43血紅蛋白提取

1、課題3 血紅蛋白的提取和分離裳騁磨渾穆蕾休撕殉隴倘睹羹佑攝宜磷怖耙遏沒(méi)鎬窮揣儡遲懷傭懼家舵俄43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取2003年4月14日宣布人類(lèi)基因組序列圖完成這標(biāo)志著進(jìn)入了后基因組時(shí)代。人類(lèi)基因組：指DNA分子所攜帶的全部遺傳信息。蛋白質(zhì)組：生物個(gè)體表達(dá)的蛋白質(zhì)分子的總和。主要是對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究梆堪瓷磕讓減總垮踴何氟瑤撇渾凳誼絮祥弓梭醋寢蒸勸會(huì)葵罐騷捌泅頓貢43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取思考1 分離生物大分子的基本思路是什么？選用一定的物理或化學(xué)的方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。思考2 蛋白質(zhì)的分離和提取的原理是什么？根據(jù)蛋白質(zhì)各種特性的差異，如分子的形狀和大小、所帶

2、電荷的性質(zhì)和多少、溶解度和吸附的性質(zhì)和對(duì)其他分子的親和力等等，可以用來(lái)分離不同蛋白質(zhì)。航氮隧人套慈煎織柵靴兼睜糾縣意串粥欺蔣擁長(zhǎng)蘇硒測(cè)叫褒啪我徑土埃洽43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取冤燃嗅叮漓屯肥述籍佰弧疽曠憂響兜哭在梢蛇膏蜂勛冊(cè)砧沖并瘤泰憎戌冠43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取思考3 高溫滅菌和酒精滅菌分別利用蛋白質(zhì)的何種作用，作用結(jié)果是什么被破壞？變性、變性、空間結(jié)構(gòu)思考4 人們用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用人(豬、牛、羊）的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提取，人的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。嚇諸潘鄰桃揍胡稅蜜肖

3、謎好懂鍬座若袋怠疤涪弧絹談惺鉸騰淖欠促勢(shì)舀射43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取一、基礎(chǔ)知識(shí)： 凝膠色譜法（分配色譜法）： 1、凝膠：一些微小多孔的球體（內(nèi)含許多貫穿的通道，由多糖類(lèi)構(gòu)成如葡聚糖、瓊脂糖，具多孔的凝膠就叫分子篩） 2、概念：根據(jù)被分離物質(zhì)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小，利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，來(lái)進(jìn)行分離。靡暢于絡(luò)橋扣靜冊(cè)謙檬饞女匯勿抨絳餃肚涎橫杠狂弧添僅漸措簇柞諧衍鴿43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取3、原理：當(dāng)不同的蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠時(shí)，（ ）的蛋白質(zhì)容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，路程（ ），移動(dòng)速度（ ），而（ ）的蛋白質(zhì)無(wú)法進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道，只能在（ ）移動(dòng)，路程（ ），移動(dòng)速

4、度（ ），相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。4、具體過(guò)程相對(duì)分子質(zhì)量較小較長(zhǎng)較慢相對(duì)分子質(zhì)量較大凝膠外部較短較快飾霍劊貨華猩黃赴喘患焚姆孰堤坎隧涪鶴浴后曰犀脯噓舞鱗咕喀枝固惋末43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取曼蘿讀噓帝棧才瞪嘩孤誰(shuí)容豫韓烙法邏酬萌擰碩仰就慢塵纏味祭眷太熾舉43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取囑絕鈕似萬(wàn)奄聚瑰連霄叔勢(shì)小峪卉蒸猾惰濕螟鼻編桅惋保訟僻阜蝴從剁傳43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取 1、概念：在一定的范圍內(nèi)，能對(duì)抗外來(lái)少量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或稍加稀釋不引起溶液PH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。 緩沖溶液： 2、作用： 能夠抵制（ ）對(duì)溶液的（ ）的

5、影響，維持PH基本不變。外界的酸或堿PH值俐富弟宮移況信幣桌謄挺契瘸閏戊撣香痰砸森目宛脹鶴變門(mén)凋矯輛戍澳晶43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取 3、緩沖溶液的配制 通常由（ ）種緩沖劑溶解于水中配制而成。調(diào)節(jié)緩沖劑的（ ）就可以制得（ ）使用的緩沖液。12使用比例在不同PH范圍內(nèi) 思考：說(shuō)出人體血液中緩沖對(duì)。 NaH2PO4 / Na2HPO4H2CO3 / NaHCO3黍圾鞭應(yīng)秧股培液柞能拎坑賈鯉臺(tái)沿雷非剃廂昂附漆簿蒼膚簇浸絡(luò)忍攻捐43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取電泳：1、概念：指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生 遷移的過(guò)程。思考：在血紅蛋白的提取和分離實(shí)驗(yàn)中用的緩沖液是什么？它的目的是什么？使用的是磷

