實驗一植物分生區(qū)細胞染色體制片與有絲分裂過程的觀察 - 植物生產(chǎn)

1、目 錄 TOC o 1-2 h z u HYPERLINK l _Toc162101929 實驗室工作規(guī)程 PAGEREF _Toc162101929 h 1 HYPERLINK l _Toc162101930 實驗一 植物分生區(qū)細胞染色體制片與有絲分裂過程的觀察 PAGEREF _Toc162101930 h 4 HYPERLINK l _Toc162101931 實驗二 核型分析 PAGEREF _Toc162101931 h 10 HYPERLINK l _Toc162101932 實驗三 植物同源多倍體的人工誘發(fā)與鑒定 PAGEREF _Toc162101932 h 12 HYPERL

2、INK l _Toc162101933 實驗四 植物性狀遺傳率估算 PAGEREF _Toc162101933 h 17 HYPERLINK l _Toc162101934 實驗五 性狀雜種優(yōu)勢與顯性程度估算 PAGEREF _Toc162101934 h 19 HYPERLINK l _Toc162101935 實驗六 控制性狀最少基因數(shù)目估算 PAGEREF _Toc162101935 h 21 HYPERLINK l _Toc162101936 實驗七 過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳 PAGEREF _Toc162101936 h 23 HYPERLINK l _Toc1621019

3、37 附 錄 PAGEREF _Toc162101937 h 32 HYPERLINK l _Toc162101938 附錄常用試劑的配制 PAGEREF _Toc162101938 h 32 HYPERLINK l _Toc162101939 附錄 常用染色液的配制 PAGEREF _Toc162101939 h 35 HYPERLINK l _Toc162101940 附錄 常用緩沖液的配制 PAGEREF _Toc162101940 h 38 HYPERLINK l _Toc162101941 附錄 X2值表 PAGEREF _Toc162101941 h 39實驗室工作規(guī)程為保證遺傳學

4、實驗能正常進行并獲得理想的實驗結果，防止在實驗中發(fā)生過失和意外事故，實驗操作者必須嚴格遵守實驗室規(guī)那么，認真做好實驗前后和實驗過程中的各項工作。一、根本規(guī)那么1實驗前必須預習，明確本次實驗的目的、原理、內容和方法。實驗時須保持安靜，按實驗教材和指導教師的要求進行操作，并詳實記錄實驗中出現(xiàn)的情況和獲得的實驗結果，對資料進行整理分析，得出結論，寫出實驗報告。2實驗室、工作臺、各種儀器、用具、玻璃器皿等必須保持清潔整齊，工作臺要嚴防酸、堿腐蝕。各種化學藥品、試劑等必須貼上標簽，分門別類，放置一定位置，便于取用。3正確使用顯微鏡及各種儀器，切勿使染料或試劑沾污鏡頭、鏡臺和所用儀器。如有沾污，須立即用鏡

5、頭紙擦拭干凈。4取用藥品時，所用各類量具必須分開，嚴禁混用，用后須立即沖洗干凈。稱量固體藥品時，必須在秤盤上鋪墊清潔白紙或蠟光紙，調試平衡后再稱，以防藥品腐蝕秤具。稱量紙要做到一稱一換，以防藥品混雜，導致所配試劑不純。5遵守化學實驗的操作要求，注意藥品配制和使用時的平安。6實驗完畢，須做好清潔整理工作，所用儀器、物品應放復原處。實驗過程中如有損壞或喪失儀器用具，應如實填寫報告單，視情況進行相應處理。7全班實驗結束后，值日生安排整個實驗室的全面清理清掃。離開實驗室前，必須關閉所用儀器和燈具的電源，關緊水龍頭和門窗。二、顯微鏡的清潔和保養(yǎng)顯微鏡是遺傳學實驗的重要儀器，使用時必須防塵、防高溫、防濕、

6、防藥品侵蝕，在清潔保養(yǎng)中要做到以下幾點：1取鏡時必須一手提鏡臂，一手托鏡底，防止顯微鏡滑落損壞。2取出顯微鏡后，先用軟毛刷、紗布拂擦鏡身的防塵污物，用洗耳球吹去縫隙及鏡頭上的灰塵和纖維等物，再用鏡頭紙擦拭物鏡和目鏡，最后用細白絲綢把鏡頭再擦一次。3鏡檢時物鏡只能由低倍鏡到高倍鏡，在高倍鏡下只能用微調螺旋調焦，細心操作，以防壓碎玻片，損壞鏡頭。4假設發(fā)現(xiàn)鏡頭被藥物或臟物污染，立即用擦鏡紙醮少許二甲苯以剛濕潤紙為度擦掉污物，再用擦鏡紙擦干。5用完顯微鏡后進行清潔整理，將載物臺放至最低處，轉動物鏡使之不要對著聚光鏡，將顯微鏡放回原處。6嚴禁將顯微鏡與化學藥品混藏。三、玻璃器皿的清潔 實驗室所用玻璃器

7、皿的清潔與否直接影響實驗結果，實驗前必須對玻璃器皿徹底清洗。一初用玻璃器皿的清洗 1新購置的玻璃器皿外表常附有游離的堿性物質，可先用肥皂水或去污粉洗刷，再用清水沖洗干凈，然后用12的鹽酸浸泡4h以上，再用清水沖洗后用蒸餾水沖洗23次，100130烘干備用。2新載玻片和蓋玻片分別在鹽酸乙醇7095工業(yè)乙醇C2H5OH100ml加濃鹽酸HCl2ml中浸泡4h，流水沖凈，蒸餾水蕩滌、晾干，置95乙醇中加蓋，以便隨時取用。二使用過的玻璃器皿的清洗1使用過的器皿應在未干前洗滌，如不能及時清洗，應浸在涼水中。洗滌方法：放入洗衣粉水中煮沸半小時，刷洗，清水沖凈，蒸餾水蕩滌，晾干或烘干；或在洗滌液中浸泡半小時

8、，清水沖洗，蒸餾水蕩滌，晾干或烘干。2對移液管、滴定管、量筒、量器等，使用后應立即浸泡于涼水中，防止殘留的溶液干涸，難以清洗。工作完畢后用流水沖洗，除去附著的試劑、蛋白質等物質，晾干后浸泡在鉻酸洗液中46h或過夜，再用清水充分沖洗，最后用蒸餾水沖洗24次，風干后備用。注：鉻酸洗液配制方法 重鉻酸鉀K2Cr2O7 20g，濃硫酸H2SO4，工業(yè)用，比重1.84或廢硫酸100ml，清水100ml。先將重鉻酸鉀溶于溫水，冷卻后徐徐參加濃硫酸，防止發(fā)熱。此液呈紅色，加蓋防氧化變質，反復使用至變藍黑色為止。器皿玻片洗凈后再用此液浸泡，可延長其使用時間。3陳舊或用過的永久制片的玻片，可先在肥皂水中煮沸51

