工作報告之對流免疫電泳實驗報告

1、對流免疫電泳實驗報告【篇一：實驗十一免疫電泳】免疫電泳技術(shù)抗原與抗體的結(jié)合在沉淀反應(yīng)中，呈一定的分子比例。不同抗原和 抗體之間的分子比例是不同的，但只有在分子比例合適時，才出現(xiàn) 可見的沉淀。所以沉淀能否出現(xiàn)并不完全反映抗原和抗體是否存在 和發(fā)生結(jié)合?？乖Y(jié)合多個抗體分子，稱抗原為多價；抗體一般只 能結(jié)合兩個抗原分子（igm類抗體分子通?？梢越Y(jié)合5個抗原分子） 的抗原決定法簇，故為二價。只有在彼此的結(jié)合價飽和時，才出現(xiàn) 大量的抗原-抗體復(fù)合物沉淀。當(dāng)抗原與抗體的比例合適時，即二者結(jié)合價彼此飽和，就可形成網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)的大分子抗原-抗體復(fù)合物沉淀，稱為等價帶。若比例不合適 時，抗體或抗原過量，則雖有抗

2、原、抗體的結(jié)合，但不能大量形成 網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大分子復(fù)合物，沉淀量很少，甚至不出現(xiàn)沉淀。在抗原、 抗體數(shù)量關(guān)系曲線中，抗體過剩區(qū)域稱為抗體過剩帶，抗原過剩區(qū) 域稱為抗原過剩帶。如圖1所示，在等價帶的反應(yīng)液中加入過量的 抗原或抗體，沉淀復(fù)合物就會有部分溶解，甚至全部溶解的現(xiàn)象。 這是由于新加入的抗原或抗體競爭地結(jié)合相應(yīng)的抗體或抗原，使網(wǎng) 狀大分子結(jié)構(gòu)破壞，形成小分子復(fù)合物，致使沉淀出現(xiàn)溶解，沉淀 量減少甚至完全消失。在沉淀反應(yīng)中，由于抗原過量而不出現(xiàn)沉淀 的現(xiàn)象，稱為前帶現(xiàn)象。此時不能誤認為無沉淀就是無抗原存在， 為了檢測就必須稀釋抗原?？贵w過量時，稱為后帶現(xiàn)象，同理需要 稀釋抗體進行檢測。圖1的位

3、置抗原與抗體的結(jié)合是依賴于兩者分子結(jié)構(gòu)的互補性，故其特異性高。 這種結(jié)合也是相當(dāng)穩(wěn)定的。在一定條件下（過酸、過堿或濃鹽存在 下），二者可以分開，即結(jié)合是可逆的。解離后的抗原、抗體的活 性一般保持不變。雙向免疫擴散測定法原理雙向擴散法（double diffusion）又稱瓊脂擴散法，是利用瓊脂凝膠為 介質(zhì)的一種沉淀反應(yīng)。瓊脂或瓊脂糖凝膠是多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大分 子物質(zhì)可以自由通過，這種分子的擴散作用可使分別處于兩處的抗原和相應(yīng)的抗體通過擴散相遇，形成抗原-抗體復(fù) 合物，比例合適時出現(xiàn)沉淀。由于凝膠透明度高，可直接觀察到復(fù) 合物的沉淀線（?。３恋砭€（?。┑奶卣髋c位置取決于抗原相對 分子質(zhì)量的大小

4、，分子結(jié)構(gòu)、擴散系數(shù)和濃度等因素。當(dāng)抗原、抗 體存在多種系統(tǒng)時，會出現(xiàn)多種沉淀線（弧）。依據(jù)沉淀線（弧） 可以定性抗原，診斷疾病。此法操作簡單，靈敏度高，是最為常用的免疫學(xué)測定抗原和抗血清效價的方法。 操作方法（一）制備離子瓊脂板用10ml量筒，量取4ml融化的巴比妥離子瓊脂，倒在玻璃片上， 待瓊脂凝固后，按圖2所示的方法打孔。圖2的位置打空后用注射器針頭將孔內(nèi)瓊脂挑出，在酒精燈上烘烤背面，使瓊 脂與玻璃板貼緊。（二）稀釋抗原和抗體 采用2倍連續(xù)稀釋法。將抗原與抗體按2的等比級數(shù)即20、21、22、23?方式連續(xù)稀釋。方法是取試管數(shù)支，各加入稀釋液（生理鹽水）一份，在于第一管中加入抗原或抗體一