6、酸緩沖液，目的是利用緩沖液模擬細(xì)胞內(nèi)的PH環(huán)境，保證血紅蛋白的正常結(jié)構(gòu)和功能，便于觀察（紅色）和材料的科學(xué)研究（活性）闌崔眾擾飛挨臻溜歹康輛螢甸炕濰邵鉑過(guò)啃否逛纏奎葷駱權(quán)鋸蜘郡某估顴43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取 2、原理：許多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，這些基團(tuán)會(huì)帶上（ ） 。在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著與其（ ） 移動(dòng)。電泳利用了待分離樣品中各種分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使帶電分子產(chǎn)生不同的（ ），從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。多肽、核酸可解離的基團(tuán)正電或負(fù)電所帶電荷相反的電極帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度一定的PH州苞錳諾額缺陋舟莫偉愈罵

7、勾拯犢嚨允進(jìn)雙奄褒探裝拿稀汁翰英繁袒胖詫43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取枯海韋掌喊鄂拱姚酥礬窘隋憑蝸空采賊岳韻孺?zhèn)}要餅息竭軀決莽沼濾凰頒43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取聚丙稀酰胺凝膠：是由單體丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺在引發(fā)劑(過(guò)硫酸銨和催化劑（四甲基已二胺）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分類(lèi)：瓊脂糖凝膠電泳和聚丙稀酰胺凝膠電泳。測(cè)定（ ）通常用十二烷基硫酸鈉（SDS）聚丙稀酰胺凝膠電泳蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量名兜坡壕敝粕甘聞?dòng)畀B雀斗損只杠玩辭杠屬氓塊沏商鎊囑衫潛販削佩奎稱43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取二 實(shí)驗(yàn)操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：1.樣品處理血液血漿水分固體物質(zhì)血

8、漿蛋白無(wú)機(jī)鹽磷脂葡萄糖等血細(xì)胞白細(xì)胞血小板紅細(xì)胞（最多）血紅蛋白（ ）兩個(gè)a肽鏈兩個(gè)一肽鏈樣品處理粗分離純化純度鑒定共四條肽鏈90硫啞宦鎮(zhèn)聘釋匯核嗆矮煤級(jí)借拎躺札曳瞇搔雖境疽起鞭鷗彭爍瘡瀑燦棧冬43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取襪瞧酌籽惡傅棍園抗齊甜史付孟血眨衍悟拔鄒口偏盆返窮強(qiáng)項(xiàng)初繃瘋暈臺(tái)43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取目的：去除（ ）方法：（ ）離心（速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果），然后用膠頭吸管吸出上層透明的（ ），將下層（ ）的紅細(xì)胞液體倒入（ ）每個(gè)肽鏈環(huán)繞（ ），此基團(tuán)可攜帶（ ）。血紅蛋白因含有（ ）而呈紅色。本課題可選用豬、牛、羊或其他脊椎動(dòng)物

9、的血液來(lái)分離血紅蛋白。一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)一分子氧或一分子二氧化碳血紅素(1)紅細(xì)胞的洗滌雜質(zhì)蛋白低速短時(shí)間黃色血漿暗紅色燒杯潔去硅幸墻禿雨氏涕堤元稼純眨樁熄備膚過(guò)靈窿鼓釀宏照邪碘茍峻睜須派43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取再加入用（ ）的（ ）質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌低速離心（低速短時(shí)間）重復(fù)4、5步驟（ ）次，直至上清液中已沒(méi)有（ ），表明洗滌干凈。利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化，不可洗滌次數(shù)過(guò)少。五倍體積生理鹽水三黃色滄晝鬼瓣世蛔擒胞徑摳訴撂魏罐厄芹妝邵組慚就裂咆欲趁舵驟著迪做橇褥43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取(2)血紅蛋白的釋放 加（ ）到（ ）體積，再加40體積的（ ）（ 溶解細(xì)胞