9、0min，或將玻片微熱后浸入二甲苯中脫膠，洗去殘留的樹膠和漿糊，并用清水沖洗干凈。然后放入洗液中浸泡30min，再用清水沖洗掉殘留的洗液，最后用蒸餾水洗凈，置95乙醇中保存?zhèn)溆?。四、玻璃器皿的枯燥和滅菌遺傳學實驗中以微生物為實驗材料時，實驗所用的玻璃器皿必須枯燥和高溫滅菌，防止雜菌污染。一枯燥枯燥的方法有自然晾干和烘干兩種。自然晾干所需時間長，但器皿上無水漬。烘干是將器皿及其它用具置6080烘箱中枯燥，但器皿上可能留有水漬，因此，在枯燥之前應盡可能除去器皿上的水滴。二滅菌因高溫能使微生物蛋白質變性，所以高溫處理能到達滅菌的目的。高溫滅菌的方法有干熱滅菌法和濕熱高壓滅菌法兩種。1干熱滅菌法 將器

10、皿及用具置160 2h，即可利用熱空氣殺死所有微生物及芽孢。在干熱滅菌過程中要注意：1烘箱內忌放易燃、易揮發(fā)物品，物品不能裝得太滿，棉塞等物品不能接觸烘箱壁，以免發(fā)生燃燒事故。2烘箱溫度達100以上后，切忌翻開烘箱玻璃門，否那么新鮮空氣進入會引起燃燒，或因劇烈的冷熱變化而使玻璃器皿爆裂。2濕熱高壓滅菌法此法高溫與高壓結合，蒸汽傳熱均勻，滅菌時間短，效果好。常用各種高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌。一般當蒸汽壓力達1520 lb/in2、溫度達121125時，保持2040min即可到達滿意的效果。用此法滅菌應注意：1滅菌鍋內水量要適當，過少會燒干而發(fā)生事故，過多會導致消毒物品水濕。2滅菌開始時翻開放氣閥，

11、加熱使蒸汽將鍋內的冷氣排出，然后再關上放氣閥繼續(xù)加熱。否那么滅菌效果不好。3滅菌加熱時要隨時注意壓力變化，如壓力指針超過紅色警戒線而平安閥仍未放氣，那么可能是平安閥失靈，應立即停止加熱，以防爆炸。4溶液或培養(yǎng)基滅菌后不能立即放氣， 以免器皿炸裂或溶液噴出，需待其自然冷卻，壓力降至零時才可翻開放氣閥，揭開鍋蓋。實驗一 植物分生區(qū)細胞染色體制片與有絲分裂過程的觀察實驗目的1. 學習并掌握根尖或葉片材料處理、染色、壓片及制片觀察的方法。2. 觀察有絲分裂各時期染色體的形態(tài)變化，了解有絲分裂全過程。實驗原理熟悉有絲分裂過程、掌握有絲分裂染色體制片方法與技術是研究染色體形態(tài)結構、檢查染色體數(shù)目、進行核型

12、分析與帶型分析的根底。高等植物有絲分裂主要發(fā)生在根尖、莖尖生長點及幼葉等器官的分生組織(分生區(qū))，這些分生組織均可以用作制片材料；另外愈傷組織、懸浮培養(yǎng)物等分生組織也可用作制片材料。其中根尖是最常用的材料，其原因有以下幾個方面：根尖取材容易，操作和鑒定也比其它器官與組織方便；實驗室內采用種子萌發(fā)后所長出的新鮮幼嫩根尖，不受植物生長季節(jié)的影響和限制，并且可以大量獲得；對于某些珍貴而又稀少的試驗材料，取用自然條件下生長植株的根尖，比取用莖尖、花器等對材料的傷害要小得多；采用實驗室內種子發(fā)根，切取根尖后的種苗通常還可以進行正常種植，利于后續(xù)研究進行。對于特別珍稀的材料，如轉基因植株花藥或花粉培養(yǎng)誘導

13、出的花粉植株、孤雌生殖植株，以及通過克服遠緣雜交的不親和性和遠緣雜種的不育性所獲得的珍貴材料，沒有種子或種子數(shù)目非常稀少，有時剪取幼根也會影響植株的生活力。另外，有些植物根尖小、取材不方便或根尖壓片較難(如高梁)。這些情況下采用葉片壓片法對材料的傷害是最小的，取材也非常方便，而且可以免去實驗室發(fā)根工作。有絲分裂期在整個細胞周期中所占的時間相對較短，有絲分裂制片的主要目的是進行染色體鑒定，希望觀察到更多分裂相,尤其是分裂中期相，通常要對材料進行不同的預處理。預處理主要通過抑制和破壞紡錘絲的形成來獲得更多的中期分裂相；同時，預處理還可改變細胞質的粘度，促使染色體縮短和分散，便于壓片和觀察。常用的預

14、處理有物理法、化學法、混合處理法等。植物細胞的細胞壁對細胞形態(tài)和結構起支撐和保護作用，分生組織的細胞壁結構將分生細胞結合成一個整體，因此在壓片之前需要采用適當方法軟化或局部分解細胞壁使細胞間易于別離，這一操作稱為解離。同時，解離也可適當去除局部細胞質，使細胞質背景趨于透明化，便于觀察染色體。常用的解離方法主要有酸解法和酶解法。酸解法步驟簡便、容易掌握。根尖分生組織經(jīng)過酸解和壓片后，都呈單細胞，但大局部分裂細胞的染色體還包在細胞壁中間。酸解法廣泛用于染色體計數(shù)、核型分析和染色體畸變的觀察及相關分析。酶解法常用于染色體顯帶技術或姊妹染色單體交換研究。通過解離和壓片，分生細胞的原生質體能夠從細胞壁里

15、壓出，使染色體周圍不帶有細胞質或僅有少量細胞質，讓后續(xù)制片處理直接作用于染色體。果樹染色體的制備常用酶解法。在普通光學顯微鏡下觀察染色體形態(tài)結構還需要對材料進行染色，通常采用染色體染色效果好而細胞質著色少的堿性染料、酸性染料或孚爾根試劑染色。實驗材料蠶豆(Vicia faba, 2n=2x=12)、黑麥(Secale cereale, 2n=2x=14)、大麥(Hordeum sativum, 2n=2x=14)、普通小麥(Triticum aestivum, 2n=2x=42)、玉米(Zea mays, 2n=2x=20)、豌豆(Pisum sativum, 2n=2x=14)、洋蔥Aill

