抗體的多樣性和其產(chǎn)生的基本機制

1、抗體，抗體的多樣性和其產(chǎn)生的基本機制INSTITUTE FOR IMMUNOBIOLOGYDEPARTMENT OF IMMUNOLOGY抗體研究簡史20世紀有關抗體研究獲得諾貝爾醫(yī)學生理學獎的免疫學家年代學者姓名國家獲獎成就1901E.A.Behring德國發(fā)現(xiàn)抗毒素，開創(chuàng)免疫血清療法1908P.Ehrlich德國提出體液免疫理論和抗體生成的側鏈學說1960F.M.Burnet澳大利亞提出抗體生成的克隆選擇學說1972G.M.Edelman美國闡明抗體的本質(zhì)R.R.Porter英國闡明抗體的化學結構20世紀有關抗體研究獲得諾貝爾醫(yī)學生理學獎的免疫學家年代學者姓名國家獲獎成就1984N. Je

2、rne丹麥提出天然抗體選擇學說和免疫網(wǎng)絡學說G. Kohler德國建立雜交瘤技術制備單克隆抗體C. Milstein阿根廷單克隆抗體技術及免疫球蛋白基因表達的遺傳調(diào)控1987Tonegawa日本闡明抗體多樣性的遺傳基礎Emil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of a

3、ntibodyPaul Ehrlich , 1908, production of antibodyNobel Prize winners Burnet, 1960，Clonal selection Jerne, 1984,Idiotype network抗體生物體最奇妙的分子無限的多樣性（diversity)功能與結構的雙重性 可變區(qū)抗原結合 ( 特異性specificity ) 恒定區(qū)生物學效應功能分泌型和膜型表達B細胞接受抗原刺激后增殖分化成漿細胞產(chǎn)生的糖蛋白?；靖拍預g1Ab1Ag1-Ab1Ag2Ag2Ag2-Ab2與相應抗原特異性結合。主要存在于血清中。Emil von Behri

4、ng (1845-1917)抗毒素（1888）凝集素（1896,Gruber and Durham）沉淀素（1897, kraus）抗體(antibody)是介導體液免疫的重要效應分子，是B細胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細胞所產(chǎn)生的糖蛋白。 抗體一詞的由來（19世紀末）1937年 Tiselius和Kabat 用電泳方法證實抗體的活性存在于泳動最慢的血清組分，稱為球蛋白抗體與球蛋白關系抗體球蛋白1968和1972年WHO和國際免疫學會分別決定將具有抗體活性或化學結構與抗體相似的球蛋白統(tǒng)稱為免疫球蛋白.抗體與免疫球蛋白關系抗體 免疫球蛋白功能概念結構概念一、基本概念B細胞接受抗原刺激后增殖分化成

5、漿細胞產(chǎn)生的糖蛋白與相應抗原特異性結合主要存在于血清中又稱免疫球蛋白 (Immunoglobulin)分泌型 sIg、膜型 mIg 1）四肽鏈通過鏈間二硫鍵組成H2L2重鏈：五類(isotype: a、g、m、d、e) 輕鏈：兩型(k、l)一、基本結構VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHinge regionFcCOONH3+免疫球蛋白的結構 Rodney Porter 1917-1985Nobel Prize in 1972Gerald Edelman 1929 -Nobel Prize in 1972FabFabFcPorter主要致力于將抗體中負責與外來抗原結合的部分從抗體中分開

6、，他發(fā)現(xiàn)可利用酵素-木瓜蛋白(papain)，將抗體分成三部分。HHLLEdelman將抗體分子假定與其它各種蛋白質(zhì)一樣，由一些 polypeptide鏈所構成，而他認為polypeptide鏈間最可能以二硫鍵結合在一起，故他試圖將這些鍵結打斷來觀察其中的各條polypeptide鏈，結果他發(fā)現(xiàn)這些氨基酸鏈單獨存在時都不具有任何抗體的功用。 重鏈（Heavy chain:H鏈） 大約500 a.a, 糖基(+) 類別（Class ）:H鏈：, , , , . (Ig) IgA, IgG, IgM IgD, IgE 輕鏈（light chain:L鏈） 大約214 a.a,糖基(-) 型別（ t

7、ype）: ,重鏈和輕鏈（Heavy & light chains）VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHinge regionFcCOONH3+可變區(qū)(Variable region, VH/VL, Fv)：結合抗原 VH和VL： 高變區(qū) HVR 抗原結合部位互補決定區(qū)CDR 骨架區(qū) FR14 (1971, Kabat) 恒定區(qū)(Constant region, CH/CL) 絞鏈區(qū)(Hinge region) The basic structure of immunoglobulins三個功能區(qū)(Domain) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110

