分子腫瘤概論和生物學(xué)行為介紹

1、 分子腫瘤概論和生物學(xué)行為介紹一、有關(guān)腫瘤的基本概念（復(fù)習(xí)）腫瘤（tumor, neoplasm) 基因水平 調(diào)控失常 異常增生 新生物腫瘤生物學(xué)行為-浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移能力 浸潤(rùn) (invasion)：起源處遷移 侵入周圍鄰近組織轉(zhuǎn)移(metastasis)：從原發(fā)部位血管、淋巴管、體腔它處繼續(xù)生長(zhǎng)與原發(fā)瘤同樣類型腫瘤 （轉(zhuǎn)移瘤或繼發(fā)瘤） 轉(zhuǎn)移的途徑浸潤(rùn)生長(zhǎng)是惡性腫瘤生長(zhǎng)的特點(diǎn)，也是腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程必經(jīng)的第一步。腫瘤的組織結(jié)構(gòu) 實(shí)質(zhì) （parenchyma)間質(zhì) （mesenchyma, stroma) 腫瘤間質(zhì)的主要成分1 血管毛細(xì)血管，小動(dòng)、靜脈血竇樣血管血管球樣增生血管內(nèi)皮增生腫脹新的腫瘤血供模式

2、-血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)1999年，美國(guó)學(xué)者M(jìn)aniotis等一種完全不同于經(jīng)典血管生成的微循環(huán)模式-管壁主要由基底膜(PAS陽(yáng)性)圍成，外襯以腫瘤細(xì)胞-腔內(nèi)有血漿和紅細(xì)胞流動(dòng), 管道與內(nèi)皮性血管相多存在于高度惡性腫瘤2 結(jié)締組織間質(zhì) （1）纖維和基質(zhì) 膠原纖維 常規(guī) HE - 紅 特殊化學(xué)染色 VG 改良法- 紅 Masson- 蘭色 構(gòu)成成分 I II III型膠原原纖維 又由相應(yīng)原纖維分子構(gòu)成 免疫組化或分子生物學(xué)方法可區(qū)別網(wǎng)狀纖維 銀染-黑色，故也稱嗜銀纖維。 PAS -強(qiáng)陽(yáng)性 成分 膠原蛋白為主要成分 細(xì)胞間質(zhì)網(wǎng)狀纖維- 型膠原蛋白 基底膜網(wǎng)狀

3、纖維- 型膠原蛋白-層黏連蛋白（laminin） 纖維黏連蛋白 Fibronectin（FN） 作用 A. 連接基質(zhì)中各種成分 B. 介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)成分與細(xì)胞表面連接黏蛋白 又稱蛋白多糖（proteoglycan） 如透明質(zhì)酸，硫酸肝素等 骨黏素 （osteonectin） （2）基底膜 (basement membrane , BM) 多種成分 與腫瘤浸潤(rùn)關(guān)系密切 型膠原 層黏連蛋白 （laminin ,LM） （3）細(xì)胞成分 固有的細(xì)胞成分 -成纖維細(xì)胞和纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞 -間充質(zhì)細(xì)胞 -巨噬細(xì)胞-樹(shù)突狀細(xì)胞 反應(yīng)性細(xì)胞成分 各種細(xì)胞浸潤(rùn) - 淋巴細(xì)胞 最常見(jiàn) -漿細(xì)胞 -巨噬細(xì)胞

4、都屬免疫活性細(xì)胞 二、腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制（一）腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 1.腫瘤細(xì)胞增殖和擴(kuò)展 浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的前提和基礎(chǔ) 2.腫瘤血管生成(tumor angiogenesis) 腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的必要條件3.腫瘤細(xì)胞分離脫落，與細(xì)胞外基質(zhì)黏附 （1）瘤細(xì)胞表面負(fù)電荷增加 （2）瘤細(xì)胞黏附力的改變 瘤細(xì)胞自身結(jié)構(gòu)異常 瘤細(xì)胞同質(zhì)黏附力下降 指同種瘤細(xì)胞之間的黏附力 瘤細(xì)胞異質(zhì)黏附力增加 指腫瘤細(xì)胞與其它不同細(xì)胞及間質(zhì)的黏附力細(xì)胞表面的黏附分子介導(dǎo) 通過(guò)配-受體之間的識(shí)別和結(jié)合實(shí)現(xiàn) （3）腫瘤黏附因子(adhesion molecules) 細(xì)胞表面結(jié)構(gòu) 鈣黏蛋白(cadherin) 又稱為鈣連接素，鈣

5、黏素 據(jù)分布不同 E-鈣黏蛋白 P-鈣黏蛋白 N-鈣黏蛋白 H-cad 整合素(integrin)-細(xì)胞表面糖蛋白 ，約有20 多個(gè)亞型 -各種腫瘤細(xì)胞表面整合素種類不同-腫瘤生長(zhǎng)各個(gè)階段表達(dá)水平也不同 作用 a.介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附 b.參與不同細(xì)胞之間的黏附連接 C.扮演細(xì)胞信號(hào)傳遞的角色 免疫球蛋白超基因家族(immunoglobulin superfamily) 主要參與細(xì)胞與細(xì)胞間的連接 ICAM-1 （細(xì)胞間黏附分子-1） VCAM-1 （血管黏附因子） NCAM （神經(jīng)細(xì)胞黏附因子） 其它 包括CEA 、DCC選擇素(selectin) 內(nèi)源性植物凝血素（凝集素） 作用 介

