重組蛋白質(zhì)表達(dá)、復(fù)性與純化ppt課件

1、復(fù)旦大學(xué)生物化學(xué)系 黃偉達(dá)， 2005年12月8日于華東理工大學(xué) 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、復(fù)性與純化為什么要重組基因表達(dá)？ 1. 蛋白質(zhì)功能研討 2. 生物制藥和疫苗消費 3. 疾病的基因治療 4. 食品、化工用酶制劑 5. 抗蟲、抗逆植物改良 6. 細(xì)胞代謝產(chǎn)物的富集基因表達(dá)體系及優(yōu)優(yōu)勢大腸桿菌表達(dá)體系蛋白質(zhì)的復(fù)性任務(wù)中經(jīng)常碰到的問題基因表達(dá)體系 1. 原核體系2. 真核體系 大腸桿菌 (Escherichia coli)遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高；根本不分泌，易構(gòu)成包含體(無正確折疊的立體構(gòu)造)，無加糖等修飾枯草桿菌 (Bac

2、illus subtilis)分泌蛋白質(zhì)才干強(qiáng)，普通有天然立體構(gòu)造；無加糖修飾功能，培育液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達(dá)載體其 他乳酸菌 (Lactic acid bacteria)沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis)真核細(xì)胞表達(dá)體系酵母細(xì)胞昆蟲細(xì)胞植物細(xì)胞/組織哺乳動物細(xì)胞/組織酵母細(xì)胞可消費分泌型蛋白；有天然立體構(gòu)造，有加糖修飾功能；可進(jìn)展染色體整合型基因表達(dá);糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培育上清多糖濃度高;商品化表達(dá)體系： 釀酒酵母Saccharomyce cerev

3、isiae; 畢氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母Schizosaccharomyce pombe昆蟲細(xì)胞可以病毒感染的型式在成蟲中消費，也可在體外培育細(xì)胞中消費蛋白;適宜分泌型和膜蛋白的表達(dá)，有加糖修飾；糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限；作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可CHO細(xì)胞可進(jìn)展分泌表達(dá)，有天然立體構(gòu)造，加糖方式與人體蛋白質(zhì)完全一致；表達(dá)量不夠高，培育本錢較高植物組織植物可大面積種植，可以廉價大規(guī)模消費；轉(zhuǎn)基因植物制造費時，表達(dá)的組織特異性較難控制；表達(dá)量較難提高，分別純化不方便動物乳腺組織分泌消費有天然立體構(gòu)造和活性的蛋白質(zhì)至乳汁，產(chǎn)量高，分別純化方便，特別適宜藥用蛋白的消

4、費；轉(zhuǎn)基因動物制造破費宏大，實驗周期長鳥類輸卵管組織分泌消費有天然立體構(gòu)造的蛋白質(zhì)到蛋清，產(chǎn)量高，容易儲存和運輸，分別純化方便；實驗本錢低，豢養(yǎng)費用低；加糖方式能夠與人有所不同體系選擇研討基因功能: 大腸桿菌, 裂殖酵母,昆蟲細(xì)胞, CHO細(xì)胞多肽藥物消費: 大腸桿菌, 畢氏酵母, CHO細(xì)胞, 乳腺組織疫苗: 大腸桿菌, 酵母, 大多數(shù)沿用細(xì)胞培育產(chǎn)物進(jìn)展滅毒單抗消費: 雜交瘤細(xì)胞工業(yè)酶消費: 各種微生物 在大腸桿菌中直接消費有活性的胰島素 在大腸桿菌中消費人凝血IX因子 在大腸桿菌消費Calcitonin類C端酰胺化短肽 在大腸桿菌中進(jìn)展蛋白質(zhì)的糖基化修飾 在酵母中進(jìn)展與哺乳動物細(xì)胞一致的