8、 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 5040 30 2010 0 CDR1CDR2CDR3 抗體分子的多樣性 Igl 鏈 的 氨 基 酸 序 列酸殘基的變異率相應位置上氨基對來自不同B細胞克隆的Ig輕鏈氨基酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)V區(qū)的變化主要集中在3個分別由610個氨基酸殘基組成的狹小區(qū)域內(nèi)。這3個區(qū)又被稱作高可變區(qū)或互補決定區(qū)（CDR），參與抗原結合部位的組成。 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 5040 30 2

9、010 0 CDR1CDR2CDR3 抗 體 分 子 的 多 樣 性 酸殘基的變異率相應位置上氨基Diversity and Specificity抗原B細胞表位 抗體 CDR表位AbAg鉸鏈區(qū)（Hinge region）VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHinge regionFcCOONH3+特點：1)極富彈性2)富含脯氨酸功能:1) 有利于 Ab 與Ag的結合2)有利于 Ab 與補體的結合IgG分子結合抗原前后的構象變化Fab段Fc段C1q 結合位點被屏障結合抗原之前 CH1CH2暴露的C1q結合位點結合抗原之后結構域 1）Ig分子中由鏈內(nèi)二硫鍵構成的致密立體球體(V/C/H)。

10、 2）b-sheet、b-barrel、immunoglobulin fold。 3）CDRs(Hypervariable regions)、FRs(Framework regions)。免疫球蛋白的結構功能區(qū)“Ig-like Domain (Ig樣結構域)”二、免疫球蛋白的其他成分(1)化學本質(zhì)：漿細胞分泌的多肽鏈J CHAIN IgA dimer(2)存在：IgM（五聚體）, sIgA（雙體）IgM連接鏈（joining chain，J鏈）SecretorypieceJoining chain SPIgA dimer分泌片（Secretory Piece，SP)(1) 化學本質(zhì)： 多肽鏈(

11、70kD)(2)來源：上皮細胞J chain （3）作用： a.幫助IgA穿越黏膜 b.保護s IgA抵抗蛋白酶的水解作用Secretory IgA(sIgA)Plasma cellsIgA dimerpIgRSPEpithelial Cell胃蛋白酶木瓜蛋白酶FcpFcF(ab)2Fab 三、免疫球蛋白的水解片段木瓜蛋白酶作用于IgG分子重鏈間二硫鍵的N端側，將其裂解為Fab段和Fc段。胃蛋白酶則切在該二硫鍵之C端側，產(chǎn)生F(ab)2和pFc段。類(Class): 重鏈C區(qū)抗原性IgG、IgA、IgM、IgD、IgE亞類(Subclass): 重鏈抗原性/二硫鍵數(shù)目位置IgG1-4型(Typ

12、e): 輕鏈C區(qū)抗原性k、l亞型(Subtype): 輕鏈C區(qū)aa差異排列 l14免疫球蛋白的異質(zhì)性免疫球蛋白的類型血清型免疫球蛋白既可結合抗原，又可作為抗原，激發(fā)機體的免疫應答，因而也是一類抗原物質(zhì)。由于免疫球蛋白的遺傳基礎不同，不同的免疫球蛋白的抗原性也有差異。利用血清學方法測定和分析免疫球蛋白抗原性予以分類，稱為免疫球蛋白的血清型。1、同種型(isotype)：同一種屬所有個體免疫球蛋白分子共同的抗原特異性標志。 由C區(qū)決定 。VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHinge regionFc2、同種異型（allotype)： 同一種屬不同個體間免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特異性

13、標志。 由鏈、鏈、鏈、鏈C區(qū)決定。 VHCH1CVLCLFabHinge regionFc3、獨特型(idiotype,Id)： 每個免疫球蛋白分子所特有的抗原特異性標志。由超變區(qū)特殊的氨基酸序列及其構型決定。 VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabHinge regionFc1）與相應抗原特異性結合：Fv2）激活補體：3）結合FcR：促吞噬(opsonization) 介導過敏 介導細胞毒(ADCC) 免疫調(diào)理 4）穿過胎盤和粘膜5）調(diào)節(jié)免疫功能VHCH1CH2CH3CH4VLCLFabFcCOONH3+免疫球蛋白的功能免疫球蛋白的功能a.b.免疫球蛋白的功能 FcR Antibody-

14、Dependent Cell-mediated Cytotoxicity(抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)Target cellAbEffector cellTarget cell表達Fc受體的組織細胞(NK、M、中性粒細胞）通過識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的的靶細胞。ADCC免疫球蛋白的功能抗體的抗病毒效應NK靶細胞介導 ADCC經(jīng)典途徑激活補體C1qr2s2調(diào)理吞噬作用免疫球蛋白的功能IgGIgMIgAIgEIgD各類免疫球蛋白的特點和功能出生后3個月開始合成，35歲接近成人含量最多 占血清總Ig的 75%產(chǎn)生比較晚，是再次應答的主要抗體半衰期最長(t =23天)分布最廣，血管外的主

