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文檔簡介
1、A history of “the most beautiful experiment in biology”遺傳信息的傳遞美國紐約冷泉港會議廳1953年夏第一幕復(fù)制之爭“全保留復(fù)制”DNA復(fù)制過程中,親代DNA分子的兩條鏈都作為模板,互補形成兩條新鏈,新鏈再組合在一起,形成一個新的子代DNA。兩條母鏈全都保留在一個DNA分子中。子代DNA雙鏈中有一條來自于親代DNA,一條是新合成的,即“半保留”。德爾布呂克德裔美籍生物學(xué)家沃森 克里克“半保留復(fù)制”“分散復(fù)制”母鏈水解成若干片段,復(fù)制完成后重新組合成子代DNA。子代DNA中既有母鏈片段,也有新合成片段。如何區(qū)分新合成DNA鏈(子鏈)與原有DN
2、A鏈(母鏈)?DNA復(fù)制后,如何觀測復(fù)制結(jié)果?親代DNA第1次復(fù)制后半保留復(fù)制全保留復(fù)制分散復(fù)制Meselson M, Stahl F W. The replication of DNA in Escherichia coliJ. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1958, 44(7): 671-682.美國加州理工學(xué)院1957年10月-1958年1月第二幕最美的實驗氮元素同位素標記氯化銫密度梯度離心梅塞爾森M. S. Meselson美國化學(xué)博士斯特爾F. W. Stahl美國病毒學(xué)博士你說這些大佬爭來爭去沒個定論,要不咱做個
3、實驗證明下,可好?我看行,你懂化學(xué),我懂生物,咱們是強強聯(lián)合、天作之合!低 密度 高小時實驗步驟:預(yù)測實驗現(xiàn)象15NH4Cl培養(yǎng)液大腸桿菌14NH4Cl培養(yǎng)多代分裂一次分裂兩次離心離心離心繁殖代數(shù)全保留復(fù)制半保留復(fù)制分散復(fù)制012一條輕帶、一條重帶一條輕帶、一條重帶一條中帶一條輕帶、一條中帶一條中帶一條中帶一條重帶一條重帶一條重帶實驗結(jié)果: _DNA復(fù)制是半保留復(fù)制方式低 密度 高繁殖代數(shù)實驗編號混合混合輕帶 14N-14N中帶 14N-15N重帶 15N-15N顯微光密度計紫外光照射輕中重帶帶帶DNA含量密度0Bessman M J, Kornberg A, Lehman I R. Enzy
4、matic synthesis of deoxyribonucleic acidJ. Journal of Biological Chemistry, 1956, 244(11):3029.Korenberg J R, Freedlender E F. Giemsa technique for the detection of sister chromatid exchangesJ. Chromosoma, 1974, 48(4): 355-360.DNA體外復(fù)制實驗真核細胞DNA復(fù)制電鏡照染色單體色差法實驗第三幕新的證據(jù)DNA體外復(fù)制實驗1958年,科恩伯格發(fā)現(xiàn)在適宜溫度和pH下,只有在試管
5、中加入:4種脫氧核苷酸、大腸桿菌研磨提取液、ATP、少量噬菌體DNA后,DNA含量才會增加,且新合成DNA的堿基比例與噬菌體DNA非常相似。加入的噬菌體DNA起何作用?加入的4種脫氧核苷酸起何作用?加入的ATP起何作用?加入的大腸桿菌研磨液起何作用?Arthur Kornberg美國生化學(xué)家親代DNA子代DNADNA聚合酶解旋酶母鏈子鏈原料模板含有DNA復(fù)制所需要的酶供能解旋:解旋酶催化氫鍵斷裂,消耗ATP,堿基暴露,形成二條模板鏈(母鏈)1合成子鏈:周圍游離的脫氧核苷酸與母鏈的堿基互補配對、形成氫鍵,DNA聚合酶催化相鄰脫氧核苷酸形成磷酸二酯鍵,形成一條新鏈(子鏈)2螺旋化:子鏈與母鏈恢復(fù)雙
6、螺旋結(jié)構(gòu)3DNA復(fù)制是全部解旋后再復(fù)制嗎?右圖A、B、C三處復(fù)制先后順序?左圖DNA復(fù)制可能的場所?左圖DNA復(fù)制可能的時期?不是,邊解旋邊復(fù)制BCA復(fù)制起點親代DNA2個子代DNA母鏈子鏈A B C細胞核、線粒體、葉綠體分裂間期(有絲分裂、減數(shù)分裂)真核細胞DNA復(fù)制電鏡照染色單體色差法實驗1974年,科倫貝格發(fā)現(xiàn):將中華倉鼠(2N=22)卵巢細胞放在含BrdU(5-溴尿嘧啶脫氧核苷酸,一種堿基類似物)培養(yǎng)液中培養(yǎng)后,經(jīng)Giemsa染料染色,DNA滲入BrdU越多,染色越淺。從第二次分裂周期開始,姐妹染色單體出現(xiàn)色差。第一次分裂中期第二次分裂中期第三次分裂中期Graham J E, Mari
