實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)及其優(yōu)勢

1、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)及其優(yōu)勢眾所周知，PCR （聚合酶鏈反應(yīng)）技術(shù)自從1985年問世以來，經(jīng)過十幾 年的發(fā)展，已成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。它是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究中不 可缺少的手段，是一種極為敏感的放大系統(tǒng)。相比于傳統(tǒng)的臨床診斷 方法，核酸診斷是分子水平上的診斷技術(shù)，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)臨床診斷方 法的某些缺陷，比如，核酸診斷能直接揭示病原體的存在，能客觀反 映病原體在人體內(nèi)感染及活動(dòng)情況，可以作為臨床治療中的一個(gè)有效 監(jiān)控手段，另外采用核酸診斷技術(shù)還可以檢測到常規(guī)檢測方法難以檢 測到的病原體，例如可以克服酶免檢測技術(shù)中從感染到抗體產(chǎn)生的窗 口期問題。因此，以PCR技術(shù)為代表的核酸診斷技術(shù)在臨床診斷中得到

2、 日益廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的PCR檢測模式傳統(tǒng)的PCR檢測模式一般需要三個(gè)步驟：1.首先需要對待測標(biāo)本進(jìn)行處 理：通過裂解、純化，提取標(biāo)本中的病原體核酸（DNA或RNA）作為PCR 擴(kuò)增的模板；2.采用PCR或RT-PCR技術(shù)對提取到的病原體核酸進(jìn)行擴(kuò) 增；3.檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測方法包括凝膠電泳和類似于酶免反應(yīng)的 PCR-ELISA 等。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù) 近年來，PCR技術(shù)有了重大改進(jìn)。將傳統(tǒng)PCR檢測模式中的PCR擴(kuò)增和檢 測相結(jié)合（即在同一個(gè)密閉容器中將PCR擴(kuò)增反應(yīng)與熒光標(biāo)記探針檢測 結(jié)合在一起）檢測目的核酸的檢驗(yàn)方法紛紛出臺(tái)。這樣的檢測方法稱 為“實(shí)時(shí)”PCR,表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)

3、物可被實(shí)時(shí)檢測。準(zhǔn)確地說，“實(shí)時(shí)” 是指在每一個(gè)PCR循環(huán)后檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，我們 可以得到每個(gè)樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變化曲線。通過分析這些反應(yīng)曲線， 不但可以得到病原體的定性檢測結(jié)果，還可以對病原體的數(shù)量進(jìn)行精 確定量。實(shí)時(shí)熒光PCR不僅具有普通PCR的高靈敏性，而且由于應(yīng)用了熒光探針， 可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的變化以獲得 定量結(jié)果，所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性，克 服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn)。如一般PCR產(chǎn)物都需通過瓊脂糖凝膠電泳和 漠化乙錠染色紫外光觀察結(jié)果或通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測， 不僅需要多種儀器，而且費(fèi)時(shí)

4、費(fèi)力，所使用的染色劑漠化乙錠對人體 又有害，這些繁雜的實(shí)驗(yàn)過程又給污染和假陽性提供了機(jī)會(huì)。而實(shí)時(shí) 熒光-PCR只須在加樣時(shí)打開一次蓋子，其后的過程完全是閉管操作， 不需要PCR后處理，避免了常規(guī)PCR操作中的諸多弊端從而可以快速以 及動(dòng)態(tài)地檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并減少外來核酸造成的污染。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)基于熒光共振能量遷移(FRET，F(xiàn)luorescent Resona nce Energy Transfer)原理：當(dāng)兩個(gè)熒光基團(tuán)靠近時(shí)，高能量熒光基 團(tuán)會(huì)將受激發(fā)產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)移到相臨的低能量熒光基團(tuán)上。由于標(biāo)記 在探針上的兩種熒光基團(tuán)所發(fā)出熒光信號(hào)的變化可以反映PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 的數(shù)量變化，從而使

