藥物分析實驗指導(dǎo)書11版大綱

1、藥物分析實驗指導(dǎo)書實驗一 煙酸原料藥的鑒別實驗一、實驗?zāi)康?1、掌握鑒別煙酸的原理及方法 2、掌握紫外分光光度法鑒別煙酸的方法原理及紫外吸收圖譜的解析 3、熟悉紫外分光光度計的操作要點及紫外分光光度法效能指標(biāo)評價的內(nèi)容與要求二、實驗原理 1、鑒別反應(yīng) （1）煙酸加2,4-二硝基氯苯加熱溶化后，生成季銨化合物，再加乙醇制氫氧化鉀溶液，即顯紫紅色，以此鑒別煙酸，反應(yīng)式為： 本反應(yīng)需在無水的條件下進(jìn)行 （2）煙酸與氫氧化鈉發(fā)生酸堿中和反應(yīng)，遇石蕊試紙顯中性，遇硫酸銅生成淡藍(lán)色煙酸酮沉淀，以此鑒別煙酸，反應(yīng)式為： （3）煙酸加水溶解后，照紫外-可見分光光度法測定，在262nm的波長處有最大吸收，在23

2、7nm的波長處有最小吸收，且237nm波長處的吸光度與262nm波長處的吸光度的比值應(yīng)為0.350.39；而煙酰胺也在262nm的波長處有最大吸收，在245nm波長處有最小吸收，在A254nm/A262nm為0.630.67。因此可用該方法來區(qū)別煙酸和煙酰胺。三、實驗內(nèi)容與操作 （一）儀器和試劑1、儀器 紫外分光光度計、配對比色杯一對、試管（25ml，2支）、電爐、藥物天平、燒杯（50ml，2只）、容量瓶（100ml、10ml各2只）、移液管（1ml，2只）、乳缽（小號1個，配乳槌）。 2、試劑 煙酸、0.4%氫氧化鈉試液（取氫氧化鈉0.4g，加水使溶解成100ml，即得）、2,4-二硝基氯苯

3、、乙醇制氫氧化鉀試液（取氫氧化鉀3.5g，加100ml95%乙醇使溶解，靜止后取上清液）、硫酸銅溶液（取硫酸銅12.5g，加水溶解成100ml，即得），蒸餾水、95%乙醇 （二）實驗步驟 1、鑒別 （1）取煙酸約4mg，加2,4-二硝基氯苯8mg，研勻，置試管中，緩緩加熱溶化后，再加熱數(shù)秒鐘，放冷，加乙醇制氫氧化鉀試液3ml，即顯紫紅色。 （2）取煙酸約50mg，加水20ml溶解后，滴加0.4%氫氧化鈉溶液至遇石蕊試紙顯中性反應(yīng)，加硫酸銅試液3ml，即緩緩析出淡藍(lán)色沉淀。 （3）取煙酸，加水溶解并稀釋制成每1mL中約含20g的溶液，照紫外-可見分光光度法（中國藥典2010年版附錄A）測定，在2

4、62nm的波長處有最大吸收，在237nm的波長處有最小吸收；在237nm波長處的吸光度與262nm波長處的吸光度的比值應(yīng)為0.350.39。四、思考題 1、計算煙酸的A235nm/A262 nm五、實驗報告書寫要求1、實驗?zāi)康模?、實驗原理；3、主要儀器與試劑；4、實驗結(jié)果；5、思考題答案。實驗二 阿司匹林原料藥的鑒別試驗及其特殊雜質(zhì)的檢查一、實驗?zāi)康?、掌握鑒別阿司匹林的原理及方法。2、掌握阿司匹林中游離水楊酸的檢查原理及方法。3、熟悉阿司匹林中由于合成工藝所帶來的其它特殊雜質(zhì)的檢查原理及方法。二、實驗原理1、鑒別反應(yīng)（1）阿司匹林加熱水解產(chǎn)生的水楊酸在中性或弱酸性條件下與三氯化鐵試液反應(yīng)，

5、生成紫堇色配位化合物，以此鑒別阿司匹林，反應(yīng)式為： COOH COOH OCOCH3 + H2O OH + CH3COOH COOH COO6OH + 4FeCl3 Fe + 12HCl(O)2Fe 3本反應(yīng)極為靈敏。反應(yīng)適宜的pH值為46，在強(qiáng)酸性溶液中配位化合物分解。（2）阿司匹林與碳酸氫鈉試液加熱水解，得水楊酸鈉及醋酸鈉，加過量稀硫酸酸化后，則生成白色水楊酸沉淀，并發(fā)生醋酸的臭氣，以此鑒別阿司匹林。反應(yīng)式為：COOH COONa OCOCH3 + Na2CO3 OH + CH3COONa + CO2 COONa COOH 2OH + H2SO4 2 OH + Na2SO4 2 CH3CO