5、糖基化 在雞輸卵管中進(jìn)展與哺乳動物細(xì)胞一致的糖基化 提高乳腺分泌表達(dá)的Factor IX類因子的活性 在植物中得到與哺乳動物細(xì)胞一致的糖基化有能夠以后能做到的事在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白質(zhì)假設(shè)目的蛋白質(zhì)有二硫鍵并需求正確的立體構(gòu)造, 盡能夠進(jìn)展可溶性表達(dá);假設(shè)目的蛋白質(zhì)沒有二硫鍵或只用來制備抗血清, 采用包含體表達(dá)比較好;假設(shè)目的多肽的分子量小于 10 kDa, 一定要進(jìn)展交融表達(dá)按蛋白質(zhì)類型分單純表達(dá): pJLA系列, 用NcoI/NdeI導(dǎo)入AUG的載體交融表達(dá): 交融各種tag, GST, CBD, MAL, GFP, etc分泌表達(dá): pel/ompT分泌肽按啟動子分lac及衍生的tac

6、 , trc, pac, rac等啟動子 IPTG誘導(dǎo)lamda phage PL和PR 啟動子 熱誘導(dǎo)T7 啟動子 IPTG誘導(dǎo)T5 啟動子 IPTG誘導(dǎo)ara啟動子 阿拉伯糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)載體分類pJLA50X系列; pcDNAII; etcpET系列 (T7 promoter, Novagen公司)pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司)pMAL系列 (周質(zhì)表達(dá), BioLabs公司)pGEX系列 (GST交融表達(dá), Pharmacia公司)pBAD系列 (Arabinose誘導(dǎo)型)常用表達(dá)載體pTYB系列 (CBD交融, 可以自我切割, BioLabs)Protei

7、n A GSTglutathione S-transferase CBD (chitin-binding domain, BioLabs; cellulose-binding domain, Novagen) calmodulin-binding domain, Stratagene)MBP (maltose-binding protein)GFP (green fluorescence protein)Thioredoxin *協(xié)助二硫鍵構(gòu)成Dsb (periplasma enzyme DsbA, DsbC) * 二硫鍵的構(gòu)成與SUMO (small ubiquitin-related mo

8、difier) KSI (ketosteroid isomerase) 根本上全部沉淀各種交融蛋白表達(dá)載體協(xié)助可溶化協(xié)助分泌到周質(zhì)可用親和層析純化采用MBD交融采用GST交融采用CBD交融采用thioredoxin交融采用Origami等宿主菌降低菌體培育的速度 溫度 (15-30), 降低轉(zhuǎn)速 讓表達(dá)產(chǎn)物可溶化采用CBD交融 (pET36/37)采用Dsb交融 (pET39/40)采用帶pelB/ompT引導(dǎo)肽的載體 (pET12/20/22)采用帶MBD交融 (pMAL載體, Biolabs)采用帶SUMO交融 (pET SUMO, Invitrogen)讓蛋白質(zhì)分泌到間質(zhì)去純化方便: 先

9、用 EDTA/蔗糖 溶液處置, 然后 5 mM MgSO4 洗出His-tag (6-8 Histidine)T7-tag (MASMTGGQQMG)HSV-tag (QPELAPEDPED)S-tag (KETAAKFERQHMDS)VSV-G-tag (TTDIEMNRLGK)HA-tag (YPYDVPDYA)Flag-tag (DYKDDDDK) Myc-tag (EQKLISEEDL)各種用于抗體識別的標(biāo)志為什么要加 tag ?Biotinylation-tag 100多AA的構(gòu)造域, 在大腸桿菌中被辨以為生物素化的位點. Promega的PinPointTM Xa-1; Invit

10、rogen的pET104-DEST.未命名 DVEAWLGAR, 被用來和streptoavidin結(jié)合 (個人通訊) 未命名 一些病毒外殼蛋白的片段, 破壞細(xì)胞膜的構(gòu)造導(dǎo)致容易進(jìn)入細(xì)胞有前景的特殊用途的tagDTT: intein的Cys 溴化氰: MetThrombin: LVPRGS Factor Xa: IEGREnterokinase: DDDDKPreScissionTM protease: LEVLFQGPGenenase I TM PGAAHYTEV protease: ENLYFQ G交融蛋白的專注性切割BL21(DE3)/pLysS : 本身表達(dá)T7 RNA polymer