16、um cepa，2n16等根尖或幼葉，紅桔(Citrus reticurata，2n=2x=18)、梨Pyrus communic,2n=2x=34等的幼葉或其它分生組織。實驗器具、藥品顯微鏡、恒溫箱、水浴鍋、計時器、培養(yǎng)皿、酒精燈、小燒杯、試管、載玻片、蓋玻片、鑷子、剪刀、刀片、解剖針、吸水紙、紗布、標簽、鉛筆、橡皮等常用工具。醋酸洋紅、醋酸地衣紅、鐵礬-蘇木精、改進苯酚品紅等染液，秋水仙堿， 8-羥基喹啉，飽和對二氯苯溶液或飽和-溴萘，卡諾氏固定液，F(xiàn)AA固定液，冰乙酸，甲醇，無水乙醇，95乙醇，0.1升汞，mol/L鹽酸，果膠酶與纖維素酶混合液等。實驗方法一、植物根尖壓片法1發(fā)根 將蠶豆

17、、玉米、黑麥等植物種子用0.1升汞消毒10min，經(jīng)流水沖洗，溫水浸種浸泡12d后，置25恒溫箱中發(fā)根。待主根長到2cm左右時剪去主根須根系植物的種子發(fā)出的主根不需剪掉，讓其充分長出側根。待側根長到1 2cm時，于適宜時間用蒸餾水洗凈，將水吸干，剪取根尖0.5 1cm進行預處理。假設以洋蔥為材料，將洋蔥磷莖置于盛水的燒杯口上，使洋蔥鱗莖與水相接，在25下發(fā)根。為獲得盡可能多的分裂相，蠶豆根尖以上午910時剪取為宜，洋蔥根尖以中午12:3013:30切取為宜。2預處理 1秋水仙堿、或飽和對二氯苯水溶液、或mol/L 8-羥基喹啉處理：將剪下的根尖立即放入秋水仙堿、或飽和對二氯苯水溶液、或mol/

18、L 8-羥基喹啉中，以藥液浸沒根尖為度，處理34h。抑制和破壞紡錘絲的形成，使根尖細胞延遲其染色體的別離，增加中期分裂相，并使染色體分散于細胞中，以便觀察計數(shù)。2冷處理：將根尖放入盛有蒸餾水的指形管中，置04的冰箱或在冰水中處理2440h，染色體數(shù)較多的實驗材料可適當延長處理時間，但需注意勿使材料結冰。此法簡便、平安，效果也好，而且經(jīng)冰水混合物處理后細胞破裂程度較小，染色體不致喪失；其染色體的收縮程度較小，常用于顯帶技術，有利于得到更細致豐富的染色體帶型。3混合藥劑處理：在某些情況下，采用混合藥劑處理可取得更好的效果。如：100ml對二氯苯飽和水溶液加12滴-溴萘飽和液處理34h，0.2秋水仙

19、堿溶液加1滴-溴代萘飽和水溶液處理12h等。應該注意采用藥劑處理時溫度不能過高，以1015為宜。3固定 材料經(jīng)預處理后，用流水沖洗，然后投入卡諾液3份甲醇1份冰乙酸，現(xiàn)配現(xiàn)用中固定2024h，用95的乙醇洗兩次，轉入70乙醇中保存?zhèn)溆?。固定的目的是將材料迅速殺死，并使染色體形態(tài)、結構盡可能保持不變和便于染色。4解離 常用酸解法：從70乙醇中取出固定好的根尖流水沖洗min吸水紙吸干放入小試管中加適量1 mol/L HCl于60水浴解離1015min(蠶豆根尖10min，玉米、黑麥、洋蔥15min)。 對于玉米、黑麥和洋蔥等，有時酸解后還可在25下酶解20min。5染色 針對不同材料或希望獲得不同

20、的效果，可選擇適當?shù)娜疽汉腿旧椒āＳ糜诔Ｒ?guī)染色體形態(tài)結構鑒定的染色方法很多，常用的有如下幾種。1 改進苯酚品紅染色：假設只作臨時鏡檢觀察，對解離后材料水洗并吸干，挑取根尖乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加12滴染液，染色1015min，壓片。2孚爾根反響染色：將解離材料洗凈或直接轉入席夫試劑于室溫(最好在10左右) 進行孚爾根染色反響15h或過夜，然后在漂洗液中漂洗3次，每次510min，再經(jīng)流水沖洗510min，保存于45乙酸中供壓片。假設材料染色缺乏，也可再用1醋酸洋紅復染壓片。孚爾根反響是鑒別細胞中DNA的一種組織化學方法，它僅對核及染色體中的DNA顯色，顏色比擬均勻一致而清晰，細

21、胞軟化較好。染色后染色體一般比擬柔軟，壓片時較長的染色體容易相互糾纏而不便于分散。試驗說明，蠶豆、小麥、黑麥、洋蔥、蔥、蒜、百合等均適合于孚爾根染色。注：孚爾根染色反響材料必需采用酸解法進行解離，并且對前處理要求較高，解離時間過長，孚爾根反響會減退；減退程度還與固定劑種類有關，一般卡諾氏固定液的減退作用比FAA固定液明顯。因此孚爾根反響染色可采用FAA固定材料，然后將固定材料經(jīng)過50乙醇轉入水中，再轉入1mol/L HCl中，于60水浴中解離515min，并迅速換入1mol/L 冷HCl中。解離材料經(jīng)水洗12次或直接進行孚爾根反響。31醋酸洋紅染色：假設只作臨時鏡檢觀察，將解離水洗后的材料吸干

22、，挑取根尖乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加12滴染液，染色1020min，壓片。4醋酸地衣紅染色：將材料置盛染液的試管中，在酒精燈上加熱35s，反復23次，靜置1030min或更長時間。取出材料用染液壓片，可在壓片后稍加熱以加深染色。注：由于醋酸地衣紅易溶于乙醇，因此70乙醇保存材料取出后應當充分洗凈后浸入45乙酸中再進行染色。5鐵礬-蘇木精染色：經(jīng)HCl解離后的材料用流水徹底沖洗后，轉入新鮮配制的4鐵礬溶液媒染24h如加溫至3040媒染，那么可縮短至1h左右，再用水沖洗2025min，務必將殘留的鐵礬洗凈。媒染后材料轉入0.5蘇木精中染色24h或更長時間如參加蘇木精后，染液很快混濁、發(fā)

23、黑，那么表示鐵礬未洗凈，需重新沖洗，再行染色，染色后用水沖洗510min，置45乙酸內分色、軟化1020min可再經(jīng)1氨水處理1min，使材料充分軟化，壓片假設染色后暫時不壓片，可將材料轉入70乙醇或蒸餾水保存于4冰箱中。注：經(jīng)染色后，除染色體能染上極深的藍色外，細胞壁及細胞質也都能不同程度地著色；同時由于染色體吸附有媒染劑的金屬離子，易變堅硬，壓片后易分散。因此必需用45乙酸處理，以使染色體呈深藍色，而細胞質退淡，染色體軟化。此法對各種植物的染色體均可染上較深的顏色、反差大、分色清晰，利于攝影和制片標本長期保存，為其他染色方法所不及。6壓片 在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水

