2-1、超薄切片技術(shù)原理課件

1、超薄切片技術(shù)（透射電鏡部分）第三部分:電子顯微術(shù) 透射電鏡是利用電子束作為照明源，通過幾級(jí)電磁透鏡放大成像于熒光屏上，因而電子束本身的穿透力弱，在電鏡觀察之前，必須把樣品切成700?；蚋〉那衅?；或把樣品(細(xì)菌、病毒、單細(xì)胞之類)制成懸液；或把樣品（如較硬樣品）的表面制成復(fù)型等， 我們把電鏡觀察的樣品制備方法總稱為樣品制備技術(shù)。一、超薄切片技術(shù) 用超薄切片法，可得到25埃左右的分辨率；同電鏡本身早已達(dá)到2-3埃的分辨本領(lǐng)相比，還有相當(dāng)大的“差距”。 這種差距意味著許多結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)尚未被人們發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識(shí)，同時(shí)也告誡人們不能滿足現(xiàn)今已有的制樣技術(shù)。一、超薄切片技術(shù) 在電鏡技術(shù)中，有兩種分辨率： 一種是電

2、鏡本身的分辨率， 二是樣品制備上的分辨率， 同一臺(tái)電鏡，誰的樣品制備得好，它就能使細(xì)節(jié)觀察得更確切，更清晰，拍出更真實(shí)的照片。 對(duì)于研究生物醫(yī)學(xué)的工作者來說，研究和熟練地掌握制樣技巧是極為重要的一環(huán)。一、超薄切片技術(shù) 石臘切片機(jī)的最高水平可以把片子切到1-2微米。 現(xiàn)代的超薄切片機(jī)從改進(jìn)石臘切片機(jī)出發(fā)尋求途徑。目前的超薄切片機(jī)可以以連續(xù)切片的方式把一個(gè)細(xì)胞切成幾十片或幾百片來進(jìn)行電鏡觀察。 一、超薄切片技術(shù) 目前使用的超薄切片機(jī)主要是熱膨脹式（瑞典LKB公司制造）和機(jī)械推進(jìn)式（美國(guó)的Porter-Blum）兩種，的為代表， 與此同時(shí)，許多固定、包埋和染色技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，使超薄切片;去成為樣品

3、制備中最普遍，而又最基本的方法。 超薄切片制樣過程同石臘切片過程大體相似，它分為取材、固定、漂洗、脫水、滲透與聚合、切片等幾個(gè)環(huán)節(jié)。一、超薄切片技術(shù) 超薄切片技術(shù) 是為透射電子顯微鏡觀察提供超薄樣品的專門技術(shù)。它是生物學(xué)中研究細(xì)胞、組織超微結(jié)構(gòu)常用的技術(shù)，也是生物學(xué)中其它電子顯微鏡技術(shù)，如電鏡放射自顯影、電鏡組織化學(xué)以及免疫電鏡技術(shù)等關(guān)鍵性的技術(shù)。 這種技術(shù)在生物學(xué)的發(fā)展過程中占據(jù)重要的位置，目前有關(guān)生物體的各種細(xì)胞、組織的超微結(jié)構(gòu)知識(shí)幾乎都是這種技術(shù)提供的。 一、超薄切片技術(shù)超薄切片術(shù) 是最基本的透射電鏡樣品制備技術(shù)。需要借助超薄切片機(jī)制備樣品；切片的厚度小于100毫微米（一般在30-70毫

4、微米）；被廣泛用于揭示樣品的超微結(jié)構(gòu)。超薄切片術(shù) 是電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡、電鏡放射自顯影、X射線微區(qū)元素分析等技術(shù)的基礎(chǔ)，是研究生物醫(yī)學(xué)樣品的超微結(jié)構(gòu)及其功能的有力工具。一、超薄切片技術(shù)長(zhǎng)度單位的概念: 光學(xué)顯微術(shù)中常用的長(zhǎng)度單位是：“微米”（）,電鏡是研究超微觀物體的工具,其分辨能力比普通顯微鏡大1000倍以上。 在電子顯微術(shù)中,通常用“?！保ˋ）或毫微米（nm或mm）來表示。它們之間的換算關(guān)系如下： 1毫米（mm）=1000微米（） 1微米（）=1000毫微米（nm或mu） 1毫微米（nm或mu）=10埃（A） 1毫米=103微米=106毫微米=107埃一、超薄切片技術(shù)超薄切片術(shù)一般厚度