5、份，用吹吸法混勻后，吸出，目一份加入第二管中，如此依次稀釋到最后一管。其稀釋倍數(shù)依次是：2,4, 8?。（三）加樣將稀釋好的抗原或抗體依次加入外周孔中，中心孔加入相應(yīng)的抗體 或抗原，加入的量以平瓊脂表面為度或用微量進樣器定量加入。加 樣后置大培養(yǎng)皿內(nèi)（皿內(nèi)放有濕濾紙或濕紗布以維持濕度）。蓋好 皿蓋，于2437C溫箱內(nèi)保溫2448小時。擴散后可出現(xiàn)清晰的 沉淀線，以出現(xiàn)沉淀線的抗體稀釋倍數(shù)最高的一孔為被測抗體的效 價。（四）染色及保存經(jīng)染色后可提高沉淀線的可見度。漂洗瓊脂板：將瓊脂板置生理鹽水中浸泡兩天，每天更換生理鹽 水2次以洗去未結(jié)合的抗原或抗體。生理鹽水浸泡后，更換蒸餾水 浸泡1天，換水2

6、次以除去鹽分。瓊脂板較脆易破，操作需小心。干燥：取出瓊脂板，覆蓋濾紙片，于室溫自然干燥或吹干、烘干。染色：將瓊脂板置于染色劑（0.05%氨基黑10b）中浸泡，約5 分鐘（*注意觀察染色深度），再加5%的乙酸浸泡以脫去背景顏色為度。脫色后滴加少量5%的甘油至瓊脂板上，置室溫干燥保存。如 欲取下瓊脂薄膜，則需在干燥前浸泡在10%的甘油中（或在染色劑、 脫色劑中加10%甘油），烘干后輕輕去下薄膜。本實驗用瓊脂糖效果最好，瓊脂粉次之，瓊脂所含雜質(zhì)較多時，制 出的瓊脂凝膠板透明度較差，影響沉淀線的觀測、且重復(fù)性差，必 須做凈化處理后方可使用。瓊脂凝膠和玻璃片結(jié)合不緊密，樣品可從樣品孔下泄漏；在觀察、 漂

7、洗時凝膠易于脫落。為防止上述現(xiàn)象，可將玻璃板進行處理，方法是用01%02%瓊脂均勻 涂布在玻璃板上，自然干燥后再進行雙向擴散實驗。在抗原、抗體單一體系中，抗原濃度不同，沉淀線特征不同。如圖3所示圖3的位置抗原與抗體之間相對濃度不同，出現(xiàn)的沉淀線特征亦不同，如圖4 所示在抗原、抗體多種體系中，抗原與相應(yīng)抗體出現(xiàn)的沉淀線有多條， 彼此互部干擾，如圖5所示圖4圖5試劑和器材1. 1.5%離子瓊脂（1）瓊脂的凈化：高度凈化的瓊脂，買來即可使用，如果不純則 需要凈化處理。取30克優(yōu)質(zhì)瓊脂加970ml h2o，加熱至瓊脂全部融化，即成3%的 瓊脂。用三、四層紗布熱過濾，濾液流入一個搪瓷盤內(nèi)，凝固后，切成1

8、cm 見方的小塊，放在大容器中，將自來水同到容器底部，流水沖洗3 天。沖洗時于容器上捆好一層紗布，以防瓊脂塊順?biāo)疀_走。然后用 蒸餾水浸泡23天，每天換水23次。瓊脂塊凈化后即浸沒于蒸餾 水中，加萬分之一的硫柳汞防腐，置冰箱中保持待用。（2）巴比妥離子瓊脂的制備：離子強度0.06, ph8.6緩沖液：稱 取10.3g巴比妥取凈化的3%的瓊脂塊，加熱融化后加入等體積的離子強度0.06， ph8.6的巴比妥緩沖液，加熱混勻，即成為離子強度0.03, ph8.6, 1.5%巴比妥離子瓊脂。在制備離子瓊脂時，可在瓊脂中加入萬分之一的硫柳汞防 腐。瓊脂中的緩沖液，其離子強度最好比電極槽中的低1/2,這樣可