24、紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平，便于觀察。7鏡檢 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少數(shù)，因此壓片后要認真仔細地進行鏡檢。先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡或油鏡仔細觀察、記數(shù)或拍照。調節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗適宜，視場亮度適中。注意觀察有絲分裂全過程的染色體形態(tài)變化，找出染色體分散好的中期細胞進行染色體計數(shù)，對好的分裂圖像作上標記，以便再觀察。8臨時封片保存制片短時間保存要防止玻片間的溶液干涸，空氣進入，無法觀察。臨時片保存可在蓋片周圍滴上45乙酸或染液，放入有濕濾紙的培養(yǎng)皿內，加蓋后可保存數(shù)小時到一天。如制片標本符合

25、要求，而又只需要短期(一般在一周以內)保存，可采用石蠟臨時封片。用燒紅解剖針挑取少量石蠟(或石蠟與凡士林等體積混合物)沿蓋片周圍封閉。制作完成的制片標本要貼上標簽，注明材料名稱、可觀察到的有絲分裂典型時期、制片時間、制作者等信息。二、植物葉片染色體壓片法1取材 為排除葉綠素可能造成的干擾，又能取得葉片分生組織局部，各種植物均以取幼嫩的心葉或幼嫩的小葉為佳。取材時間一般于上午9:0011:00(隨植物種類而異)。以麥類植物為例，在分蘗期取未拔節(jié)分蘗心葉，上午10:00左右逐層剝除外層綠色葉片，留下成筒狀尚未伸展也無明顯葉鞘結構的心葉和次心葉。剪去有葉綠素的局部，留下一段5 mm10mm幼嫩的基部

26、基部為葉片分生組織區(qū)，細胞分裂活動旺盛。為了便于區(qū)分材料的上下部位，要把兩個斷頭剪成不同的形狀，如上尖下齊。2預處理 取得葉片材料可采用下述方法之一進行預處理：(1) 將材料放入蒸餾水中，置14冰箱內20hmol/L 8-羥基喹啉溶液內3h，然后用水沖洗；(3) 將材料放入0.2秋水仙堿溶液內2h，然后用水沖洗。3固定 經(jīng)預處理以后的材料洗凈后投入卡諾氏液，固定1220h?？焖俟潭稍?0 條件下，在1560min內完成。也可采用FAA固定液進行固定。固定后用梯度濃度乙醇換洗，保存于70乙醇中備用。4解離 一般葉片采用酸解法即可到達很好的解離效果，以下解離方法效果相當，可任選一種進行處理：(1

27、) 1mol/L HCl，于60水浴中內處理815min；(2) 5mol/L HCl，于室溫(25)處理815min；(3) 95乙醇和濃鹽酸(3:1)解離液，于室溫(25)處理510min，解離后流水沖洗材料。5染色 凡適用于根尖的染色方法均適用于葉片， 常用染色法有(1) 醋酸洋紅染色；(2) 改進苯酚品紅染色；(3) 鐵礬-蘇木精染色。通常直接用前兩種染液之一進行壓片即可到達較好的染色效果。采用醋酸洋紅染色時可用酒精燈輕微加熱來加快染色，并軟化組織；如果染色缺乏，可在蓋片四周加一滴染液，待其滲透后重新壓片。采用鐵礬-蘇木精染色時，材料需經(jīng)流水反復沖洗后，用4鐵礬溶液媒染約20min，再

28、用流水反復沖洗后，用0.5蘇木精溶液染色12h，用水沖洗，保存于蒸餾水中即可壓片。6壓片 切取幼葉基部(材料齊頭方)左右，置于載玻片上用刀片切碎，加一滴染液(在用鐵礬-蘇木精染色時應滴加45的乙酸)，加蓋片，壓片。7鏡檢 先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細觀察。8臨時封片保存 同根尖壓片?？记绊氈緦嶒炛惺褂玫念A處理化學試劑具有強烈的致癌作用，在使用過程中應嚴格按實驗室平安規(guī)那么進行操作，廢液應經(jīng)專門回收處理以免造成環(huán)境污染。作業(yè)制作細胞有絲分裂前、中、后、末各期的制片一張，中期應能數(shù)清染色體數(shù)。貼上標簽，注明材料名稱，染色方法，制片日期和制作者姓名。2繪制所觀察到有絲分裂典型時期

29、的染色體圖像，并簡要說明各時期染色體的行為變化和特征。實驗二 核型分析實驗目的1學習和掌握核型分析的方法。2進一步了解染色體形態(tài)特征、在細胞分裂中的聯(lián)會形象以及染色體組、核型及染色體數(shù)目、結構變異與生物進化的關系。實驗原理 因為核型分析能明確識別各個染色體的特征，通過核型分析可以了解不同物種、同一物種不同亞種、或家畜不同品種甚至同一品種不同個體之間染色體結構的差異，有助于基因定位及其它遺傳分析。實驗材料動、植物有絲分裂中期染色體相片。實驗器具、藥品 不銹鋼尺，小剪刀，小鑷子，繪圖紙，粘劑，座標紙等。實驗方法1準備染色體標本的相片 將制作的細胞輪廓清楚，染色體集中而不重疊，主、次縊痕和隨體清晰，

30、染色體長度適中而不彎曲的染色體標本，通過顯微攝影或描繪、沖洗、放大成染色體相片。2染色體測量 目測相片上每條染色體長度，按長短順序初步編號，寫在每條染色體相片反面，用鋼尺逐個測量每條染色體長度長臂長、短臂長，根據(jù)相片的放大倍數(shù)放大倍數(shù)某染色體相片上長度m/ 某染色體實際長度m換算出各條染色體的實際絕對長度、相對長度、臂比及著絲粒位置，有隨體的染色體，其隨體長度和次縊痕長度可計入全長，也可不計入，但必須加以說明。將測量和計算的數(shù)據(jù)分別記錄如表8-2和表8-3。3排列核型圖 按上述標準及計算結果，將照片上的染色體剪貼配對，重新編號。著絲粒排在同一水平線上，短臂在上，長臂在下。排列好后進行分析比擬，

31、確定其核型是否正常。假設要準確細致分析，必須進一步運用染色體顯帶技術。4繪制核型模式圖 根據(jù)前面的計算結果和排列的核型圖，用繪圖紙和座標紙座標紙放在繪圖紙下面繪制核型模式圖。橫座標為染色體序號，縱座標為染色體臂的相對長度，“0”為長、短臂的分界線，長臂在下，短臂在上。作業(yè)1制作染色體核型圖，并繪制染色體模式圖。2簡要描述實驗所測核型的分析結果。表2-2 核型分析實測記錄表序號條實測長度mm序號條實測長度mm長臂短臂臂比長臂短臂臂比123456789101112131415161718192021222324.表2-3 核型分析計算表序 號對實測長度mm相對長度臂比染色體類 型長臂短臂全長長臂短

