流式細胞儀的應用課件

1、流式細胞術的應用流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）是一種近年發(fā)展起來的比較先進的技術，它利用流式細胞儀對特定細胞群體進行分選或?qū)ι镂⒘＿M行多參數(shù)快速定量分析1 。FCM集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。FACSCalibur性能卓越，不僅通過其用戶友好的整體設計幫助臨床醫(yī)生快速實現(xiàn)常規(guī)免疫表型，CD4T細胞計數(shù)、DNA、網(wǎng)織紅細胞、血小板等臨床分析，其更以其完美的三色分析功能成為遺傳、腫瘤、血液、免疫功能等諸多研究不可或缺的重要工具。流式細胞儀特點 開灤醫(yī)院引進的BD公司FACSCalibur流

2、式細胞儀BD LSR FACSAria 流式細胞儀的工作原理 信號檢測-散色光 它反應細胞FSC（小角散射)光它反應細胞的相對大小和截面積的大小SSC (90度角散射光)代表細胞的顆粒度和精細結構的變化的物理特性,根據(jù)前側向散射光，可以把不同類型的細胞群加以區(qū)分信號檢測-熒光信號 流式細胞術的操作流程流式細胞儀檢測范圍 1 對細胞抗原的檢測各種血細胞都有相應的抗原表達方式，并且不同成熟階段表達的抗原種類也不完全相同。通過免疫熒光標記技術將細胞表面抗原同標記有特異染料的一種以上單克隆抗體結合后，在流式細胞儀同一激光光源激發(fā)下產(chǎn)生幾種特異熒光色，由熒光檢測器對每個細胞的體積、結構、熒光種類及性質(zhì)等

3、多種參數(shù)同時測定，分析得到細胞群體的多種表面抗原的表達情況。FCM也可用于特異性細胞質(zhì)內(nèi)或細胞核上抗原的檢測，并協(xié)同其他實驗指標預示疾病的預后2 。FCM也為網(wǎng)織紅細胞計數(shù)提供了快速、準確的測試手段，可通過某些染料與網(wǎng)紅中RNA結合，在FCM測量時發(fā)出特定顏色的熒光，進行單參數(shù)定量RNA。 2 對淋巴細胞及其亞群的分析FCM進行淋巴細胞及其亞群的分析，分類更客觀、準確。使用流式細胞儀的絕對計數(shù)系統(tǒng)，即加入已知數(shù)量的熒光微球，通過儀器測定時收獲的細胞數(shù)量和微球數(shù)量及血液標本用量，直接得到每微升全血中T淋巴細胞亞群的絕對計數(shù)（個/l）3 。用FCM檢測PBMC中p24、p24nef、p18等HIV

4、抗原陽性的CD4 + 細胞數(shù)可監(jiān)測體內(nèi)HIV復制情況，結果表明HIV抗原陽性細胞與CD4 + 細胞數(shù)量負相關 4 。 T淋巴細胞檢測 CD8+Ts淋巴細胞檢測 B淋巴細胞檢測 NK細胞檢測 3 白細胞分類分析利用FCM的體積測定和細胞結構測定來檢測每個白細胞的光散色強度，它與細胞體積、細胞膜結構、細胞核形狀、細胞質(zhì)性狀等多種因素有關，經(jīng)過分析可得到中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和單核細胞的檢測結果。這種方法應用于血細胞計數(shù)速度快、結果準確，大大提高了臨床實驗室的工作效率 5 。 4 病毒抗原的檢測FCM既可用于檢測受染細胞內(nèi)的病毒抗原，也可檢測受染細胞表面的病毒抗原。由于FCM檢測的是單個

5、細胞，因此FCM檢測受染細胞適用于血液、支氣管灌洗液、尿標本以及經(jīng)酶消化過的組織細胞。同時由于FCM為多參數(shù)分析，因此可在單個細胞中同時獲得多個分析參數(shù)并能定量檢出受染細胞。當用不同熒光染料標記不同的病毒抗原特異性抗體或?qū)⑻禺愋圆《究贵w與不同大小的乳膠顆粒相聯(lián)時，F(xiàn)CM可同時檢測到同一樣本中的多種病毒或病毒抗原 6 。5 病毒抗體檢測利用吸附有病毒抗原的聚苯乙烯微球作為載體的病毒抗體FCM分析技術已廣泛應用。結合流式細胞儀與微球雜交法可同步檢測同一反應管中HIV、HCV、HBV的數(shù)目和種類，其基本原理為將檢測不同病原體的探針分別包被微球，流式細胞儀分辨特異性結合后發(fā)出的不同強度的熒光。當用FC