11、ase 適用pET系列等帶T7啟動子的載體M15/SG13009 : 本身表達(dá)T5 RNA polymerase 適用pQE系列等帶T5啟動子的載體BL21TrxB(DE3) : thioredoxin reductase 突變 Origami : thioredoxin reductase/glutathione reductase 雙突變 適宜帶thioredoxin reductase的交融表達(dá)載體, 協(xié)助構(gòu)成更多的二硫鍵BR21CodonPlusRIL: 富含AT的真核生物基因的表達(dá)BR21CodonPlusRP: 富含GC的真核生物基因的表達(dá)特殊的表達(dá)用菌株NovagenStrata

12、geneInvitrogen BioLabsQiagenPharmaciaPromegaClontechRocheGibco/BRL重要的原核表達(dá)質(zhì)粒提供商The protein folding ProblemHow to get to the bottom of the funnel? And,what is at the bottom?透析法: 簡單; 但費時, 費緩沖液, 蛋白質(zhì)量少，濃度不能過高(容易產(chǎn)生沉淀) 快速稀釋法: 最常用的小規(guī)模復(fù)性方法; 但比較費時,費緩沖液, 蛋白質(zhì)的濃度不能高(容易產(chǎn)生沉淀) 超濾透析法: 比較省緩沖液, 處置量大; 但費時, 要控制好蛋白質(zhì)濃度凝膠過

13、濾法: 快速, 可反復(fù)性高, 不會產(chǎn)生沉淀, 操作復(fù)雜一點 親和層析復(fù)性法, 水相二相法, etc包含體蛋白質(zhì)的復(fù)性方法分子伴侶 (Molecular Chaperone)A molecular chaperone is able to transiently bind and thus stabilize an unstable conformation of another protein, thereby facilitating correct folding by preventing misfolding and aggregation.Type I: chaperones whi

14、ch are functionally responsible for the correct folding, assembly and transport of newly synthesized peptide HSP family,GroELS,ect.Type II: chaperones with enzymatic properties accountable for acceleration of rate limiting steps of protein folding PDIprotein disulfide isomerase, PPI peptidyl-prolyl

15、cis-trans isomerase), etc 兩種主要的分子伴侶人PDI的構(gòu)造特征PDI 作用機(jī)理 PDI has been shown to catalyze reactivation of non-native proteins without disulfide bonds. This function is independent from the redox/isomerase function, as it has been shown to exist in vitro with several model substrates that do not contain di

16、sulfides in their native structure.Folding assistant/chaperoneTimed addition of PDI to refolding Fab/red.Marcus Mayer et al., BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding ofAntibodies in Vitro, JBC Vol. 275, No. 38, 2000Marcus Mayer et al., BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding ofAntibodi

17、es in Vitro, JBC Vol. 275, No. 38, 2000PPI的作用Proline isomerization is widely accepted to be one of the rate-determining steps in protein folding.The function of PPIis to accelerate the cis-trans isomerization process. Molecular ChaperonCyclophilin Family, 典型的PPIRefolding of HCA IIHCA IIHCA II with P

18、PlHCA II with PPl and CsAP202N mutant with PPIP202N mutantReactivation was initiated by rapid dilution of 0.3 M GuHCl and a protein concentration of 0.025 mg/ml (0.83 ,uM). PPI: 9.6M ; CsA: 25M表達(dá)量不夠高；包含體在8M尿素中不能溶解；重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的分子量偏?。粠is-tag重組蛋白不吸附到Ni-chelating樹脂上；Ni-chelating分別純化的效果不好；GST交融蛋白不吸附到glutathione-Sepharose上；包含體來源的采用透析法或稀釋法復(fù)性時全部沉淀；Ni-chelating錯用DTT后發(fā)生黑色沉淀該怎樣辦？貴重的親