9、以避 免在電泳時因電流過大引起瓊脂變形（凸凹不平）。2.3.4.器材1.2.3.4.5.6.微量免疫電泳原理免疫電泳法（immunoelectrophoresis）是把蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)（瓊脂電泳）和免疫學(xué)檢測方法（雙向擴散）結(jié)合起來的檢測方法。它提高了分辨率和靈敏度，是很理想的分離和鑒定蛋白質(zhì)混合物的 方法。微量免疫電泳所用的樣品和抗血清較少，而且測定時間短， 靈敏度高，因此應(yīng)用比較廣泛。在倒有離子瓊脂的餓玻璃片的中心挖一長槽，槽的兩側(cè)個挖一個 孔，孔內(nèi)加入待測樣品，如圖6a所示。電泳時，樣品中各蛋白質(zhì)的等電點不同，其帶電性質(zhì)各異，因而 被分離成幾個區(qū)帶（如圖6b所示）。電泳后在中央槽中加入

10、相應(yīng)抗 血清，置37C擴散。被分離的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體形成大小不同、深淺 各異的沉淀?。ㄈ鐖D6c、d所示）。一般情況下，每一沉淀弧即代表 蛋白質(zhì)混合液中的一種成分，以此定性或半定量。圖6操作方法（一）制備離子瓊脂板將前述實驗的離子瓊脂加熱融化，取4ml倒在玻璃板上，凝固后 按圖7所示打孔和打槽，用注射器針頭將孔內(nèi)瓊脂挑出。槽內(nèi)瓊脂 在電泳分離以后在挑出，以免電泳時橫槽變形影響雙向擴散。圖7（二）電泳 于兩個電泳槽中防入離子強度為0.06, ph8.6的巴比妥緩沖液。將 瓊脂板平置于兩個電極槽之間，為使電路連通，于緩沖液的液面到 瓊脂板之間，用單層濾紙或紗布搭橋形成通路，接通電源加10v電 壓，用

11、小滴管取樣品注入瓊脂板孔內(nèi)，假樣量與孔平或稍少，調(diào)電 壓至100150v，通電4060分鐘，當(dāng)血清中色素泳動到距邊緣約 1.5cm時，斷電，取出瓊脂板，用注射器針頭將橫槽中的瓊脂挑出， 加抗血清，水平置于濕盒（或培養(yǎng)皿中），于37或24進行雙向擴 散24-48小時后，取出觀察實驗結(jié)果。（三）染色 參看雙向免疫擴散法實驗。在免疫電泳實驗中的瓊脂電泳分離法，可用其他蛋白電泳技術(shù)代 替， 如聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點聚焦電泳法等。電泳后切下相應(yīng)的 膠帶置于玻璃板上，倒上離子瓊脂。當(dāng)凝膠與膠帶緊密帖在一起并凝固后，在距膠帶約0.5cm處打橫槽， 挑出瓊脂，加抗血清進行雙向擴散。由于不同電泳方法對蛋白質(zhì)

12、抗 原的濃度要求不同，要根據(jù)抗原、抗體沉淀反應(yīng)的合適比例稀釋抗 血清。沉淀弧的曲度大，說明該種蛋白質(zhì)的含量較高，電泳時擴散也較為 嚴重之故。曲度對稱說明蛋白質(zhì)分子均一，不對稱似直線或直線上 有小弧，說明蛋白質(zhì)分子不均一。凹 1=電泳時一般穩(wěn)壓在100150v范圍，電流可用凝膠板兩側(cè)濾紙橋 的層數(shù)加以調(diào)節(jié)，一般一層濾紙即可，電流過大致使凝膠發(fā)熱，水 分蒸發(fā)快，影響電泳效果。凝膠中緩沖液濃度為電極緩沖液的一半， 這樣可減少電流的作用，也可增加蛋白質(zhì)的泳動速度。要根據(jù)樣品鑒定的不同要求，選擇抗血清。檢測蛋白質(zhì)混合液（如血清或組織粗提液）中所需成分的存在及多 寡，需用純樣品制備的抗血清和用混合液制備的

13、抗血清對照檢測， 如圖8?！酒好庖邔嶒灴荚噺?fù)習(xí)】實驗復(fù)習(xí)題一、選擇題：夾心elisa法檢測hbsag時，用于包被固相載體的物質(zhì)是：ca.純化的hbsag b.酶標(biāo)記的hbsag c.純化的hbsabd.酶標(biāo)記的hbsabe.辣根過氧化物酶間接elisa法檢測hbsab時，用于包被固相載體的物質(zhì)是：aa.純化的hbsag b.酶標(biāo)記的hbsag c.純化的hbsabd.酶標(biāo)記的hbsabe.辣根過氧化物酶血型鑒定實驗時，待檢紅細胞懸液與抗a抗體混合發(fā)生凝集，與抗b抗體混合未發(fā)生凝集，則待檢血的血型是：aa. a型b. b型c. ab型年d. o型e.不能確定血型鑒定實驗時，待檢紅細胞懸液與抗