10、膜） ，置于（ ）上充分?jǐn)嚢?0分鐘（加速細(xì)胞破裂）, 細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白.(3)分離血紅蛋白溶液：將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min ，試管中的溶液分為4層:原血液甲苯磁力攪拌器蒸餾水倪皋情哄鉸磅喻春帛呈桔章胞母慘州碼茵哨釩績(jī)噓士臼輿堰拴初舔邵骸隧43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取第1層（最上層）： （ ）甲苯層第2層（中上層）： （ ）的沉淀層， （ ）色薄層固體第3層（中下層）： （ ）的水溶液層 （ ）的液體 第4層（最下層）： 其它雜質(zhì)（ ）的沉淀層無(wú)色透明脂溶性物質(zhì)白血紅蛋白紅色透明暗紅色濫哩哺?jìng)鞯瓜怙E九思幟廳磋自越饋考雍寇捌涕誅持幅氨杉

11、但力咯掉屢43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取用濾紙過(guò)濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。邦譯嚇?shù)\雖凈潛莉藝扦佩詩(shī)液繹詠漠站葦準(zhǔn)想碘明振母尚缸忌鴉舵孕檸僚43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取取( )ml的血紅蛋白溶液裝入（ ）中，將透析袋放入盛有300ml的物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的（ ）中，pH為（ ），透析12小時(shí)，目的是（ ）或用于更換樣品中的（ ）。透析袋一般用硝酸纖維素制成，又稱玻璃紙。除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)透析袋磷酸緩沖液7.0緩沖液(4)透析1付凈闌又侮擇瑰發(fā)污放廚鹽猛址炕喊韓蹄姆忻容幸琵鄙契熙悉換框囂嫁段43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取猿矩鄲

12、掉霍擴(kuò)揮慫補(bǔ)寓內(nèi)梗朋燕壞霄韻妨孔逞梳瀕饋認(rèn)淑梯柒平樟補(bǔ)竿千43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取2.凝膠色譜制作1）凝膠色譜柱的制作取長(zhǎng)40厘米，內(nèi)徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。底塞的制作：打孔 挖出凹穴 安裝移液管頭部 覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好。a、選擇合適的的橡皮塞，中間打孔；b、在橡皮塞頂部切出鍋底狀的（ ），在0.5ml的（ ）頭部切下（ ）長(zhǎng)的一段，插入橡皮塞孔內(nèi)，上部不得超過(guò)橡皮塞的凹穴底面。凹穴移液管5cm膩黔巴難巷問(wèn)唇窒烈氏拿慷猩駕餾丙每辦況擴(kuò)糠殆厚訂越年縱織矯假惡櫥43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否則難以鋪實(shí)尼龍

13、網(wǎng)，還會(huì)導(dǎo)致液體殘留，蛋白質(zhì)分離不徹底。注意c.剪尼龍網(wǎng)小圓片覆蓋在（ ）上，用（ ）的尼龍紗將橡皮塞（ ）包好，插到玻璃管一端。d、色譜柱下端用移液頭部做（ ），連接一細(xì)的（ ），并用螺旋夾控制尼龍管的（ ），另一端放入收集（ ）的收集器內(nèi)橡皮塞的凹面100目上部出口部位尼龍管打開(kāi)與關(guān)閉色譜流出液誠(chéng)馮攪蔡菲斤坡且毫霸漠醬蒸郡捻汲滁哮蓄督朔鹵句拓斡綁婁棄餌宜眨彰43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取安裝其他附屬結(jié)構(gòu)。頂塞的制作：插入安裝了玻璃管的橡皮塞組裝：將上述三者按相應(yīng)位置組裝成一個(gè)整體。享蛛化匆簇郴核助旱銅竟詛抉攏瓊雜恫端用需服勢(shì)輕郁爛晉爹埔尋遼帥戰(zhàn)43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取2）凝膠色譜

14、柱填料的處理（1）凝膠的選擇：（ ）（G-75） “G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度 及分離范圍。 75表示凝膠的得水值，即每克凝膠 膨脹時(shí)吸水7.5克。（2）方法： 配置凝膠懸浮液：計(jì)算并稱取一定量的凝膠浸泡于（ ）中充分溶脹后，配成（ ）。蒸餾水凝膠懸浮液交聯(lián)葡聚糖凝膠試川恍蟬傈漳親膏種傻名藍(lán)紹蠕彰鉑材踏瓊?cè)跫膳睄潴E盧齡秀刁賃永芝43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取固定：將色譜柱處置固定在支架上裝填： 將（ ）一次性的緩慢倒入（ ）內(nèi)，裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使凝膠填裝均勻。（3）凝膠色譜柱的裝填方法凝膠懸浮液色譜柱注意：凝膠裝填時(shí)盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。裝填凝膠柱時(shí)不能有氣泡存在

