人教版高中生物選修1-5.2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片段(39張PPT)

1、專題5 DNA和蛋白質(zhì)技術(shù)課題2多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增DNA片斷分子生物學(xué)研究中最強大的實驗技術(shù)之一其本質(zhì)是在體外模擬胞內(nèi)DNA分子復(fù)制的過程美國科學(xué)家穆利斯(K.B.Mullis)發(fā)明了PCR技術(shù)1993年諾貝爾獎 .DNA分子的結(jié)構(gòu)C、H、O、N、P1.元素組成：脫氧核苷酸(dNMP)2.基本單位:一.基礎(chǔ)知識脫氧核苷酸脫氧核苷磷酸脫氧核糖含氮堿基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一個核苷酸上的磷酸基團上的“OH”和另一個核苷酸分子的第3位碳原子上的羥基之間失去一分子水，形成磷酸二酯鍵，即在相鄰的兩個脫氧核苷酸的3和5碳原子之間形成磷酸二酯鍵。數(shù)量龐大的四種脫氧核苷酸通

2、過3、5、磷酸二酯鍵彼此連接起來形成脫氧核苷酸鏈。通常將DNA的羥基“OH”末端稱為3端，而磷酸基團的末端稱為5端3.脫氧核苷酸鏈的形成脫氧核苷酸鏈結(jié)構(gòu)簡圖4.DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu).DNA分子是由 的（即一條鏈為35，另一條鏈為53）脫氧核苷酸長鏈盤旋而成的規(guī)則 結(jié)構(gòu)。. 與 交替連結(jié)，排列在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架； 排列在鏈的內(nèi)側(cè)。.兩條鏈上的堿基通過 連結(jié)起來，形成堿基對。堿基對的組成有特定的規(guī)律：即腺嘌呤一定與 配對， 一定同胞嘧啶配對。雙螺旋兩條反向平行脫氧核糖磷酸堿基氫鍵胸腺嘧啶鳥嘌呤2、時期有絲分裂間期或減數(shù)第一次分裂前的間期3、場所細胞核（主）（線粒體、葉綠體）4、模板DNA母鏈1

3、、概念由一個DNA形成兩個完全相同的DNA的過程.DNA的復(fù)制5、原材料脫氧核苷酸6、基本條件酶、ATP、原料、模板7、復(fù)制過程 DNA的解旋 親代DNA分子利用細胞提供的能量在解旋酶的作用下氫鍵斷裂，部分雙螺旋鏈解旋為兩條平行的雙鏈 RNA引物的合成以單股DNA為模板，在引物酶的作用下合成小段的RNA引物。 DNA的生成以單股的DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，在RNA引物的末端由5端3端合成DNA。邊解旋邊復(fù)制(過程）8、復(fù)制特點半保留復(fù)制（結(jié)果）9、遵循原則堿基互補配對原則10、精確復(fù)制的原因11、復(fù)制的意義DNA分子通過復(fù)制使遺傳信息從親代傳給了后代，從而保持了遺傳信息的連續(xù)性。規(guī)

4、則的雙螺旋結(jié)構(gòu)為復(fù)制提供了精確的模板堿基互補配對能力保證了復(fù)制準(zhǔn)確無誤的進行參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物總結(jié)：胞內(nèi)DNA復(fù)制的基本體系打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3端開始連接脫氧核苷酸.PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）2.DNA聚合酶特性不能從頭合成DNA，只能從DNA的3端開始延伸DNA鏈，因此，DNA復(fù)制需要引物。3.DNA聚合酶作用過程當(dāng)引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后， DNA聚合酶就能從引物的3端開始延伸DNA鏈，DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸。1.定義：是一種體

5、外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。能以極少量的DNA為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)13步30輪DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）4.PCR原理.在80100C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個過程稱為變性。.當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈。.PCR利用了DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的Taq

6、DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化。5.Taq DNA聚合酶的應(yīng)用6.需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)緩沖液、DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的DNA聚合酶，同時通過控制溫度使DNA復(fù)制在體外反復(fù)進行。PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出。7.PCR技術(shù)的特點：8.細胞內(nèi)和細胞外DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別體內(nèi)DNA的復(fù)制PCR模板(母鏈)引物原料:dNTP聚合酶反應(yīng)環(huán)境細胞內(nèi)源引物合成酶細胞內(nèi)的環(huán)境細胞內(nèi)源細胞內(nèi)源外源加入緩沖液外源加入外源加入外源加入.

