全酶切 DNA片段數(shù)為兩種限制酶識別序列之和加1 n1+n2+1重組克隆載體pMD18-T-RIP雙酶切電泳圖M: DNA/ Hind+ EcoR1: BamHI和SacI雙酶切后的重組克隆載體18-T-RIP 1 M6092.9.3、部分酶切指選用的限制性酶對其在DNA分子上的全部識別序列進(jìn)展不完全的