6、ONa + H2SO4 2 CH3COOH + Na2SO4 沉淀物于100105干燥后，熔點為156161。2、特殊雜質(zhì)檢查（1）溶液的澄清度 本實驗系檢查碳酸鈉試液中不溶物。不溶物雜質(zhì)有未反應(yīng)完全的酚類，或水楊酸精制時溫度過高，產(chǎn)生脫羧副反應(yīng)的苯酚，以及合成工藝過程中由副反應(yīng)生成的醋酸苯酯、水楊酸苯酯和乙酰水楊酸苯酯等。這些雜質(zhì)均不溶于碳酸鈉試液，而阿司匹林可溶解，利用溶解行為的差異，由一定量的阿司匹林在碳酸鈉試液中溶解應(yīng)澄清來加以控制。（2）游離水楊酸 用高效液相色譜外標(biāo)法對樣品中游離水楊酸的量進(jìn)行測定三、實驗內(nèi)容與操作（一）儀器和試劑1、儀器 燒杯（50ml， 4只）、電爐、藥物天平、

7、配對比濁管（內(nèi)徑1516mm、平底、具塞、以無色、透明、中性硬質(zhì)玻璃制成）2支、移液管（5ml 2支）、量瓶（10ml、50ml、 1000ml各2只）。2、試劑 阿司匹林、水楊酸、三氯化鐵試液（取FeCl39g，加水使溶解成100ml，即得）、蒸餾水、碳酸鈉試液（取無水Na2CO310.5g，加水使溶解成100ml，即得）、稀硫酸（取硫酸57ml，加水稀釋至1000ml,即得）、四氫呋喃、冰醋酸、乙腈（色譜純）、甲醇。（二）實驗步驟1、鑒別（1）取本品約0.1g，置50ml燒杯中，加水10ml，煮沸，放冷，加三氯化鐵試液1滴，即顯紫堇色。（2）取本品約0.5g，置50ml燒杯中，加碳酸鈉試液

8、10ml,煮沸2分鐘后，放冷，加過量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并發(fā)生醋酸的臭氣。2、檢查（1）溶液的澄清度 【供試品溶液制備】 取本品0.50g，置50ml燒杯中，加溫?zé)嶂良s45的碳酸鈉試液10ml溶解后，制成供試品溶液（供試品溶解后應(yīng)立即檢視）。操作方法：將規(guī)定濃度的供試品溶液在黑色背景下檢視（2）游離水楊酸 取本品0.10g，精密稱定，置10ml容量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液適量，振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液（臨用新制）；取水楊酸對照品約10mg，精密稱定，置100ml容量瓶中，加1%冰醋酸的甲醇溶液適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置50ml容量瓶中，用1

9、%冰醋酸的甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。照高效液相色譜法試驗。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20：5:5:70）為流動相；檢測波長為303nm。理論塔板數(shù)按水楊酸峰計算不低于5000，阿司匹林與水楊酸的分離度應(yīng)符合要求。立即精密量取供試品溶液、對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖如有與水楊酸峰保留一致的色譜峰，按外標(biāo)法以峰面積計算，不得過0.1%。四、思考題1、計算水楊酸的限量。五、實驗報告書寫要求1、實驗?zāi)康模?、實驗原理；3、主要儀器與試劑；4、實驗結(jié)果；5、思考題答案。實驗三 高效液相色譜法測定阿司匹林原料藥的含

10、量一、實驗?zāi)康?、掌握外標(biāo)法的實驗步驟和結(jié)果計算方法。2、熟悉高效液相色譜儀性能檢查和色譜參數(shù)測定的方法。3、了解高效液相色譜儀的使用方法。二、實驗原理 （一）阿司匹林的含量測定1、色譜參數(shù) 本實驗僅測定下列色譜參數(shù)：（1）理論板數(shù)：n=5.54(tR/W1/2)2 理論塔板高度：HL/n 如果測得的理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求。（2）分離度：定量分析時，為便于準(zhǔn)確測量，要求定量峰與其他峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 式中 為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； 為相鄰兩峰中前一峰的保留時

11、間； W1 及W2為此相鄰兩峰的峰寬。除另外有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。（3）拖尾因子 為保證測量精度，特別當(dāng)采用峰高法測量時，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項下的規(guī)定，拖尾因子計算公式為 式中，為5%峰高處的峰寬；為峰頂點至峰前沿之間的距離。除另有規(guī)定外，峰高法定量是T應(yīng)在0.951.05之間。中國藥典規(guī)定，在采用HPLC法檢測藥品時，必須對儀器進(jìn)行系統(tǒng)適用性試驗，其試驗內(nèi)容即為理論板數(shù)、分離度、拖尾因子以及重復(fù)性。2、高效液相色譜儀的性能指標(biāo)：本實驗僅檢查重復(fù)性。重復(fù)性：取各品種項下的對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