14、a抗體混合不發(fā)生凝集， 與抗b抗體混合發(fā)生凝集，則待檢血的血型是：ba. a型b. b型c. ab型年d. o型e.不能確定不屬于人工主動免疫制劑的是(c )a乙肝疫苗b.白喉類毒素c.破傷風(fēng)抗毒素d,百日咳疫苗e,脊髓灰質(zhì) 炎疫苗不屬于人工被動免疫制劑的是(e)a,破傷風(fēng)抗毒素b血漿免疫球蛋白c,胎盤免疫球蛋白d靜脈注射用免疫球蛋白e白喉類毒素二、填空：對流免疫電泳實驗，電泳時抗原端接陰極，抗體端接陽極。三、名詞解釋沉淀反應(yīng)(precipitation reaction)毒素、組織浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原與相應(yīng)抗體反應(yīng)后， 出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物。凝集反應(yīng)(agglutination r

15、eaction)細菌、細胞等顆粒性抗原或表面包被抗原的顆粒狀物質(zhì)與相應(yīng)的抗體在電解質(zhì)存在的條件下結(jié)合，出現(xiàn)肉眼可見的凝集團現(xiàn)象。免疫標(biāo)記技術(shù)(immunolabeling techniques)是將抗原抗體反應(yīng)與標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，以檢測抗原或抗體的一類試 驗方法。人工主動免疫(artificial active immunization)用疫苗接種機體，使之產(chǎn)生特異性免疫，從而預(yù)防干擾的措施。人工被動免疫(artificial passive immunization)是給人體注射含特異性抗體的免疫血清或細胞因子等制劑，以治療 或緊急預(yù)防感染的 措施。四、問答題簡述e-花環(huán)試驗的基本原理。人T細

16、胞膜上具有能與綿羊紅細胞(srbc)上 lfa-3 (淋巴細胞功能相 關(guān)抗原一3)結(jié)合的受體(E受體，即cd2分子)。srbc與T細胞 在含有血清的平衡鹽水中結(jié)合，形成以T細胞為中心，四周環(huán)繞 srbc，狀如環(huán)瑰花環(huán)細胞集團，故稱E花環(huán)試驗。簡述cdc試驗的基本原理。細胞表面抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合所形成的免疫復(fù)合物，通過經(jīng)典 途徑激活補體而導(dǎo)致細胞膜穿孔。因此水溶性染料如臺盼藍進入受 損細胞，染成藍色，為陽性反應(yīng)；不帶相應(yīng)抗原的細胞。未受傷， 不染色，為陰性反應(yīng)。3.簡述elisa的基本原理。先將已知抗體包被在固相上，洗去未吸附的抗體；加入待檢標(biāo)本， 充分作用后，標(biāo)本中相應(yīng)的抗原與固相上已知抗

17、體結(jié)合，洗去未結(jié) 合的抗原成分；加入已知的酶標(biāo)抗體，再洗去未結(jié)合的酶標(biāo)抗體； 加底物后，酶分解底物后產(chǎn)生呈色反應(yīng)?！酒撼Ｒ娒庖邔W(xué)試驗技術(shù)】免疫學(xué)實驗實驗一與免疫相關(guān)的細胞形態(tài)的觀察目的要求：觀察與免疫相關(guān)的幾種細胞的形態(tài)，了解它們在機體免疫反應(yīng)中的作用。實驗器材：顯微鏡血液涂片(瑞氏染色)結(jié)締組織切片方法：油鏡觀察血涂片的觀察紅細胞：淡紅色，無核的圓形細胞，因紅血球為雙凹形，故 邊緣部分染色較深，中心較淺，直徑78微米。顆粒白血球嗜中性顆粒白血球：體積略大于紅細胞，細胞核被染成紫色分葉狀， 可分15葉，核葉之間聯(lián)以染色質(zhì)細絲，染色質(zhì)染成粉色，其中充 滿細小的大小均勻的顆粒被染成紫紅色。直徑