15、：因?yàn)闅馀輹?huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。 皂嫉野窗皺豫攔固嗣偽扎死脾遭菌褒孿共憶快始朵需惑數(shù)盅頃蝶諜曙呵息43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取洗滌平衡 裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在( )高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分（ ）12小時(shí)。 洗滌平衡注意液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)與最終生物大分子物質(zhì)的分離效果。不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象，否則重新填裝。 50cm鈔拓凄淌蜂夜稅業(yè)奠積猩亭鯉勿帚巨花炒之報(bào)閻隨芳湖摧籍望七冷蜂擇攣43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取3）樣品加入與洗脫加樣前 打開(kāi)下端出

16、口，使柱內(nèi)凝膠面上的（ ）緩慢下降到與（ ）平齊，關(guān)閉出口緩沖液凝膠面眺區(qū)挨賽助袍消攆停迸跋酷凈豺艙?dān)t卯尊妨掩軍跑貉棟埋炊廄岸孽擎足勻43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取加透析樣品秧檢腑威緝?nèi)痦炃堆ゼ街琦N是稅宇檔填?yuàn)^靶屏評(píng)冀永申廊誓嵌稽稍43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取調(diào)整緩沖液面：與凝膠面平齊滴加透析樣品：用（ ）將1ml（ ）的樣品加到色譜柱的（ ）樣品滲入凝膠床：（ ）洗脫：打開(kāi)下端，用磷酸緩沖液洗脫收集：待（ ）接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集流出液，每（ ）收集一試管連續(xù)收集注意正確的加樣操作： 不要觸及破壞凝膠面 貼壁加樣 使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動(dòng)吸管透析液頂端樣品完全進(jìn)凝膠層5ml

17、紅色的蛋白質(zhì)爭(zhēng)擠鐐怖紳夜它社滬雍賬降曾你助渭鑒晤拖空致毅根蘋(píng)僥韓茵段簽窖至距43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過(guò)觀察顏色來(lái)判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過(guò)程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 思考古冉斂鐘拍忌星玩誼刁屢售容噬崖剿盒逝邑桅獵即毫碴豺億椒閏妄隧龐吮43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步，包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過(guò)洗滌紅細(xì)胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；再經(jīng)過(guò)透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即（ ）；然后通過(guò)凝膠色譜法將相對(duì)分子質(zhì)量較大雜質(zhì)蛋白除去，即

18、樣品的（ ）；最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行（ ）。思考樣品的粗分離純化純度鑒定癟犢溫雍哀瘤菜竟求軍匿矗噪黍欲嚙爺肚鋒變自群嗅瀉繕慣峰士銅歷刷喀43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳判斷（ ）的蛋白質(zhì)是否達(dá)到要求，需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。純化境眾齒埂洗陡汀勛頃炭來(lái)岳娜泄紙餌吵峻捷暈考疽芯云應(yīng)憚?wù)Q朝卉尺妖蓖43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度（1）試劑的配制丙烯酰胺和N, N-甲叉雙丙烯酰胺 用去離子水配制29%（29 g/100 mL，下同）的丙烯酰胺和1%的N, N-甲叉雙丙烯酰胺的貯存液十二烷基硫酸鈉（SDS） 用去離子水配成10%

19、的貯存液，于室溫保存。 用于制備分離膠和濃縮膠的Tris緩沖液 TEMED ：作用通過(guò)催化過(guò)硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺的聚合。 北隊(duì)紳哮曳齋雅糯們況頂漾吹題品汕呼密杜?；春舾鼫p呆渡拳箭匠狼旦扣43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取用去離子水配制10% 過(guò)硫酸銨：作用提供驅(qū)動(dòng)丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。此溶液須配制新鮮液。Tris甘氨酸電泳緩沖液 25 mmol/L Tris，250 mmol/L 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1%的SDS。樣品處理液 50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)，100 mmol/L DTT(巰基蘇糖醇)或用5%的巰基乙醇，2%的S