15、要抗體唯一能通過胎盤的Ig激活補體 IgG13（經(jīng)典），IgG4（替代）結合細胞 巨噬細胞，單核細胞調(diào)理作用 NK細胞，巨噬細胞介導ADCC 結合SPA協(xié)同凝集實驗特性：IgGIgG功能：抗感染的主要抗體 介導 II,III型超敏反應介導自身免疫 調(diào)理 介導 ADCC 固定補體中和病毒和毒素 抗菌 抗病毒抗外毒素 IgG四個亞類的特點IgG1IgG2IgG3IgG4血清含量(占IgG的百分比） 70 20 6 4 血清半衰期(天) 23 23 7 23通過胎盤 + + + +固定補體 + + + 結合Fc受體 + + + 特性血清中含量第三出現(xiàn)最早的Ig分布局限，主要在血管內(nèi)d) 通過經(jīng)典途徑

16、激活補體e)分子量最大f)凝集細菌e) 結合細胞 巨噬細胞,單核細胞-調(diào)理 NK細胞,巨噬細胞-介導ADCC IgM J 鏈 IgM抗感染的先鋒抗體 介導 II,III型超敏反應 介導自身免疫天然血型抗體 調(diào)理作用 (最強 ) 激活補體中和病毒和外毒素 凝集微生物 介導 ADCC功能： 抗菌作用最強 (5001000IgG) 抗病毒 抗外毒素IgA特點:血清中含量第二 (血清型 IgA，serum IgA)主要以分泌型存在( 外分泌液中）.(secretory IgA,sIgA) sIgA通過初乳被動轉(zhuǎn)移給新生兒 唾液, 眼淚, 乳汁, 鼻黏膜, 支氣管分泌液, 生殖 道分泌物, 前列腺液,

17、小腸黏膜分泌液. SCJ chainIgA dimersIgA功能：粘膜局部抗感染的主要抗體 阻止病原體粘附于粘膜細胞中和病毒和外毒素 傷寒沙門氏桿菌, 奈瑟氏淋球菌 脊髓灰質(zhì)炎病毒，流感病毒 抗菌作用 抗病毒作用 抗外毒素作用 IgD 分 子 的 結 構IgD 分 子*在膜表面的表達是B 細胞成熟的主要標志；*膜型IgD 作為BCR的組成部分，發(fā)揮信號傳導作用Structure of IgE moleculeIgE特性1)含量最少2)與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcR受體結合親細胞性抗體:不與Ag結合，即可與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的FcR牢固結合3)不能激活補體IgE參與過敏反應( I

18、型超敏反應) 結合肥大細胞 和嗜堿性粒細胞 導致各種生物活性的介質(zhì)的釋放嗜酸性粒細胞有IgE的FcR，嗜酸性粒細胞通過此受體結合包被在蠕蟲上的IgE的Fc段，最終殺死寄生蟲抗寄生蟲感染作用人抗體分子的特性抗體類別 IgG IgA IgM IgD IgE重鏈類別 g a m d e重鏈亞類g1, g2, g3, g4 a1, a2輕鏈類別 k 和 l k 和 l k 和 l k 和 l k 和 l分子式 g2l2 或 g2k2a2l2或(a2l2)5SCJa2k2或(a2k2)5SCJ (m2l2)5J或 (m2k2)5J d 2l2 或d2k2 e2l2 或 e2k2分子量（kDa） 150

19、160或400 900 180 190固定補體能力 + 0 + 0 0血清濃度(mg/100ml) 1000 200 120 3血清半衰期(天) 236 5 3 2穿過胎盤 0 0 0 0肥大細胞和嗜堿性細胞脫顆粒？ 0 0 0 +裂解細菌能力 + + + ? ?抗病毒能力 + + + ? ?2014-10-13抗體的多樣性及其產(chǎn)生機制抗體的多樣性抗體的多樣性產(chǎn)生的機制抗體的類別轉(zhuǎn)換1897年Paul Ehrlich 提出側鏈學說1930年Haurowitz 提出直接模板學說1941年Pauling提出間接模板學說1955年Niels Jerne 提出自然選擇學說1958年FM Burnet

20、提出克隆選擇學說抗體生成理論的發(fā)展史（一）抗體的多樣性抗體/免疫球蛋白的基因結構抗體基因的重排抗體基因的重排機制抗體的多樣性早期假說一：生殖細胞學說抗體的多樣性早期假說二：體細胞突變學說The genome contains many loci encoding antibody molecules.B cell express one of these loci.Different B cells express different loci.There are a small number of antibody genes which undergo mutation as the B