32、臂全長123456789101112.總 和實驗三 植物同源多倍體的人工誘發(fā)與鑒定實驗目的1. 了解人工誘發(fā)同源多倍體植物的原理，初步掌握秋水仙堿誘發(fā)多倍體的方法。2. 觀察同源多倍體植物植株(器官)形態(tài)特征與細胞學特點，了解同源多倍體鑒定方法。3. 了解同源多倍體在生物進化與植物育種上的意義。實驗原理植物同源多倍性變異可能通過減數(shù)分裂與有絲分裂產(chǎn)生。前者可能是自然界中多倍體形成的主要途徑，而人工誘發(fā)植物多倍體主要通過有絲分裂過程加倍獲得，秋水仙堿是最為常用而有效的處理藥劑。秋水仙堿是從百合科秋水仙屬的一個種秋水仙(Colchicum autumnala L.)的器官和種子中提練出來的一種植物

33、堿，化學分子式為C22H25O6N。紡錘絲主要化學成分為蛋白質，而蛋白質分子之間由硫氫基形成二硫鍵聚合。秋水仙堿能抑制硫氫基，同時保持細胞活性，因此它能阻止蛋白質分子聚合，或使已構成紡錘絲的蛋白質分子間發(fā)生解聚，從而阻止分裂細胞形成紡錘絲或破壞紡錘絲。常用的有效濃度為0.01-1.0% ，木本植物采用的濃度相對較高，可達1.5% ，而蔬菜或處理幼嫩材料等適用的濃度那么較低，一般不超過0.5% 。處理方法可用水溶液浸漬、涂抹或點滴植物的分生組織，使每個復制為二的染色體不能向兩極分開，同時細胞也不能分裂成兩個子細胞，每個細胞內染色體增加一倍，形成多倍體細胞。經(jīng)加倍的細胞，如無藥劑作用，仍然能進行正

34、常的有絲分裂，由此而產(chǎn)生的子細胞，一般說都是多倍性細胞。從這種細胞分化出來的植株就是多倍體。由于同一組織的不同細胞有絲分裂并不同步，如果已加倍的細胞在下一次細胞分裂時再次加倍可產(chǎn)生更高倍數(shù)的細胞，而出現(xiàn)混倍性現(xiàn)象。由多倍體的組織分化產(chǎn)生的性母細胞，經(jīng)減數(shù)分裂和受精結合仍產(chǎn)生多倍性后代。人工誘發(fā)的同源多倍體植物主要特征為：器官和細胞的增大，如氣孔、花器、花粉粒、種子、果實等局部明顯增大；氣孔數(shù)目減少而密度變稀；氣孔內葉綠體數(shù)目增加。減數(shù)分裂過程中染色體聯(lián)會別離不正常、分配不平衡，配子育性降低。鑒定多倍體植株的方法有形態(tài)學鑒定和細胞學鑒定兩種。形態(tài)學鑒定是觀測葉片氣孔保衛(wèi)細胞、花、果實、種子的形態(tài)

35、、花粉粒大小及育性等性狀的變異進行間接鑒定。細胞學鑒定觀測根尖、莖尖分生組織或花粉母細胞的染色體數(shù)目，直接鑒定。在顯微鏡下觀測細胞或其內含物的大小時，通常需借助于目鏡測微尺和鏡臺測微尺。一般目鏡測微尺的刻度全長為5mm，分成50格或100格。鏡臺測微尺的刻度全長1mm，分為100格，每小格長度為0.01mm。由于使用的顯微鏡放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺所代表的實際長度也不同，故使用前必須先求出目鏡測微尺和鏡臺測微尺兩者刻度間的換算值。具體方法是：在顯微鏡下把目鏡中的目鏡測微尺與放在載物臺上的鏡臺測微尺兩者的刻度線對準并重合，計數(shù)二者重合刻度線間的格數(shù)，然后按下式計算目鏡測微尺每格的實際長度(m)。

36、在使用顯微鏡觀測標本時，即移去鏡臺測微尺，根據(jù)目鏡測微尺量出被測物體的格數(shù)，乘以換算值，即得實際長度(m)。當變換顯微鏡的目鏡或物鏡放大倍數(shù)時，須重新計算換算值。注意不同的顯微鏡即使放大倍數(shù)相同，或同一顯微鏡非同一次使用，也必須分別測算其換算值。實驗材料1. 玉米(Zea mays, 2n=20)、大麥(Hordeum vulgare，2n=14)、黑麥(Secale cereale, 2n=14)、西瓜(Citrullus vulgaris，2n=22)、蠶豆(Vicia faba，2n=12)、亞洲棉(Gossypium arboreum，2n=26)等植物種子。2. 水稻(Oryza s

37、ativa, 2n=24)、大麥(H. vulgare)、西瓜(C. vulgaris)等植物幼苗(或種子)，葡萄等植物植株或插條。3. 水稻(O. sativa)、大麥(H. vulgare)、黑麥(S. cereale)等植物二倍體和同源多倍體的種子、葉片等植株、器官新鮮材料、標本或照片。實驗器具、藥品普通顯微鏡，目鏡測微尺，鏡臺測微尺；剪刀，鑷子，刀片，解剖針，載玻片，蓋玻片；燒杯，廣口瓶，培養(yǎng)皿，吸水紙，恒溫箱，紗布，吸水紙等。0.05%0.1% 秋水仙堿溶液，無水乙醇，冰乙酸，1% I-KI溶液，1mol/L鹽酸；改進苯酚品紅染色液，蘇木精-醋酸龍膽紫(或結晶紫)；0.1%0.2%

38、AgNO3等。實驗方法一、植物根尖多倍體的誘發(fā)1.將玉米、大麥、蠶豆、黑麥、西瓜等種子洗凈后用水浸泡12d，然后擺放在鋪有濕潤濾紙(或紗布)的培養(yǎng)皿中置于2528條件下發(fā)芽，芽越壯越好。當根長到1cm以上時取出洗凈，將水吸干。2.移至%0.2% 的秋水仙素溶液中，使根部浸在藥液中，根尖朝下，25條件下處理直到明顯膨大為止(24h左右以至36h)；另設一清水處理對照。處理過程中注意勿使藥液干涸。注：在處理洋蔥時，必須先剪去老根，然后置于盛滿水的瓶口上，待長出新的不定根后，再行處理。3.取出材料洗凈，用卡諾氏液固定1h，以備鏡檢。二、多倍體植物的誘發(fā)(參見表3-1)表3-1用秋水仙堿處理局部植物誘