5、得熒光PCR技術(shù)可以起到實(shí)時(shí)檢測的目的。目前， 根據(jù)熒光基團(tuán)在寡核苷酸探針上的不同標(biāo)記形式，各種熒光PCR檢測試 劑盒所采用的熒光探針基本可以分為三種類型：Taqman探針、分子信 標(biāo)和熒光雜交探針 表1: Taqman探針、分子信標(biāo)和熒光雜交探針的特點(diǎn)比較熒光探針類型探針形式熒光標(biāo)記熒光檢測原理常用發(fā)光基團(tuán)Taqman探針分子信標(biāo)熒光雜交探針單條探針5端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)PCR反應(yīng)延伸時(shí)，探 針被Taq酶切斷，檢 測脫離于淬滅基團(tuán)控 制的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出 的熒光信號(hào)FAM， TET， VIC， HEX1條具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的2條相臨的探針 探針5端標(biāo)記發(fā)光基團(tuán)3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)探針和模板結(jié)合

6、， 發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開， 檢測遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán) 控制的發(fā)光基團(tuán)所 發(fā)出的熒光信號(hào)1條探針的3端標(biāo) 記激發(fā)基團(tuán)相臨探 針的5端標(biāo)記發(fā)光 基團(tuán)2條相臨的探針同時(shí) 和摸板結(jié)合，檢測 發(fā)光基團(tuán)受相臨的 激發(fā)基團(tuán)激發(fā)而產(chǎn) 生的熒光信號(hào)FAM Texas RedLC-Red640， LC-Re d705采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)需要具備集PCR擴(kuò)增和熒光檢測于一體的熒光PCR 擴(kuò)增儀，目前臨床中普遍使用的熒光PCR儀主要有ABI公司的5700型熒 光PCR儀、Roche公司的LightCycler和BioRad公司的 iCycler。三種儀 器的特點(diǎn)比較見表2。表2 :三種熒光PCR儀的特點(diǎn)比較熒光PCR儀可檢測熒光

7、信號(hào)樣品數(shù)PCR反應(yīng)時(shí)間在線觀察熒光探針形式5700單波長962-3小時(shí)不可以Taqman探針LightCycler3種波長3230分鐘可以Taqman探針分子信標(biāo)熒光雜交探針iCycler1-4種波長961-2小時(shí)可以Taqman 探針分子信標(biāo)熒光雜交探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測技術(shù)的優(yōu)勢與普通PCR模式相比，實(shí)時(shí)熒光PCR具備幾個(gè)方面的優(yōu)勢：1、由于實(shí) 時(shí)熒光PCR采用封閉的檢測模式，因此擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致污染的可能性比普 通PCR要小得多。2、由于擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測在PCR擴(kuò)增過程中同時(shí)進(jìn)行，并且數(shù)據(jù)的采集、 分析全部由儀器自動(dòng)完成，因此整個(gè)檢測所需的時(shí)間比普通PCR要節(jié)省 許多。3、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

8、模式功能強(qiáng)大，具備定性、定量、突變、多項(xiàng)目 等檢測功能。而普通PCR要完成上述項(xiàng)目需采用不同的技術(shù)平臺(tái)。4、實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行定量檢測時(shí)，其定量線性范圍（5-6 logs）比普 通PCR（2-3 logs）要寬得多。隨著反應(yīng)試劑、儀器和操作的不斷發(fā)展和完善，以實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)為 核心的檢測試劑盒紛紛問世，逐步趨向于靈敏特異、快速精確和自動(dòng) 化。當(dāng)然，由于成本較高，操作難度大，目前在臨床疾病的診斷和治 療上還未得到普及。因此，如何進(jìn)一步提高檢測方法靈敏度、簡化操 作程序、縮短檢測時(shí)間、消除非特異因素干擾以及采用統(tǒng)一的、標(biāo)準(zhǔn) 化的方法已成為實(shí)時(shí)熒光PCR檢測試劑盒未來研究的主要方向。許多研 究者趨向于將更多的精力投入實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的