《專題2課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)》課件

1、尿素分子的立體結(jié)構(gòu)CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶課題21、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。2、課題目的一、從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌二、統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中尿素細(xì)菌的數(shù)目啟示：尋找目的菌種時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。. 篩選菌株P(guān)CR技術(shù)是一種常用的DNA擴(kuò)增技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)的自動(dòng)化，需要使用耐高溫的DNA聚合酶，如果請(qǐng)你來找這種耐高溫的酶，你會(huì)去哪里找？熱泉70-80攝氏度的高溫條件淘汰了絕大多數(shù)微生物，而耐熱的Taq細(xì)菌脫穎而出。水生耐高溫細(xì)菌Taq1、實(shí)驗(yàn)室微生物的

2、篩選原理（P21） 人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。（一）篩選菌株一、研究思路2、選擇培養(yǎng)基 在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，稱做選擇培養(yǎng)基。（一）篩選菌株一、研究思路加入青霉素的培養(yǎng)基 細(xì)菌不生長(zhǎng)，酵母菌、霉菌等真菌能生長(zhǎng)不加含碳有機(jī)物的無碳培養(yǎng)基 分離自養(yǎng)型微生物 1.在培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是是什么物質(zhì)？碳源是葡萄糖，氮源是尿素2.分析該配方的培養(yǎng)基對(duì)微生物是否具有選擇作用？如果有，又是如何進(jìn)行選擇的？有篩選作用。尿素是培養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，原則上

3、只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。閱讀22頁本課題使用的培養(yǎng)基配方二、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目顯微鏡直接計(jì)數(shù)法稀釋涂布平板法（活菌計(jì)數(shù)法）（二）微生物計(jì)數(shù)1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法1mm一、研究思路每一個(gè)大方格邊長(zhǎng)為 1mm ，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3。1mm下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算：設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)是多少?1ml菌液中的總菌數(shù)?(1ml=1cm3=1000mm3）5AB1045A缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌2、統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目稀釋涂布平板法（二）微生

4、物計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)注意事項(xiàng)1、幾個(gè)菌落粘連一起，只要肉眼能區(qū)分，就算幾個(gè)；2、不管菌落大小，只要肉眼看得見，就應(yīng)該計(jì)數(shù)；3、菌落數(shù)目過多時(shí)，可以合理采用樣方法。某班級(jí)菌落數(shù)統(tǒng)計(jì)表格第1組第2組第3組第4組151216519095256820717716235721781881024平均每mL樣品中活菌數(shù)平板組別恰當(dāng)?shù)南♂尪取⒄_的涂布操作是成功地統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。（取樣0.1mL,稀釋倍數(shù)106）【例1】某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基上測(cè)得平板上的菌落數(shù)的平均值為234，那么每毫升樣品中菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1 mL）A.2.34108B.2.34109C.234D.

5、23.4思考1：如何根據(jù)平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每mL樣品中的菌株數(shù)？14【解析】選B。稀釋倍數(shù)為106，0.1 mL稀釋液的菌落數(shù)的平均值為234，則每毫升樣品中菌落數(shù)就為234/0.1106=2.34109。每mL樣品中的菌株數(shù)=（CV）MC：某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)V：涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積M：稀釋倍數(shù)思考2：為什么測(cè)平板上的菌落數(shù)可以推測(cè)樣品中的活菌的數(shù)目？當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選用菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。思考3：統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往

6、比活菌的實(shí)際數(shù)目高還是低，為什么？低。因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來表示。 第一位同學(xué)只涂布了一個(gè)平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。 第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個(gè)平板，但是，其中1個(gè)平板的計(jì)數(shù)結(jié)果與另2個(gè)相差太遠(yuǎn)，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤，因此，不能簡(jiǎn)單地將3個(gè)平板的計(jì)數(shù)值用來求平均值。實(shí)例分析1啟 示在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，一定要涂布至少3個(gè)平板，作為重復(fù)組，才能增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說服力與準(zhǔn)確性。在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實(shí)驗(yàn)。實(shí)例分析2想一