5、在10-100毫微米的切片稱為超薄切片，制作這種切片的技術(shù)，叫做超薄切片技術(shù)。 超薄切片過程一般與光學(xué)顯微鏡的石臘切片過程原則上基本相似，也包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個(gè)環(huán)節(jié)（圖）。 超薄切片操作過程更為細(xì)致與復(fù)雜，要求更為嚴(yán)格，而且所用的試劑及配制方法也有所不同。一、超薄切片技術(shù)超薄切片技術(shù)的步驟路線（1）取材與固定（2）梯度脫水（3）浸透與包埋（4）修塊（5）超薄切片（6）染色一、超薄切片技術(shù)染色目的將重金屬原子結(jié)合到細(xì)胞結(jié)構(gòu)上使造成圖像反差常用染色液重金屬：鉛鹽（Pb）蛋白質(zhì)，糖元，脂類（膜看得清楚） 鈾鹽（U）大多數(shù)細(xì)胞成分均可 超薄切片技術(shù)的應(yīng)用：除了單獨(dú)應(yīng)

6、用于組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)觀察外，還可與放射性同位素自顯影、細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡和電鏡原位雜交等技術(shù)結(jié)合，用于不同目的的研究。超薄切片技術(shù)的應(yīng)用超薄切片分為兩大類：1、普通超薄切片術(shù)2、半薄切片術(shù)。 一、超薄切片技術(shù)一、普通超薄切片術(shù) 一、超薄切片技術(shù) 普通超薄切片術(shù)指不需要特殊的冷凍條件的常規(guī)包埋切片技術(shù)。 普通超薄切片的每一部分都是重要環(huán)節(jié)，都直接與樣品的質(zhì)量相關(guān)，而樣品質(zhì)量的優(yōu)劣又與觀察結(jié)果密切相關(guān)；為了得到可靠和滿意的切片結(jié)果，需要步步謹(jǐn)慎和認(rèn)真。一、普通超薄切片術(shù)（一）、取材和固定（二）、脫水和浸透（三）、包埋和聚合（四）、超薄切片（五）、電子染色一、普通超薄切片術(shù)（一）、取材和固定一、普通超

7、薄切片術(shù)1、操作原則： 取材和固定要遵照四大原則：“準(zhǔn)”、“快”、“輕”、“優(yōu)”的操作原則。準(zhǔn)：樣品塊一般約有1mm3，要求取材的部位要準(zhǔn)?？欤簞?dòng)物被處死之后，機(jī)體內(nèi)的組織細(xì)胞就脫離了正常的生存環(huán)境，細(xì) 胞的自溶作用會(huì)導(dǎo)致其壞死，致使超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，為了把這種 損傷減到最小，處死動(dòng)物后，要爭(zhēng)取在12分鐘內(nèi)完成取材(超過5 分鐘的樣品最好不要再用)，并立即把樣品浸入固定液中。一、取材和固定輕：樣品的超微結(jié)構(gòu)脆弱，為防止各種人為的損傷， 在操作過程中要格外小心，最好選用新的鋒利的 解剖工具，操作盡量輕巧，以避免擠壓。優(yōu)：優(yōu)質(zhì)的固定是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，遇到特殊情況時(shí)最 好根據(jù)樣品本身的要求，經(jīng)過反復(fù)實(shí)

8、驗(yàn)選用最佳 的固定條件。一、取材和固定2操作方法：(1)動(dòng)物組織塊處理方法： 用乙醚使動(dòng)物輕微麻醉，迅速解剖，準(zhǔn)確地取下材料，立即浸入2一5戊二醛進(jìn)行前固定，并用鋒利的雙面刀片將樣品剁成1mm3的碎塊，于4固定1小時(shí)以上。(如果需要更長(zhǎng)時(shí)間的前固定，需適時(shí)更換新鮮的固定液，并盡可能在4冰箱中保存。)接著用緩沖液沖洗處理1030分鐘，以洗去前固定液，然后在4下，用1四氧化鋨(即鋨酸)進(jìn)行后固定l一2小時(shí)。一、取材和固定(2)單細(xì)胞的處理方法： 一般指人工培養(yǎng)的細(xì)胞（包括懸浮或貼壁生長(zhǎng)），對(duì)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞需要先用0.5胰酶處理若干分鐘，或用薄橡膠刷輕輕刮下，使細(xì)胞脫落。先離心，1000g，510分