39、發(fā)多倍體的技術材 料處理部位藥劑濃度(%)處理時間溫度()處 理 方 法黑 麥萌芽種子35h27用剛張口的麥芽種子浸種。小麥黑麥幼 株45d分蘗期中掘起幼苗，洗凈根部浸于藥劑中。秈稻粳稻幼 株1011d56片葉時洗凈細根，在莖基用刀割一切口，不要損傷生長點。油 菜幼 苗10d子葉初張時滴藥液于頂芽，每天23次。棉 花種 苗6h2326將種子水浸24h之后，去掉種皮催芽4d，把種芽倒轉幼根向上而嫩莖浸入藥液。幼 株6h2326將種子播于紙制營養(yǎng)缽中，23片真葉時，將缽倒轉使莖尖侵入藥液。西 瓜幼 苗0.20.627d將藥液滴在幼苗生長點上。馬鈴薯種 子將種子放在滅過菌的盛有秋水仙堿溶液與2% 瓊

40、脂等量混合物的培養(yǎng)皿中發(fā)芽，種子萌發(fā)后洗凈并移植。蘋 果幼 枝頂 芽盆栽幼枝約高25cm時，去掉小葉暴露頂芽，將秋水仙堿和入0.65% 瓊脂內，涂到芽上，保持濕潤，下部副芽要去掉。甜 橙萌芽種子7296h1.種子處理(1) 取蠶豆、亞洲棉等植物種子置%0.1% 秋水仙素溶液中(2025)浸種24h，取出種子用自來水沖洗23次。(2) 將種子移至放有被0.025% 秋水仙素溶液潤濕下的吸水紙的培養(yǎng)皿中加蓋，放入20培養(yǎng)箱內發(fā)芽，一般處理兩天就可長出幼苗。對枯燥種子比浸過種的種子要多處理1天，種皮厚發(fā)芽慢的種子應先催芽后進行處理。由于秋水仙素能阻礙根系發(fā)育，所以對已發(fā)芽的種子應用較低的秋水仙素溶液

41、處理較短的時間。(3) 處理后取出幼苗，用自來水緩慢沖洗以免損傷，然后將幼苗移栽到大田或盆缽內，同時播種未經(jīng)處理的種子幼苗作為對照。2.幼苗處理(1) 水稻、大麥取已有56片葉的水稻或大麥幼苗，洗凈根部，用刀片在分蘗處割一淺傷口，然后浸入0.05% 秋水仙堿溶液中，在2025條件下處理45d，并保持足夠的光線。處理后用水洗凈幼苗進行盆栽，以便與對照觀察比擬。(2) 西瓜先將二倍體西瓜種子浸種催芽，當胚根長到1cm時，將胚根倒置于0.2%0.4% 秋水仙素溶液的培養(yǎng)皿中置25溫度下浸漬2024h，注意處理時需要用濕濾紙將根蓋好，防止失水。處理后的幼苗，經(jīng)水洗進行栽種或砂培。另外也可以采用田間處理

42、幼苗的方法，即當幼苗子葉展平時，每天早晚用0.25% 或0.4% 秋水仙素溶液滴浸生長點各一次，每次12滴，連續(xù)處理4d，遮陰保持濕度。以上兩種方法獲得四倍體西瓜，用四倍體作母本與二倍體西瓜雜交，在四倍體植株上就結出三倍體種子(3n=33)。為了保證所結的種子是三倍體，常用具有黑條紋瓜皮色顯性基因作為標記性狀的2n品種作為父本，這樣在4n2n的后代中，但凡長出黑條紋瓜的都是3n植株，以區(qū)別4n株間偶然授粉產(chǎn)生4n西瓜。3.芽處理選用葡萄植株或插條等果樹的頂芽或腋芽生長點進行處理。將芽部固定一個蘸有0.5%0.7% 的秋水仙素棉球(最好外罩一塑料袋防止蒸發(fā))連續(xù)處理23d(也可將蘸有秋水仙素的棉

43、球涂抹生長點)，處理后反復用清水沖洗生長點。待進一步生長后，再進行觀察和鑒定。三、多倍體鑒定觀察比擬水稻、大麥、黑麥等植物二倍體和同源多倍體植株、穗、種子等標本或照片；比擬鑒定二倍體和多倍體在形態(tài)上的主要區(qū)別。(1) 保衛(wèi)細胞測量仔細撕取二倍體和同源多倍體植株的葉片下表皮，置于載玻片上，并加12滴1% I-KI，蓋上蓋玻片。在高倍鏡下用測微尺測量氣孔保衛(wèi)細胞的大小，分別測量10個保衛(wèi)細胞的長度和寬度，求其平均值。保衛(wèi)細胞的形態(tài)因物種而異，雙子葉植物的保衛(wèi)細胞多呈腎形，單子葉植物的保衛(wèi)細胞多呈啞鈴形。(2) 氣孔密度測定將葉片表皮制片于顯微鏡下檢查，計算每個視野氣孔數(shù)，轉換視野重復10次，求出平

44、均值。視野面積的計算，用目鏡測微尺量出視野直徑，按公式S=r2求視野面積，得每平方毫米葉面積的氣孔數(shù)。(3) 保衛(wèi)細胞內葉綠體數(shù)目測定取葉片下表皮于載玻片上，滴加AgNO3溶液，數(shù)秒后加蓋玻片，在顯微鏡下觀測保衛(wèi)細胞內的葉綠體數(shù)目。取新鮮或已固定的二倍體和同源多倍體植株花蕾或穎花，以花粉涂抹于載玻片上，加12滴1% I-KI，蓋上蓋玻片。鏡檢觀察花粉粒的形態(tài)和大小是否整齊，有無畸形。測量1020個花粉粒直徑的數(shù)值，求其平均值。將秋水仙堿處理和對照材料的根尖固定，按根尖壓片法(參見根尖壓片法實驗)進行解離、染色、制片。鏡檢進行染色體數(shù)目鑒定。取二倍體和同源多倍體植株的花蕾或幼穗分別固定(或取已固

45、定材料)，采用壓片或涂抹制片(參見花粉母細胞涂抹片制作)。鏡檢進行染色體計數(shù)及染色體聯(lián)會配對行為的觀察。考前須知秋水仙堿屬劇毒藥品，具麻醉作用，操作時切勿使藥液接觸皮膚和濺入眼內。作業(yè)1. 觀察比擬二倍體與多倍體在植株(器官)形態(tài)特征上的主要區(qū)別。2. 觀察比擬多倍體和正常二倍體保衛(wèi)細胞大小、氣孔密度、保衛(wèi)細胞內葉綠體數(shù)目以及花粉粒大小等特征。3. 觀察蠶豆根尖中期分裂細胞(1520個/人)，記載其中染色體加倍及未加倍的細胞數(shù)目，綜合全班(組)結果，測算秋水仙堿誘發(fā)多倍體細胞的頻率。4.繪制你所觀察到的能夠計數(shù)染色體數(shù)目的多倍性細胞圖象。5.秋水仙堿處理為什么會產(chǎn)生組織中細胞的混倍性(或細胞嵌