6、導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、血小板與瘤細(xì)胞黏附 選擇素家族包括： P-selectin E-selectin L-selectin CD44 及其它 CD 44(透明質(zhì)酸受體) 路易斯寡糖（SLEX，,s-LewisX ） 跨膜超級(jí)家族基因蛋白（TM4ST） 4.瘤細(xì)胞的遷移(migration)及化學(xué)趨向性 (1)瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng) 黏附；肌動(dòng)蛋白、微管、中間絲 (2)瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)據(jù)其作用，大致可分為兩大類：既影響運(yùn)動(dòng)又影響生長(zhǎng)的因子僅影響運(yùn)動(dòng)的因子腫瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和增殖 AMF (自分泌運(yùn)動(dòng)因子) 1986年Liotta 等首先發(fā)現(xiàn)并命名 它源于腫瘤細(xì)胞本身且作用于腫瘤細(xì)胞. HGF/SF（肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子/分散

7、因子) 生物學(xué)作用存在多態(tài)性 HGF 和AMF是近期發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)大的動(dòng)力因子 (3)瘤細(xì)胞的化學(xué)趨向性 21KD 的蛋白質(zhì) 骨吸收因子 5.細(xì)胞外基質(zhì)的降解(1)腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞外基質(zhì)的步驟 Liotta 1986年提出 第一步 黏附于基底膜或其他間質(zhì)成分 第二步 分泌蛋白酶并激活, 降解瘤細(xì)胞 鄰近的細(xì)胞外基質(zhì) 第三步 進(jìn)入受蛋白酶降解的基質(zhì)區(qū)域內(nèi) (2)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白水解酶絲氨酸蛋白酶類及其抑制因子纖溶酶 (纖維蛋白溶解酶) 纖溶酶原 a. 降解基質(zhì) b. 激活膠原酶 膠原降解尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator , u-PA）系統(tǒng)

8、 Au-PA： 介導(dǎo)細(xì)胞周圍基質(zhì)蛋白的降解 Bu-PA 受體（u-PAR）及纖溶酶原受體 活化u-PA 原酶形式的u-PA纖溶酶原+纖溶酶原受體 纖溶酶uPA與u-PAR還能激活信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，CPAI （PA 抑制劑） PAI1 是u-PA 的主要抑制劑 PAI2 不同腫瘤表達(dá)意義不一 PAI3 功能不清基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP） 需鈣、鋅離子作輔助因子 MMP 分類 膠原酶：如間質(zhì)膠原酶 （Collagenase） 明膠酶：如明膠酶A (gelatinase A) 間質(zhì)溶素：如間質(zhì)溶素1 、2 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶：、型 可分別降解ECM中各

9、種不同成分 ECM降解的主要蛋白水解酶類金屬蛋白酶抑制物 TIMP-1 ，TIMP-2 浸潤(rùn)與否取決于MMP與TIMP的對(duì)比 胱氨酸蛋白酶類 Cathepsin B 作用 降解ECM中各種膠原、LM、 FN、黏蛋白 激活間質(zhì)膠原酶和IV型膠原酶天（門）冬氨酸蛋白酶 包括組織蛋白酶D,E ( cathepsin D, E ) CD ： 在腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用 CD 表達(dá)的調(diào)節(jié) 不同組織調(diào)節(jié)因素不完全一致 CE 在腫瘤 6.瘤細(xì)胞以主動(dòng)方式入循環(huán)管道并形成栓子 微小淋巴管、微小靜脈壁 縫隙瘤細(xì)胞存在形式 單個(gè) 成團(tuán) 同類癌栓 異類癌栓 黏附分子對(duì)其發(fā)揮調(diào)節(jié)作用 7.在特定器官的毛細(xì)血管滯留并黏著，

10、再次穿過(guò)血管壁并定居、增殖 器關(guān)特異性（選擇性）機(jī)制 (1) 黏附分子的作用 (2) 化學(xué)趨化因子 (3) 微環(huán)境不適合 (4) 與免疫狀態(tài)有關(guān) （二）機(jī)體免疫狀態(tài)與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 參與控制轉(zhuǎn)移的免疫細(xì)胞主要有 NK 細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 T 淋巴細(xì)胞 （三）腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因（四）腫瘤表觀遺傳改變與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移表觀遺傳學(xué)(Epigenetics) -與遺傳學(xué)(genetic)相對(duì)應(yīng)的概念-表型狀態(tài)改變，基因型不改變 -沒(méi)有DNA序列變化的情況下， 可遺傳的基因表達(dá)改變，導(dǎo)致的基因產(chǎn)物的變化。 DNA的“后天性”修飾（如甲基化修飾）、組蛋白的各種修飾等（五）腫瘤干細(xì)胞(tumor st