7、想：A同學(xué)和其他同學(xué)所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異 如此之大，請(qǐng)分析原因可能有哪些？實(shí)例分析2想一想：你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)排除 上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？一種方案： 可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。實(shí)例分析想一想：你能通過設(shè)置對(duì)照，幫助A同學(xué)排除 上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素嗎？另一種方案： 將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的！ 實(shí)例啟示設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的目的是什么？ 排除實(shí)驗(yàn)操作、培養(yǎng)條件

8、等無關(guān)變量對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。（三）實(shí)驗(yàn)基本原則1、平行重復(fù)原則2、對(duì)照原則3、單一變量原則一、研究思路實(shí)驗(yàn)名稱：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰牧嫌镁撸悍椒ú襟E：1、分組編號(hào) 2、處理（遵循實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則） 對(duì)照原則、單一變量原則（等量原則） 科學(xué)性原則、平行重復(fù)原則 可行性原則 3、觀察記錄（設(shè)計(jì)觀察記錄表）實(shí)驗(yàn)預(yù)期：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：設(shè)計(jì)時(shí)請(qǐng)利用P23-P24的三個(gè)資料二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)名稱：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模翰牧嫌镁撸悍椒ú襟E：1、分組編號(hào) 2、處理（遵循實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則） 對(duì)照原則、單一變量

9、原則（等量原則） 科學(xué)性原則、平行重復(fù)原則 可行性原則 3、觀察記錄（設(shè)計(jì)觀察記錄表）實(shí)驗(yàn)預(yù)期：實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析與評(píng)價(jià)：實(shí)驗(yàn)結(jié)論：設(shè)計(jì)時(shí)請(qǐng)利用P23-P24的三個(gè)資料二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)名稱：實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)原理：實(shí)驗(yàn)用具：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)將土壤中能夠分解尿素的細(xì)菌篩選出來，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。1.提供以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基，原則上只有能分解尿素的培養(yǎng)基才能生長(zhǎng)。小鐵鏟、信封、酒精燈、培養(yǎng)皿、試管、試管架、移液管、膠頭滴管、蒸餾水、選擇培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基等。2.當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)土壤中分解尿素的細(xì)菌的

10、分離與記數(shù)1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.樣品稀釋、取樣涂布4.微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果5.細(xì)菌的計(jì)數(shù)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù) 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。實(shí)驗(yàn)步驟1土壤取樣 制備5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和15個(gè)選擇培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。實(shí)驗(yàn)步驟2.制備培養(yǎng)基 制備5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和15個(gè)選擇培養(yǎng)基，準(zhǔn)備好無菌試管和移液管。 注：每個(gè)稀釋度下需要3個(gè)選擇培養(yǎng)基（平行重復(fù)原則），1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。選用稀釋倍數(shù)為103107的稀釋液。實(shí)驗(yàn)步驟2.制備培養(yǎng)基為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)

11、菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？ 因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量(單位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋液；測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋液。注： 樣品的稀釋 將10g土樣加入盛有90mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,充分搖

12、勻，吸取上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL水的無菌試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107至103稀釋度的順序分別吸取0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高的順序涂布平板，不必更換移液管。實(shí)驗(yàn)步驟3.樣品稀釋、取樣涂布注意：由于初次實(shí)驗(yàn)，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，因此選擇了一個(gè)較為寬泛的范圍：稀釋倍數(shù)為103107。將涂布好的培養(yǎng)皿放在30下培養(yǎng)。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落的數(shù)量、形態(tài)等，并做好記錄。4.微生物的培養(yǎng)、觀察并記錄結(jié)果不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在3037的溫度下培養(yǎng)12d；放線菌一般在2528的溫度下培養(yǎng)57d；而霉菌一般在25

13、28的溫度下培養(yǎng)34d。注：一般來說，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時(shí)間)，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征。 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)，選取菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并根據(jù)平板所對(duì)應(yīng)的稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。實(shí)驗(yàn)步驟5.細(xì)菌的計(jì)數(shù)操作提示一無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。二做好標(biāo)記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。三規(guī)劃時(shí)間課題延伸CO（NH2）2+H2OCO2+2NH3脲酶pH升高指示劑（酚紅）將變紅挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含酚紅培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否變紅。1、結(jié)合對(duì)照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個(gè)平板的菌落數(shù)相近？3、你統(tǒng)計(jì)的每克土壤中含有能分解尿素的細(xì)菌