18、1012微米。嗜酸性顆粒白血球：略大于嗜中白血球，細胞核染成紫色，通常為2葉，胞質(zhì)充滿嗜酸性大圓顆粒，被染成鮮紅色。直徑1015微米。 嗜堿性顆粒白血球：體積略小于嗜酸性白血球，細胞質(zhì)中有大小不 等被染成紫色顆粒，顆粒數(shù)目較嗜酸性白血球的顆粒少，核為12 葉染成淡蘭色。直徑1011微米。1（c）無顆粒白血球淋巴細胞：涂片中可觀察到中、小型兩種。小淋巴細胞與紅血球大 小相似，圓形。其中含致密的核，染成深紫色。周圍僅有一薄層嗜 鹼性染成淡藍的細胞質(zhì)。中淋巴細胞較大，有較寬層的細胞，核 形。6-8微米。單核細胞：體積最大，細胞圓形。胞質(zhì)染成灰藍色。核呈腎形或馬 蹄形，染色略淺于淋巴細胞的核。直徑14

19、-20微米。肥大細胞的觀察（示教）胞體較大，呈卵圓形，胞質(zhì)內(nèi)充滿粗大均等的嗜鹼性顆粒。其中含 肝素、組織胺等物質(zhì)。常成群地分布于血管的周圍。漿細胞的觀察（示教）細胞呈圓形或卵圓形，胞質(zhì)豐富，呈嗜鹼性。核圓形，著色深，多 偏于細胞的一側(cè)，染色質(zhì)核膜呈車輪分布。正常組織漿細胞少， 性炎癥時增多。漿細胞合成和分泌抗體，對免疫有重要意義。巨噬細胞：又稱組織細胞，細胞形態(tài)不規(guī)則。常伸出短而鈍突 起，有很強的吞噬能力。附：瑞特氏染色：.染色液配置稱取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，過濾。貯褐色瓶中備用。（配置時，要先將瑞特氏染料置研缽體內(nèi)邊研邊滴加甲醇，使染料溶液得更好。）.瑞特氏染色法：取小鼠骨動

20、脈血，涂制玻片。干后用玻璃筆在涂處之兩側(cè)劃線（限 制染液流掉）。于劃線內(nèi)部滴加染液3-4滴，經(jīng)3-5分鐘后，再滴加等量的蒸餾水，輕輕晃動混合。經(jīng)5分鐘后，用蒸餾水洗凈，待干 后用油鏡檢查。2實驗二沉淀反應(yīng)可溶性抗原與相應(yīng)的抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，兩者比例 適合，即可有沉淀物出現(xiàn)，叫沉淀反應(yīng)（precipitation）,由于沉淀 反應(yīng)抗原多系膠體溶液。沉淀物主要是由抗體蛋白所組成。為了求得抗原與抗體的適宜比例，保證有足夠的抗體，而且抗原分 子小，具有較大的反應(yīng)面積，因此操作上通常是稀釋抗原，不稀釋 抗體。沉淀反應(yīng)的種類有環(huán)狀沉淀、絮狀沉淀、莢膜膨脹、瓊脂擴散及免 疫電泳等。此外還有放射

21、性同位素標(biāo)記、酶標(biāo)記等測定法。（一）環(huán)狀沉淀反應(yīng)當(dāng)抗原與相應(yīng)抗體形成一個接觸面時，如二者比例適當(dāng)，接觸面上 可形成一個乳白色的環(huán)狀物即為陽性沉淀反應(yīng)。材料：1.2.免疫血清：免疫兔抗人血清抗原：人血清小沉淀管、毛細吸管、 橡皮頭、生理鹽水。方法：取小沉淀管2只，以毛細吸管吸取抗人血清約02毫升，加入第 一管，加時注意不能有氣泡。2.以毛細吸管吸取生理鹽水0.2毫升加入第二管。用毛細吸管吸入 血稀釋0.2毫升加入各管，加時應(yīng)注意使抗原溶液緩緩由管壁流下， 輕浮于血清面上，使成一明顯界面，切勿使之相混。4.性。置室溫中10-20分鐘，觀察液面有無乳白色沉淀環(huán)，若有則 為陽3（二）.瓊脂擴散試驗瓊脂擴散是抗原抗體在凝膠中所呈現(xiàn)的一種沉淀反應(yīng)?？贵w在含有電解質(zhì)的瓊脂凝膠中相遇時，便出現(xiàn)可見的白色沉淀線。 這種沉淀線是一組抗原抗體的特異性復(fù)合物。如果凝膠中有多種不 同抗原抗體存在時，便依各自擴散速度的差異，在適當(dāng)部位形成獨立的沉淀線，因此廣泛地用于抗原成分的分析。瓊脂擴散試驗可根 據(jù)抗原抗體反