46、合)現(xiàn)象?由此，秋水仙堿處理應注意些什么?實驗四 植物性狀遺傳率估算實驗目的1. 學習數(shù)量性狀遺傳試驗資料整理與根本統(tǒng)計參數(shù)計算方法。2. 掌握植物性狀遺傳率估算的原理、方法。3. 了解遺傳率在育種實踐上的應用。實驗原理遺傳率是性狀遺傳方差占總方差的比率，用以度量遺傳因素與環(huán)境因素對性狀形成的影響程度，是對雜種后代性狀進行選擇的重要指標。植物數(shù)量遺傳研究時，常用雜交親本及雜種后代各世代群體方差估算性狀的遺傳率，并將遺傳率分為廣義遺傳率和狹義遺傳率。廣義遺傳率(hB2)指基因型方差占表現(xiàn)型方差的比值；狹義遺傳率(hN2)指加性方差占表現(xiàn)型方差的比值。1. 廣義遺傳率(hB2)廣義遺傳率(hB2)

47、的定義公式及其估算為：如供試材料為無性繁殖作物，由于個體的異質雜合性的特點，常用營養(yǎng)系方差(VS0)估計環(huán)境方差，以自交一代的方差(VS1)估計總方差，其基因型方差VGVS1-VS0，遺傳率可用下式估算：2. 狹義遺傳率(hN2)F2代性狀狹義遺傳率(hB2)的定義公式及其估算為：實驗材料植物(玉米、水稻、棉花等)雜交組合六個世代同年種植的田間群體、植株(器官)標本或其遺傳試驗資料，如表4-1, 4-2, 4-3。實驗用具米尺或鋼卷尺等；計算器。實驗方法1. 性狀考察與數(shù)據(jù)整理分組考察各世代田間試驗群體、植株(器官)標本試驗性狀，如：玉米果穗長度、株高，水稻生育期，小麥株高，棉花纖維長度等。綜

48、合全班獲得試驗資料，并可整理成次數(shù)分布資料。2. 根本參數(shù)估算分別估算各世代各性狀的根本統(tǒng)計參數(shù)平均值、方差與標準差。3. 遺傳參數(shù)估算分別估算各性狀的廣義遺傳率、狹義遺傳率。作業(yè)1. 估算所試材料或相應遺傳試驗資料的性狀遺傳率。2. 比擬分析三個環(huán)境方差公式估算的結果及適用范圍。3. 分析親本(自交系)、F1、F2以及回交世代群體內個體間差異的來源。表4-1 小麥Funllo鑒15-1六世代株高頻數(shù)分布資料組限(cm)79|8383|8787|9191|9595|9999|103103|107107|111111|115115|119119|123123|127127|131131|1351

49、35|139株數(shù)N方差V組中值x8185899397101105109113117121125129133137P1(Fun110)21381P2(鑒15-1)203127F12213511F2321083123151783B1112714135401B2225118831表4-2 水稻(矮腳南特蓮塘早)抽穗期(以6月1日為起點)世 代株 數(shù) (N)平均數(shù) ()(d)方 差 (V)標準差 (S)P1(矮)P2(蓮)F1F2B1B21381351547110256表4-3 煙草株高及葉長試驗資料世代株高方差(V)葉長方差(V)P1P2F1F2B1B2實驗五 性狀雜種優(yōu)勢與顯性程度估算實驗目的掌握

50、性狀雜種優(yōu)勢程度以及顯性程度的估算方法與特點。實驗原理雜種優(yōu)勢是指雜種一代(F1)在產(chǎn)量、生活力、生長勢、抗逆性及適應性等方面優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。一般用雜種優(yōu)勢率(RH)或雜種優(yōu)勢指數(shù)(IH)進行度量，并可用勢能比值和平均顯性度表示雜種一代與親本數(shù)量性狀之間的相互關系(顯性程度)。1.優(yōu)勢率(RH)性狀雜種優(yōu)勢率是雜種F1性狀表現(xiàn)優(yōu)于親本的百分率，有平均優(yōu)勢和超新優(yōu)勢兩種表示方法。平均優(yōu)勢：F1平均值同雙親的平均值比擬，用百分比表示。超親優(yōu)勢：F1平均值同較好的一個親本(HP)平均值比擬，用百分比表示。2.優(yōu)勢指數(shù)(IH)F1平均值與雙親平均值之比為優(yōu)勢指數(shù)，用下式估算：3. 勢能比值在多基因系統(tǒng)

51、下，假定：基因加性效應(a)作用方向相同，且效應相等；所有顯性效應(d)作用方向也相同，并且效應相等；雙親均為純合體，具有k對基因差異。那么F1離中親值的差數(shù)為： ；且兩親本的差數(shù)平均為：.由于上述兩個假定不能證實，所以一般將F1離中親值的差數(shù)與其兩親本的差數(shù)平均的比值，稱為勢能比值，用下式估算：實際應用中，令勢能比值0.05為無顯性；0.060.95為正向或負向局部顯性；0.961.05為正向或負向完全顯性，+1.05或0和1為超顯性。實驗材料植物(玉米、水稻、棉花等)雜交組合六個世代同年種植的田間群體、植株(器官)標本或其遺傳試驗資料，如表4-1, 4-2, 4-3。實驗用具米尺或鋼卷尺等

52、；計算器。實驗方法1. 性狀考察與數(shù)據(jù)整理分組考察各世代田間試驗群體、植株(器官)標本試驗性狀，如：玉米果穗長度、株高，水稻生育期，小麥株高，棉花纖維長度等。綜合全班獲得試驗資料，并可整理成次數(shù)分布資料。2. 根本參數(shù)估算分別估算各世代各性狀的根本統(tǒng)計參數(shù)平均值、方差與標準差。3. 遺傳參數(shù)估算分別估算各性狀的雜種優(yōu)勢率、優(yōu)勢指數(shù)、勢能比、平均顯性度。作業(yè)1. 分析所試材料或相應遺傳試驗資料的性狀雜種優(yōu)勢率及顯性程度。2. 比擬分析不同雜種優(yōu)勢率與顯性程度估算方法得到的結果。實驗六 控制性狀最少基因數(shù)目估算實驗目的了解控制性狀最少基因數(shù)目的估算原理，掌握估算方法。實驗原理受k對非連鎖基因控制的