9、鐘，棄上清液，加入緩沖液后再離心1次（條件同前），棄上清液。一、取材和固定3、固定的種類按固定液的成分劃分可分為：1）單固定 就是只用戊二醛或四氧化鋨固定，一般用于單細(xì)胞樣 品或易滲透的樣品。2）雙固定 指先用戊二醛或多聚甲醛作前固定，再用四氧化鋨作 后固定，這種方法效果好，應(yīng)用廣泛。3）多重固定指聯(lián)合使用三種以上的固定劑，以達(dá)到取長(zhǎng)補(bǔ)短的目 的?？梢愿鶕?jù)樣品的需要進(jìn)行選擇。一、取材和固定按固定方式則可分為：1、原位固定、2、灌流固定、3、浸沒固定等。 其中浸沒固定最常用，但對(duì)不易解剖的組織和對(duì)缺血、缺氧等敏感的組織，如：心臟、肺、腦等，用原位固定和灌流固定則可提高固定的質(zhì)量。一、取材和固定1

10、）原位固定是指解剖過程之中，在摘取所需器官之前，即器官還在原位時(shí)，先用醛類固定液沖洗其外面的血液等雜質(zhì)，并不斷抽掉混濁液，同時(shí)用新鮮的預(yù)冷的固定液反復(fù)沖洗，直到組織適度變硬。這種固定方法的作用是，在保證器官本身血供的同時(shí)對(duì)器官進(jìn)行整體的預(yù)固定。然后取下所需材料，依次浸入3戊二醛進(jìn)行前固定和1四氧化鋨進(jìn)行后固定。2）灌流固定是指將固定液注入血管，通過循環(huán)作用滲透到器官組織的內(nèi)部，使其得到充分的預(yù)固定，再解剖取下所需組織，剁成碎塊，做常規(guī)雙固定。一、取材和固定4、緩沖液的選擇和配制 為了在固定過程中維持細(xì)胞本身的pH值和滲透壓，以防止因樣品收縮和膨脹等引起超微結(jié)構(gòu)的改變，需用適當(dāng)?shù)木彌_液來配制固定

11、液。 一般常用緩沖液的pH在7.0-7.4之間，但根據(jù)樣品的需要，也可以調(diào)到6.8以下或7.6以上。一、取材和固定緩沖液的種類:1、磷酸鹽緩沖液，2、二甲胂酸鹽緩沖液，3、醋酸巴比妥鈉緩沖液，4、三甲基毗烷緩沖液等。 最常用的緩沖液是：1、磷酸鈉緩沖液2、二甲胂酸鈉緩沖液一、取材和固定1磷酸鈉緩沖液： 應(yīng)用廣泛。這種緩沖液有多種配方。2二甲胂酸鈉緩沖液： 有異味和毒性，配制和使用時(shí)要格外小心，最好用通風(fēng)櫥。 它不易被污染，在4冰箱中能保存較長(zhǎng)的時(shí)間。這種緩沖液對(duì)細(xì)胞中的生化活性具有良好的穩(wěn)定作用，常用于免疫電鏡和電鏡細(xì)胞化學(xué)樣品的制備。 迅速有效的固定是獲取最佳超微結(jié)構(gòu)的重要條件之一。一、取材

12、和固定5、固定液的選擇和配制 固定的作用:是阻止細(xì)胞自溶、穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成分和超微結(jié)構(gòu)。因此選擇滲透力強(qiáng)、效果好的固定液是關(guān)鍵所在。 常用的固定方法：雙重固定或多重固定。 可以通過對(duì)樣品的實(shí)際觀察，來判斷固定的效果和選擇適宜的固定劑。一、取材和固定良好的細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)在電鏡下觀察具備的特征：一、取材和固定細(xì)胞器形態(tài)特征細(xì)胞質(zhì)膜三層結(jié)構(gòu)清晰，沒有斷裂，層間隙基本均勻細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)微粒均勻密布，沒有空白區(qū)域粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔呈扁平狀，上面附著核糖核蛋白體顆粒線粒體外周雙層膜和內(nèi)嵴完整，無膨脹和收縮，基質(zhì)致密，無空白區(qū)域細(xì)胞核雙層膜完整，顯示核膜孔，膜間隙均勻，核染色質(zhì)濃密多種固定液如:醛類固定液，高錳酸鉀固

13、定液，四氧化鋨固定液等。一、取材和固定1、戊二醛 (C5H8O2)： 特點(diǎn)：最常用的固定液。具有滲透快、能良好地保存結(jié)構(gòu)、使用條件較隨意，因而適用范圍廣。這些特長(zhǎng)取決于戊二醛本身的分子結(jié)構(gòu)，它的單體分子小，穿透力強(qiáng)，對(duì)數(shù)毫米的組織塊也具良好的固定效果。一、取材和固定 戊二醛是通過交聯(lián)作用穩(wěn)定細(xì)胞的結(jié)構(gòu)的，對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)、細(xì)胞骨架系統(tǒng)、糖原、核蛋白和細(xì)胞基質(zhì)的固定效果較好。又因它具有兩個(gè)醛基，所以能快速達(dá)到良好的固定。 用戊二醛固定時(shí)，溶液的溫度允許在4至室溫之間，固定的時(shí)間短可幾分鐘至幾十分鐘，長(zhǎng)可達(dá)幾日，甚至數(shù)周，所以常用于樣品的前固定、臨床病理速檢固定和野外作業(yè)固定等。一、取材和固定固定劑戊