21、cell matures , thus giving rise to B cells expressing antibody of different specificity.1971年 Kabat基因嵌入模型利根川進：抗體的基因重排理論免疫球蛋白的基因結構In heavy chains, the V, D and J segments encode the variable domain while the C segment encodes the constant domain.In light chains, the V and J segments encode the variab

22、le domain while the C segment encodes the constant domain.抗體基因的重排During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.During B cell maturation, immunoglobulin genes undergo rearrangement.During B cell maturation, im

23、munoglobulin genes undergo rearrangement.The kappa and lambda loci undergo similar rearrangement.Since there are no D segments, there is a single V-J rearrangement.In both heavy and light chain rearrangement, a number of J segments mayremain between the V(D) and C segments.These are included in the

24、RNA transcript but are spliced out during RNAprocessing.The final light chain mRNA contains one VJC unit.Kuby Figure 5-4Kuby Figure 5-4抗體基因重排的機制（1）重組信號序列(recombination signal sequence, RSS)在VH和VL基因3端、J基因5端和D基因兩端有高度保守的核苷酸序列，包括一個7核苷酸組成的七聚體(heptamer)和一個9核苷酸組成的九聚體(nonamer)，兩者間隔121或231個核苷酸，稱為RSS。只有間隔12個堿

25、基對和間隔23個堿基對的RSS之間發(fā)生重組，而間隔長度相等的RSS之間不發(fā)生重組，這就是12/23堿基對規(guī)律(12/23 base pair rule)，也叫做1+2圈規(guī)律(1+2 turn rule)。Kuby Figure 5-3Recombination signal sequences - conserved sequences in regions just upstream or downstream of gene segments.Consist of a conserved heptamer and nonamer with a 12 or 23 bp spacer.Kuby

26、 Figure 5-3The one-turn/two-turn rule (12/23 rule) - recombination occurs onlybetween a segment with a 12 bp spacer and a segment with a 23 bp spacer.Recombination Signal Sequences Direct RecombinationRecombination Activating Genes (encode RAG-1 and RAG-2)RAG-1 and RAG-2 mediate recognition of signa

27、l sequences and rearrangement of DNA segments.Mice deficient in RAG-1 or RAG-2 are unable to rearrange heavy or light chain genes.These mice have no mature B cells.- B cells will not mature if they cannot express a BCR. （2）重組活化基因Recombination Activating GenesRAG-deficient mice also lack mature T cel

28、ls.- The T cell receptor is also encoded by loci containing gene segments that must be rearranged before the TCR can be expressed.T cells will not mature if they cannot express a TCR.SCID (severe combined immune deficency) mice also have a defect that affects rearrangement of BCR and TCR loci.They a

29、lso have no mature T or B cells.Flow cytometry of normal vs. RAG-1 deficient mice:Lymph node cellsFITC anti-CD19 (B cell marker) and PE anti-CD3 ( T cell marker)Normal miceRAG-1 - deficient miceHow recombination in the V regions of antibody happens?A G C TT A T ATerminal deoxynucleotidyl transferase

30、 (Tdt)An enzyme that randomly adds in nucleotides during joining of heavychain (NOT light chain) segments.Read Kuby pages 113-115: Gene Segments Are Joined by RecombinasesProductive and nonproductive rearrangementsJoining of segments is not precise and may result in loss of the correct reading frame

31、.This may lead to introduction of stop codons - nonproductiverearrangements.RSSRSSRSS: recombination signal sequenceRAG: recombination activating geneP-核苷酸和N-核苷酸的加入片段斷端形成發(fā)夾結構TCAGDTAATJ內(nèi)切酶切開發(fā)夾結構產(chǎn)生P-核苷酸T C G ADA T A TJTdT酶加入N-核苷酸T C G A C T CDG A G C G A T A TJ通過DNA修復，斷端連接，恢復雙鍵結構T C G A C T C G C T A

32、T AA G C T G A G C G A T A TDJP N PTwo alleles are available at each locus (maternal and paternal).A B cell expresses only one heavy and light chain allele.- ALLELIC EXCLUSIONFirst, one allele of the heavy chain is rearranged.If the rearrangement is successful, the other allele will not be rearrange

33、d.If the rearrangement is nonproductive, the other allele will be rearranged.Once a heavy chain allele rearrangement is productive, light chain rearrangement will begin.If rearrangement of both heavy chain alleles is nonproductive, the B cell will not mature further but will die of apoptosis within

34、the bone marrow. If a heavy chain allele is successfully rearranged, light chain rearrangement begins.In humans, the kappa locus is rearranged first.Rearrangement occurs at one allele at a time and continues until a productive rearrangement occurs.If both kappa alleles rearrange nonproductively, rearrangement will begin at the lambda locus.If all 4 alleles (both kappa alleles and both lambda alleles) rearrangements are nonproductive, the B cell will not mature but will instead die