53、數(shù)量性狀，F(xiàn)2基因別離與組合符合二項分布：，有2k1種基因型。設基因間無顯隱性關系和上位性作用，即無顯性方差與上位性方差，基因型方差僅由加性方差構成：。此時如果雙親均為極端類型：一個親本中全為正向基因，另一個親本中全為負向基因；且各個基因效應大小相同，均為a。那么有：期望基因型方差為：；兩親本之差為：。且： ；由此可得：。其中可由各群體的基因型方差VG估計，即：。在假定無顯性效應及上位性效應存在的情況下，采用上式可利用P1、P2及F2資料估計基因數(shù)目k。但是實際上數(shù)量性狀基因也常有一定程度顯性，由于沒有消除顯性方差的影響，F(xiàn)2代的遺傳方差可能包括顯性方差而加大分母值，低估基因數(shù)目。顯性作用大，

54、誤差也就大?？捎锚M義遺傳率從遺傳方差中消除顯性效應方差，僅用加性效應方差估計基因數(shù)目。在這種情況下：性狀的期望基因加性方差為：；兩親本之差仍為：。且：；由此可得：。上式中基因加性效應方差由VA估計，即：。此法采用P1、P2、F2以及B1、B2兩個回交世代資料，在一定程度上消除了顯性方差的影響，因此可以更準確地估計基因數(shù)目。但是由于以下原因，得到的基因數(shù)目一般仍然偏低。首先，加性方差與顯性方差不易分開，遺傳方差中包含了顯性方差而夸大了分母值。即使加性方差與顯性方差能分開，各基因效應也可能不完全相等。其次，兩親可能分別具有正(+)向基因及負(-)向基因，而使兩親本平均數(shù)的差數(shù)小于2ka，這些都降低

55、分子值。另外，上述估計均假定k對基因間不連鎖，但事實上可能很多基因有連鎖關系，以上公式是將同一連鎖群的假設干基因當作一個遺傳單位來分析。綜上所述，兩種估計得到的結果實際上都只能是控制數(shù)量性狀的最少基因數(shù)目。實驗材料植物(小麥、水稻、煙草等)雜交組合六個世代同年種植的田間群體、植株(器官)標本或其遺傳試驗資料，如表4-1, 4-2, 4-3。實驗用具米尺或鋼卷尺等；計算器。實驗步驟1. 性狀考察與數(shù)據(jù)整理分組考察各世代田間試驗群體、植株(器官)標本試驗性狀，如：玉米果穗長度、株高，水稻生育期，小麥株高，棉花纖維長度等。綜合全班獲得試驗資料，并可整理成次數(shù)分布資料。2. 根本參數(shù)估算分別估算各世代

56、各性狀的根本統(tǒng)計參數(shù)平均值、方差與標準差。3. 基因數(shù)目估計分別采用遺傳方差(未排除顯性效應)及加性方差(排除顯性效應)進行基因數(shù)目估計。作業(yè)1. 采用兩種不同的方法估計所試材料或相應遺傳試驗資料的性狀所涉及的最少基因數(shù)目。2. 分析用遺傳方差和加性方差兩種方法得到的結果，并加以解釋。實驗七 過氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳實驗目的1使學生掌握聚丙烯酸徽凝膠垂直板電泳的原理和操作技術；學會從植物材料小麥幼苗別離過氧化物酶同工酶。2根據(jù)酶的生物化學反響，通過染色方法顯示出酶的不同區(qū)帶，簽定小麥幼苗過氧化物酶同功酶。實驗原理同工酶是催化同一種化學反響，但其酶蛋白本身的分子結構組成卻有所不同的一組

57、酶。同工酸與生物的遺傳、生長發(fā)育、代謝調節(jié)及抗性等都有一定關系，測定同工酶在理論上和實踐上都具有重要的意義。本實驗測定的過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與植物的光合、呼吸作用以及生長素的氧化等有關；在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。因此，測定過氧化物酶的生物活性或其同工酶可以了解某一時期植物體內代謝的變化。1電泳帶電粒子在電場中向與其自身帶相反電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。多年來，電泳作為一項有效的分析、別離和制備技術開展很快，在生產(chǎn)、科研和醫(yī)療工作中得到了廣泛應用。利用電泳技術別離、分析蛋白質、酶、核酸等生物大分子，有較高的分利率，目前已成為生物科學研究中必不

58、可少的手段之一。2電泳具有的特點但凡帶電物質均可應用某一電泳技術進行別離，并可進行定性或定量分析 樣品量極少 設備簡單 操作簡便 分辨率高 便于觀察、記錄和保存。3電泳的根本原理在溶液中任何一個帶電顆粒在電場作用下的移動大致要受到三方面的影響：顆粒的性質，如：實際電荷，大小及形狀，解離強度的難易等。所處的環(huán)境，如：電解質或緩沖液的濃度，離子強度，pH，粘度，溫度等。應用電場的性質，如：電場強度。不同帶電顆粒在同一電場中泳動的速度不同，常用泳動度或遷移率來表示，遷移率是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度。其數(shù)學表達式如下：= v/E =(d/t)/(U/I) =dI/Ut式中： 是遷移率；v

59、是顆粒遷移速度cm/s或min；E 是電場強度或電勢梯度V/cm；d 是顆粒移動距離cm；I 是支持物的有效長度cm；U 是支持物兩端實際電壓V；t 是通電時間。顆粒的遷移率可通過測量d 、I、U、t 計算出。 影響遷移率的主要因素具體討論如下：1帶電顆粒的性質 即凈電荷數(shù)量，顆粒大小及形狀。一般來說，顆粒帶凈電荷多，直徑小而近于球形，那么泳動速度快，反之那么慢。 物質在電場中所受到的力F為：FEQ 式中：E是電場強度，即單位長度支持物的電位降；Q是物質顆粒的凈電荷。根據(jù)史氏定律Stokeslaw。球形分子在液體中泳動所受到的阻力磨擦力F為：F6 r 式中：r是分子半徑；是介質粘度；是分子泳動

60、速度；6是常數(shù)。當顆粒半徑較大時，那么常數(shù)為4，即此常數(shù)在46之間，視顆粒半徑大小而定。當物質在電場中受到的力與物質在液體中受到阻力平衡時，F(xiàn)F，與合并，即：EQ6 r 由于是電泳速度 cms，E 是電場強度Vcm，所以的單位是cm2/ sV。將代入上式中，那么：=Q/(6 r )這就是遷移率公式。由此可見，遷移率與分子的形狀、介質粘度、顆粒所帶電荷有關。其與顆粒外表電荷成正比，與介質粘度及顆粒半徑成反比。然而在實際電泳中，帶電顆粒的遷移率總是比理想的稀溶液中要低些。因為電泳中使用的是具有一定濃度的緩沖溶液。帶電荷的生物分子在電解質緩沖溶液中將帶有相反電荷的離子吸引到其周圍，形成一離子擴散層。