11、em cell, TSC) 2001年由Reya等提出 2006年美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)（AACR）定義 存在于腫瘤組織中具有無(wú)限自我更新能力并能產(chǎn)生不同分化程度的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞 特征 (1) 無(wú)限增殖和多向分化 (2)存在自我更新的信號(hào)傳導(dǎo)途徑 (3)具不同表型，異質(zhì)性，對(duì)放化療不敏感 (4)具有端粒酶活性 (5)能轉(zhuǎn)移到各種不同的組織 （六）腫瘤微環(huán)境與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移 腫瘤細(xì)胞間質(zhì)細(xì)胞 細(xì)胞外基質(zhì)間質(zhì)細(xì)胞所分泌的活性介質(zhì)（細(xì)胞因子） 共同構(gòu)成的局部?jī)?nèi)環(huán)境 微環(huán)境改變腫瘤細(xì)胞-自分泌和旁分泌 全身和局部組織-代謝、分泌、免疫 結(jié)果： 限制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展 三.腫瘤學(xué)研究中常用的分子生物學(xué)基本技

12、術(shù)及其應(yīng)用(一)基因擴(kuò)增的檢測(cè)1.過(guò)量的蛋白表達(dá)-免疫組化（熒光）定位 -ELISA和Western blot 定量抗原抗體標(biāo)記標(biāo)記抗原標(biāo)記標(biāo)記抗原標(biāo)記標(biāo)記抗原標(biāo)記2.基因拷貝數(shù)的增加、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的增加 - 核酸分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)核酸變性、復(fù)性基本性質(zhì)常用方法 (1)核酸分子雜交（nucleic acid molecular hybridisation）技術(shù)最常用的基本技術(shù)基本原理： -標(biāo)記的已知堿基序列（DNA或RNA單鏈片段）（探針probe ） （同位素P32 I125 非同位素 生物素 地高辛 熒光素） -檢測(cè)靶核酸（待測(cè)核酸）中是否存在與之 同源的序列 1.原位雜交 （IS

13、H）2.熒光原位雜交 （FISH），3.雙色（多色）銀染原位雜交（DSISH）3.Southern blot (DNA 雜交)4.Northern blot (RNA 雜交)（2）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction , PCR）技術(shù) 又稱體外基因擴(kuò)增利用DNA變性和復(fù)性原理體外進(jìn)行特定的DNA 片段高效擴(kuò)增 獲得或放大特異基因信號(hào)的重要手段擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 凝膠電泳分析 瓊脂糖凝膠電泳 (最常用) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 單一條帶 Real-time PCR 原位PCR RT-PCR3.基因芯片技術(shù)(二)基因突變的檢測(cè)方法1.聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（Singl

14、e strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP）長(zhǎng)度相同，但堿基序列不同的單鏈DNA 構(gòu)象不同在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳遷移率（泳動(dòng)率）不同基本方法 作PCR 將產(chǎn)物變性而成為單鏈 進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 顯示結(jié)果 可用同位素/熒光素標(biāo)記 非同位素標(biāo)記 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技術(shù)基本原理 -序列中一個(gè)堿基發(fā)生改變 -使原來(lái)的內(nèi)切酶位點(diǎn)消失或產(chǎn)生新的酶

15、切位點(diǎn)-用限制性內(nèi)切酶消化PCR擴(kuò)增出來(lái)的DNA片段 -檢測(cè)其酶切片段長(zhǎng)度的差異3.變性梯度凝膠電泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)基本原理 電泳時(shí)，不同濃度凝膠溫度不同 DNA鏈中有一個(gè)堿基改變 在不同的溫度發(fā)生解鏈 電泳遷移率改變 4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 熒光原位雜交 ( FISH) 6 DNA 芯片技術(shù)（DNA chip ）（三）腫瘤的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性分析微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability , MI）, 是指簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失 檢測(cè)方法 PCR +

16、 DNA 序列凝膠電泳（四）腫瘤易感性檢測(cè) 遺傳癌癥綜合征與易感性 癌癥綜合征 易感基因視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤 Rb1Wilms 瘤 WT1Li-Fraumeni 綜合征 p53家族性腺瘤性息肉（FAP） APC遺傳性非息肉性結(jié)腸癌（HNPCC） hMSH2, hMSH1乳腺癌 BRCA1卵巢癌 BRCA1 采用相應(yīng)基因變異方法進(jìn)行檢測(cè)（五）腫瘤相關(guān)病毒 核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù) (六) 基因重組技術(shù) 主要目的是獲得某一基因或DNA片段的大 量拷貝 (七) 基因轉(zhuǎn)染（gene transfection）技術(shù)（八）RNA干涉(RNA interference） 核酸雜交/PCR技術(shù)與免疫組化/熒光、WB方法結(jié)合