7、ans K J, et al. Independent and stochastic action of DNA polymerases in the replisomeJ. Cell, 2017, 169(7): 1201-1213. e17.第四幕尾 聲1985年,Kary Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR),可在幾小時內(nèi)人工合成上百萬份DNA拷貝,廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、刑偵等領(lǐng)域。PCR儀2017年,美國加州大學(xué)等機構(gòu)研究人員利用復(fù)雜的成像技術(shù)和熒光染料,首次拍攝到大腸桿菌單個DNA分子復(fù)制的全過程:鞏固練習(xí)現(xiàn)將中華倉鼠(2N=22)卵原細胞放在含BrdU、不含胸腺嘧啶脫氧核苷
8、酸(T)的培養(yǎng)液中培養(yǎng),細胞分裂后用Giemsa染料染色。DNA雙鏈都不含BrdU的染色體顏色最深,DNA單鏈含BrdU的染色體顏色較深,DNA雙鏈都含BrdU的染色體顏色較淺。新手:DNA復(fù)制2次后,含T的DNA分子占所有DNA分子的比例_。普通:若某DNA分子中含有腺嘌呤脫氧核苷酸200個,經(jīng)過3次DNA復(fù)制, 結(jié)合了_個游離的BrdU。困難:有絲分裂第1、2次后期每個細胞中染色體幾條較深、幾條較淺? 第一次:44條較深 第二次:22條較深、22條較淺專家:有絲分裂經(jīng)1、2次分裂后含較深染色體的子細胞比例? 第一次:1 第二次:1/2, 11/21400遺傳物質(zhì)代代同,吾自一生無復(fù)重。萬里
9、長歌行己路,不畏浮云不隨風(fēng)??贫鞑裼?959年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎沃森、克里克于1962年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎德爾布呂克于1969年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎梅塞爾森之后在哈佛大學(xué)任教,于1963年獲美國國家科學(xué)院獎,1995年獲摩爾根獎斯特爾之后在俄勒岡大學(xué)任教,于1996年獲摩爾根獎2017年,美國加州大學(xué)等機構(gòu)研究人員利用復(fù)雜的成像技術(shù)和熒光染料,首次拍攝到大腸桿菌單個DNA分子復(fù)制的全過程:Meselson M, Stahl F W. The replication of DNA in Escherichia coliJ. Proceedings of the National
10、 Academy of Sciences, 1958, 44(7): 671-682.美國加州理工學(xué)院1957年10月-1958年1月第三幕最美的實驗Norman W. Church Laboratory of Chemical Biology岡崎恒子(左),岡崎令治(右)岡崎片段復(fù)制起點雙向復(fù)制密度時間(分鐘)繁殖代數(shù)甲 乙 丙Fig. 7. CHO cell after three rounds of replication in the presence of BrdUrd. Only one fourth of the chromatin is unifilarly substitut
11、ed and thus stained darkly with the FPG techniqueFig. 6. An endoreduplicated cell showing the inner two chromatids darkly stained by the FPG technique. This indicates an outer-outer orientation of the newly synthesized polynucleotide strands (see text)Fig. 11 . Chinese hamster ovary cell. Chromosome
12、s stained by the fluorescent plus Giemsa (FPG) technique to give permanently Giemsa-stained harlequin chromosomes中國倉鼠,2N=22拓補異構(gòu)酶:在雙鏈DNA解螺旋的時候打斷單鏈(Type I )或雙鏈Type II),然后DNA helicase(DNA解旋酶)來斷開DNA-DNA或DNA-RNA之間的氫鍵輕中重帶帶帶DNA含量密度0輕帶中帶重帶密度DNA含量0梅塞爾森和斯特爾認為:DNA雙鏈為15N-15N呈重帶DNA雙鏈為14N-15N呈中帶DNA雙鏈為14N-14N呈輕帶TIPA history of “the most beautiful experiment in biol
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