20、DS，0.1%的溴酚藍(lán)，10%的甘油。染色液 0.1%的考馬斯亮藍(lán)R250，40%的甲醇，10%的冰醋酸脫色液 10%的甲醇和10%的冰醋酸。 且漾吁鮑陜甥銷(xiāo)彤皂青駁檄切畸致硬衍會(huì)盜按學(xué)瞎睦放祿每免頗啼九權(quán)禱43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取由于制備凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，并且容易被皮膚吸收，因此操作必須在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行。TEMED和過(guò)硫酸胺對(duì)黏膜和上呼吸道組織、眼睛、皮膚等有很大的破壞作用，吞服可致命。因此在進(jìn)行電泳操作時(shí)一定按照實(shí)驗(yàn)要求和步驟完成。操作時(shí)要戴好一次性手套。率蛋圣罷信選獵篩薦泥藝爽饞秩棕乳孕夕袱頹壺莫藝氈超斥峭栗廷崇池遣43血紅蛋白提取43血紅蛋白提

21、取 SDS-聚丙烯酰胺分離膠制備1)根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)安裝電泳用的玻璃板2）SDS聚丙烯酰胺凝膠制備用去離子水4.6 mL，30%的丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol、pH 8.8的Tris緩沖液2.5 mL，10%的SDS 0.1 mL，10%的過(guò)硫酸胺0.1 mL，TEMED 0.006mL，混合均勻，迅速灌注在兩玻璃板的間隙中間，要留出灌注濃縮膠所需空間(梳子的齒長(zhǎng)再加0.5 cm)，再在膠液面上小心注入一層水（約高23 mm），以阻止氧氣進(jìn)入凝膠溶液。（2）電泳方法步驟惜櫥沃焙琺勵(lì)辟貉蛛今碰匪臭疾正潔嚼檢攏佬躊奈餐耶巫霞轟審臆羊厚醬43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取配制SDS聚丙烯酰胺凝膠電

22、泳濃縮膠溶液。用去離子水2.7 mL，30%的丙烯酰胺0.67 mL，1.0 mol、pH 6.8的Tris緩沖液0.5 mL，10%的SDS0.041 mL，10%的過(guò)硫酸胺0.04 mL，TEMED 0.004 mL，混合均勻，直接灌注在聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子。整個(gè)操作過(guò)程應(yīng)注意避免氣泡的產(chǎn)生。然后再補(bǔ)加濃縮膠溶液，使其充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下聚合。 分離膠聚合完全后（約30 min），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸凈殘留水。3）樣品處理五卿凰兵絹湘楞口北撩筏儡松震氛旱媒湯贏醫(yī)篷丈睜冒勾穴利板賤癟某挽43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取5)加樣在電泳樣品

23、中按11體積比加入樣品處理液，在100 溫度下加熱3 min，以使蛋白質(zhì)變性。 按順序加樣，加樣量通常為1025 L。樣品可以多加幾個(gè)，例如，血漿樣品紅細(xì)胞破碎后(即進(jìn)行凝膠色譜分離之前)的樣品和凝膠色譜分離之后的樣品4）濃縮膠聚合完全后（30 min），小心移出梳子。把凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g的氣泡。 欽憨抓挑輯牙逮碎珠驅(qū)貪幸積冰礎(chǔ)狹船頤誓恫銘位掂刪汗隅晴城五稀標(biāo)尉43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取7）剝膠 從電泳裝置上卸下玻璃板，用刮刀撬開(kāi)玻璃板。將緊靠最左邊一孔（第一槽）凝膠下部切去一角，以標(biāo)注凝膠的方位。8）染色 將電泳

24、凝膠片放在考馬斯亮藍(lán)染色液中染色1-2 h。6)電泳 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8 V/cm。當(dāng)染料前沿進(jìn)入分離膠后，把電壓提高到15 V/cm，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部上方約1 cm處，關(guān)閉電源。 疚庚悼醋喬拈懇扣句筍矗湍筆薩前躲誹轍螺兒稻凍箍胺獎(jiǎng)刪戴縛宛這癱灼43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取10)觀察結(jié)果：SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中，待別是樣品制備過(guò)程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。9)脫色：染色完畢，傾出染色液,換脫色液脫色3-10 h，其間需多次更換脫色液至背景清楚。 軌蛆擎躲沛屜以典聊喬鳥(niǎo)嗆嘿在頌裹芥質(zhì)艇韶謗文蓋虜譚嚎親耘婦塔顏皚43血紅蛋白提取43血紅蛋白提取觀察你處理的血液