7、PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為2030個脫氧核苷酸9.細胞內(nèi)復(fù)制和PCR不同點.PCR過程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實現(xiàn)的10.PCR的重要應(yīng)用：廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測定等。1、PCR儀.設(shè)備及用具實質(zhì)上一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。二.PCR的實驗操作2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次。1.準(zhǔn)備2.移液.實驗操作步驟按照PCR反應(yīng)體系的配方將所需用的試劑擺放在實驗桌上。用微量移液器按照PCR

8、反應(yīng)體系配方往微量離心管里面加入各種試劑。混合后蓋嚴(yán)微量離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁。3.混合過程：將微量離心管放在離心機上,離心約10s。4.離心離心目的：使反應(yīng)液體集中在離心管底部，提高反應(yīng)效果。將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。5.反應(yīng)循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94，10min30次94，30s55，30s72，1min最后一次94，1min55，30s72，1minPCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟變性、復(fù)性和延伸.變性（模板DNA解旋）模板DNA經(jīng)加熱至900C以上。一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使成為單鏈，

9、以便于它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。.復(fù)性（退火）模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降到500C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合。.延伸DNA模板引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脫氧核苷酸為原料，以母鏈為模板，按堿基互補配對的原則與半保留復(fù)制的原理，合成一條新的DNA鏈。靶序列靶序列PCR 循環(huán)第一步：高溫變性靶序列靶序列引物 引物 53553533PCR 循環(huán)第二步 ：引物與靶序列退火靶序列靶序列引物引物53553533Taq DNA聚合酶PCR 循環(huán)第三步 ：引物延伸靶序列 靶序列第1個PCR循環(huán)完成后 ：得到兩個靶序列PCR技術(shù)高度靈敏，為了避免外源DNA等因素的污

10、染而造成干擾實驗，PCR操作時要注意做到：6.注意事項隔離操作區(qū)，所用微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用必須進行高壓滅菌；分裝試劑，簡化操作程序，使用一次性槍頭.理論上DNA擴增數(shù)目的計算三.課題成果評價1.一條DNA，復(fù)制n次，DNA為2n2.a條DNA，復(fù)制n次，DNA為a2n.實驗中DNA含量的測定1.原理可以通過計算DNA含量來評價擴增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)。2.過程.稀釋2uLPCR反應(yīng)液，加入98uL蒸餾水，即將樣品進行50倍稀釋.對照調(diào)零以蒸餾水作為空白對照，在波長260nm處，將紫外分光光度計的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。

11、取DNA稀釋液100uL至比色杯中，測定260nm處的光吸收值.計算.計算DNA含量(g)50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)50：1 g /ml的DNA在厚度為1cm比色杯中的吸光值為0.02光吸收波長nm2602402202800.10.2比色杯四.課題延伸例如：PCR產(chǎn)物每輪循環(huán)增加一倍，30輪循環(huán)擴增量達230個拷貝（109拷貝）PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出特點五.實驗小結(jié)PCR儀加熱使（ ）變性, 復(fù)性使引物與模板DNA（ ）,延伸需將反應(yīng)溫度升至中溫( ),在（ ）的作用下,以 （ ）為原料,以

12、（ ）為復(fù)制的起點,合成新鏈。 如此重復(fù)改變反應(yīng)溫度,經(jīng)（ ）三個階段為一個循環(huán),每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍,一般樣品是經(jīng)過30次循環(huán),最終使基因放大了數(shù)百萬倍; 將擴增產(chǎn)物進行電泳,經(jīng)溴化乙錠染色,在紫外燈照射下肉眼能見到擴增特異區(qū)段的DNA帶。模板互補Taq聚合酶四種脫氧核苷酸引物變性、復(fù)性和延伸72練習(xí) (課堂檢測)1、DNA單鏈的_末端為3端, _末端為5端,在DNA復(fù)制時,引物從模板鏈的_端配對結(jié)合.在_酶的作用下,從引物的_端,使子鏈向下延伸.2每次循環(huán)可以分為_這三個過程,對應(yīng)溫度分別為_.磷酸基團羥基羥基DNA聚合3/變性、復(fù)性、延伸94、55 、72 90以上、50左右 、72 左右練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯誤的一項是A 古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測定