6、M技術檢測HCV核心抗原、NS 3 抗原抗體時，其靈敏度比酶標免疫技術高5倍左右 7 6 在器官移植中的作用FCM通過檢測受者血清中抗供者的抗HLA的抗體，根據(jù)抗體的種型、效價、靶抗原和器官移植的類型不同，抗體介導的排斥反應也有所不同，F(xiàn)CM比傳統(tǒng)方法更靈敏、操作時間更短并可同時檢測細胞亞型、分辨出IgG和IgM抗體。巨細胞病毒（CMV）能在白細胞內(nèi)繁殖并合成CMV特異性蛋白，通過FCM檢測CMV特異性抗原及其抗原分泌量，這種技術用于CMV感染檢測時感染后4h便可檢出T淋巴母細胞中CMV-DNA，從而可快速、準確地反映CMV在移植受者中的早期感染狀況，對預防和減少感染具有重要意義 8 。以FC

7、M監(jiān)測腎移植受體CD8 + 、CD38 + 、T細胞亞群的變化也可監(jiān)測CMV感染 9 。7 檢測血小板自身抗體FCM檢測PAIgG與ELISA相比更簡便省時，檢測中操作步驟少。由于血小板被抗體-熒光素標記而顯示陽性，所以不受其它種類細胞或碎片的影響，重復性好，可檢測成批或單個標本，可直觀地顯示結合PAIgG量不同的血小板群體，并可在同一份標本上同時測定聚集和釋放功能 10 。8 在白血病診斷中的作用白血病是白細胞在分化到某個階段受阻后異常增殖的結果，利用白細胞分化不同階段出現(xiàn)的細胞表面標志可以對白血病進行免疫分型。過去對造血細胞和免疫細胞分類主要是依據(jù)細胞形態(tài)學和細胞免疫化學染色來進行的，現(xiàn)在

8、將多種檢測手段相結合，可為臨床診斷、治療監(jiān)測和預后提供更多、更有力的依據(jù)。通過FCM檢測各種急性白血病細胞表面抗原的表達，對臨床診斷尤為重要 11 。9 在腫瘤診斷中的作用通過DNA含量分析的細胞周期分布，可反映腫瘤細胞的增殖狀態(tài)，對治療及預后有十分重要的意義。近年來，流式細胞測量法DNA分析越來越多地應用于實體瘤患者。DNA非整倍體的出現(xiàn)率和癌變與不典型增生程度密切相關。DNA非整倍體可能是癌前病變發(fā)生早期癌變的一個早期指標 12 。10 在微型生物學研究中的應用從現(xiàn)有的微型生物核糖體RNA序列出發(fā)，設計分類專用的核酸探針，它們能與核糖體RNA分子一些區(qū)域互補，而這些RNA分子對于目標分類群

9、是唯一的，通過熒光標記寡核苷酸鏈探針與細胞內(nèi)同源RNA序列結合，目標種可被測出，它們的系統(tǒng)發(fā)育被確定。在這一研究中，通過原位雜交，用FCM確定雜交信號，可定量雜交信號強度，而細胞和特異探針雜交的平均熒光強度與細胞和非特異探針雜交平均熒光強度的比率，能計算和估測探針特異性和靈敏性。由此確定微型生物DNA含量與倍體水平 13 11 用于抗生素敏感性試驗近年來，F(xiàn)CM用于細菌的藥敏效應研究已有較大發(fā)展，F(xiàn)CM與熒光染料的聯(lián)合運用可判斷細菌活力和功能狀態(tài)，由于速度快，該方法已被建議用作臨床實驗室的常規(guī)藥敏試驗 14。綜上所述，F(xiàn)CM具有快速、靈敏及能同時進行多參數(shù)分析的優(yōu)點，廣泛應用于多種學科，具有廣

10、闊的應用前景。目前的流式細胞儀應用研究1、2 345癌癥患者外周血細胞DNA與T細胞亞群、NK細胞活性關系的研究 白血病的分型肝癌患者免疫性預后的研究中西醫(yī)結合治療胰腺炎后外周血中T細胞亞群的變化分析（備選題）（備選題）參考文獻1 Grogan WM，Collins JM.Guide to flow cytometry methods.New York:Marcel Dekker，1990，29-190.2 Islam D，Lindberg AA，Christensson B.Peripheral blood cell prepare in fluences the level of expr

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