12、（RSD）應(yīng)不大于2.0。3、外標(biāo)法定量分析阿司匹林含量 精密稱取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積，按下式計算含量：式中 為供試品的峰面積或峰高 為對照品的峰面積或峰高 為對照品的濃度 為供試品的濃度三、實驗內(nèi)容與操作（一）儀器和試劑1、儀器 高效液相色譜儀、ODS柱、萬分之一分析天平、量筒 （100ml、 1000ml 各1個）、0.45m微孔濾膜（油系膜）、量瓶（100 ml，2只）2、試劑 阿司匹林、四氫呋喃、乙腈（色譜純）、冰醋酸（AR）、重蒸餾水。（二）實驗步驟1、阿司匹林含量測定：照高效液相色譜法測定。

13、色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20：5:5:70）為流動相；檢測波長為276nm。理論塔板數(shù)按阿司匹林峰計算不低于3000，阿司匹林與水楊酸的分離度應(yīng)符合要求。測定法 取阿司匹林原料適量，精密稱定，加1%冰醋酸的甲醇溶液適量，振搖使溶解，并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液，作為供試品溶液；另取阿司匹林對照品同法配制，作為對照品溶液。精密量取供試品溶液、對照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算，即得。（三）注意事項實驗中可通過選擇適當(dāng)長度的色譜柱，調(diào)整流動相中有機(jī)相與水相的比例或流速，使阿司匹林峰

14、、水楊酸峰的分離度達(dá)到定量分析的要求。四、思考題1、配制供試品溶液時，為什么要使其濃度與對照品溶液的濃度相接近？2、什么是分離度？如何提高分離度？五、實驗報告書寫要求1、實驗?zāi)康模?、實驗原理（簡述）；3、主要儀器與試劑；4、實驗結(jié)果；5、回答思考題。實驗四 中和滴定法測定煙酸的含量一、實驗?zāi)康?、掌握中和滴定法測定煙酸含量的原理及方法2、掌握中和滴定法測定煙酸含量的操作要點、注意事項與結(jié)果計算3、熟悉中和滴定法的終點確定、效能指標(biāo)評價的內(nèi)容與要求二、實驗原理 煙酸為一元強(qiáng)酸性物質(zhì)，因此，可直接采用強(qiáng)酸的酸堿滴定法測定其含量。具體方法為以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定煙酸的水溶液，根據(jù)

15、消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的用量，計算以C6H5NO2計的煙酸的含量，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。三、實驗內(nèi)容與操作 （一）、儀器與試劑 1、儀器：三角燒瓶（100ml、 12只）、堿式滴定管（25ml、一根）、酸式滴定管（50ml，1根）、量筒（50ml，2只）、萬分之一電子天平 2、試劑：0.1mol/L氫氧化鈉滴定液（取澄清的氫氧化鈉飽和溶液5.6ml，加新沸過的冷水使成1000ml，即得）、水、酚酞指示液（取酚酞1g，加乙醇100ml使溶解，即得） （二）、實驗步驟 1、氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）的標(biāo)定取在105干燥至恒重的基準(zhǔn)鄰苯二甲酸氫鉀約0.6g，精密稱定，加新沸過的冷水

16、50mL，振搖，使其盡量溶解；加酚酞指示液2滴，用本液滴定，在接近終點時，應(yīng)使鄰苯二甲酸氫鉀完全溶解，滴定至溶液顯粉紅色。每1mL氫氧化鈉滴定液（1mol/L）相當(dāng)于20.42mg的鄰苯二甲酸氫鉀。根據(jù)本液的消耗量與鄰苯二甲酸氫鉀的取用量，算出本液的濃度。平行測定3次，3次結(jié)果的相對平均偏差不得大于0.1%注：本滴定液應(yīng)置聚乙烯塑料瓶中，密封保存；塞中有2孔，孔內(nèi)各插入玻璃管1支，1管與鈉石灰管相連，1管供吸出本液使用。 2、煙酸的含量測定 （1）、實驗方法：取本品0.3g，精密稱定，加50mL新沸過的冷水溶解后，加3滴酚酞指示液，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液（0.1mol/L）滴定至粉紅色，記錄消耗氫氧化鈉滴定液的體積數(shù)（mL），每1 mL氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）相當(dāng)于12.31mg的煙酸（C6H5NO2），即得。 （2）結(jié)果計算 煙酸（以C6H5NO2計）的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w1，數(shù)值以%表示，按下式計算： 其中：V-消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積數(shù)，單位為mL； V0-空白實驗消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積數(shù)，單位為mL；