14、二醛（醛基和氨基反應(yīng)）四氧化鋨（鋨與雙鍵螯合）（1）戊二醛作用原理：醛基和蛋白質(zhì)、磷脂中的氨基結(jié)合，把相鄰的蛋白質(zhì)交聯(lián)起來，形成不可溶的網(wǎng)絡(luò)，但對(duì)脂類保存效果差適合保存：蛋白質(zhì)，核酸，多糖不適合保存：脂類分子量較小，滲透較快（兩步：戊二醛+鋨酸）前固定：戊二醛固定液（ 2.5%-4% ）中4 冰箱12h(中間0.5-1h可取出修塊)后固定：鋨酸固定液（1%）中4 冰箱或室溫1h 固定液使用磷酸緩沖液配制而成，使用磷酸緩沖液可減少因組織滲透壓改變?cè)斐傻淖冃?。固定液是樣品?0倍常規(guī)固定 商品戊二醛呈淺黃色，pH4.55.0，最好棕色瓶在4條件下避光保存。 當(dāng)戊二醛的顏色變至深黃，pH降至3.5以

15、下時(shí)，說明已失效，不宜再用。一、取材和固定 為了維持樣品的生理滲透壓，使用戊二醛時(shí)常用緩沖液配制成2一3，但對(duì)于有特殊要求的樣品，可以在1一5之間選擇。建議最好在臨用之前配制新鮮的固定液，以提高效力。配制方法如下： 一、取材和固定2、 甲醛： 甲醛分子量較小。在組織中滲透快。固定迅速。單獨(dú)使用時(shí)。保存超微結(jié)構(gòu)的效果較差。但能保存某些酶的活性。在電鏡細(xì)胞化學(xué)中常采用。 在一般樣品固定時(shí)。有時(shí)甲醛與戊二醛混合使用效果較好。 一般市售的甲醛中含有抗聚合的甲醇。影響固定效果。因此電鏡樣品使用的甲醛需用多聚甲醛粉末在使用前自行配制。一、取材和固定配制20%甲醛原液方法： 稱30克多聚甲醛粉末（先用乳缽研

16、細(xì)再稱），放入裝有約130毫升去離子水的燒杯中，加熱至60-70，邊攪拌邊加入1N NaOH 10-20滴，至溶液透明，以上約需半小時(shí)。冷卻后過濾，沉淀不到1%。然后加入去離子水至150毫升，放在4冰箱內(nèi)備用。一、取材和固定 3多聚甲醛 (CH2O)n： 由多聚甲醛粉末配制2-4的固定液,較戊二醛固定液的滲透力更強(qiáng)，并且能良好地保存樣品中酶的活性。 常用于電鏡細(xì)胞化學(xué)、免疫電鏡和臨床速檢的前固定。固定時(shí)間在30分鐘至幾小時(shí)之內(nèi)，固定溫度以4為佳。一、取材和固定 多聚甲醛粉末配制2-4的固定液配制方法：儲(chǔ)備A液： 多聚甲醛20g，加入重蒸水50mL，配制成40多聚甲醛水溶液。（注：在通風(fēng)條件下配

17、制，加熱65，充分?jǐn)嚢韬蠹訋椎螡釴aOH使溶液透明）。儲(chǔ)備B液： 0.2mol/L緩沖液(磷酸鹽緩沖液或二甲胂酸鹽緩沖液)工作液： A液10mL+B液50mL+重蒸水至100mL(必要時(shí)可用葡萄糖或蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓)。一、取材和固定4、四氧化鋨(OsO4)： 特點(diǎn): 是對(duì)脂類的固定效果好，并能增加樣品的反差，但其滲透速率較醛類要慢得多，常用于后固定，并且在固定之前必須把樣品剁成小于1mm3的碎塊。一、取材和固定（3）餓酸 強(qiáng)氧化劑，可與氮結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)、脂類的固定效果好，可起“電子染色”的作用缺點(diǎn)：對(duì)糖類和核酸的保存差；分子較大，滲透力弱，使固定不均勻（一般滲透深度在0.25-0.5mm左右

18、）；適合保存：脂類和蛋白質(zhì)不適合保存：核酸，多糖 四氧化鋨是通過雙鍵與不飽和的脂肪酸鏈形成脂肪一餓復(fù)合物達(dá)到固定效果的，并能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)和交聯(lián)的雙重效應(yīng)，因而能更好地穩(wěn)固樣品中含磷酸脂蛋白的結(jié)構(gòu)。但它對(duì)碳水化合物和核酸的固定效果不佳，所以常與戊二醛聯(lián)合使用，作為后固定。 一、取材和固定 四氧化鋨是一種強(qiáng)氧化劑，配制和儲(chǔ)存不當(dāng)會(huì)產(chǎn)生鋨黑(OsO2)，使其失效，因此需冷凍、密封、避光保存，但在臨用之前需徹底化開，以免濃度不準(zhǔn)。 四氧化鋨對(duì)皮膚和粘膜有刺激作用，操作時(shí)要格外小心，最好使用通風(fēng)櫥，并戴防護(hù)手套。配制1的四氧化鋨固定液的方法。（參見實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書）一、取材和固定（二）、脫水和浸透一、

19、普通超薄切片術(shù)(一)脫水的目的和原則 絕大多數(shù)生物樣品中水分的比例可達(dá)70一80以上，而水中又有85一90為游離態(tài)水，再加上包埋劑多為水不溶性物質(zhì)，如果包埋前不徹底除去樣品中的游離態(tài)水，將直接影響包埋塊的質(zhì)量，并引起一系列不良后果，造成切片困難和成像模糊等。為了不破壞其超微空間結(jié)構(gòu)，需進(jìn)行脫水二、脫水和浸透（2） 梯度脫水目的逐步去除樣品中的水，并防止樣品收縮，為包埋劑（非水溶性）的均勻浸透做準(zhǔn)備。脫水過程（原則）： 用系列梯度濃度的有機(jī)溶劑逐步替代樣品中的游離水，以達(dá)到既不破壞超微結(jié)構(gòu)，又能徹底除去樣品中的游離態(tài)水的目的過程。二、脫水和浸透 脫水劑的梯度幅度和每步脫水的時(shí)間都有講究，梯度過大

20、，脫水速度過快會(huì)使樣品收縮，而脫水劑的濃度在70以前時(shí)，每步脫水的時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使樣品膨脹；在95以后每步脫水的時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使樣品收縮。 只有在70時(shí)，該環(huán)境與生物樣品的滲透壓相似，可停留較長(zhǎng)時(shí)間，必要時(shí)可放在4冰箱中過夜。 二、脫水和浸透(二)脫水劑的配制和脫水方法 脫水劑包括： 甲醇、乙醇、乙二醇、聚乙二醇、丙酮、環(huán)氧丙烷等， 最常用的脫水劑是乙醇和丙酮。二、脫水和浸透脫水方法： 用乙醇脫水時(shí)，其濃度梯度為：30、50、70、80、90、95、100，每步10-15分鐘。100一步要重復(fù)一次，70以前需在4條件下操作，從80起可轉(zhuǎn)至室溫。二、脫水和浸透 我們知道，絕大多數(shù)生物樣品中水分的比例很高

21、，可達(dá)70一80以上，而水中又有85一90為游離態(tài)水，再加上包埋劑多為水不溶性物質(zhì)，因此如果包埋前不徹底除去樣品中的游離態(tài)水，將直接影響包埋塊的質(zhì)量，并引起一系列不良后果，如：切片困難和成像模糊等。為了不破壞其超微空間結(jié)構(gòu)，需進(jìn)行脫水脫水過程：用系列梯度濃度的有機(jī)溶劑逐步替代樣品中的游離水，以達(dá)到既不破壞超微結(jié)構(gòu)，又能徹底除去樣品中的游離態(tài)水的目的過程。*可停在70%過夜，不能在其它濃度過夜*100%加干燥劑（如無水硫酸銅）保存在干燥器中以上為常規(guī)制樣，脫水過程可根據(jù)樣品不同進(jìn)行調(diào)整，如植物樣品可適當(dāng)延長(zhǎng)脫水時(shí)間。酒精濃度70%組織塊膨脹組織塊變化最小組織塊收縮脫水劑：既能與水相溶又能和包埋劑

22、相溶。常用乙醇和丙酮。如果迅速脫水(如直接用100%)，會(huì)使樣品水分抽取，造成萎縮等變形。脫水順序：酒精濃度50%70%80%90%100%100%時(shí)間10-15m10-15m10-15m10-15m45m45m溫度4 4 4 4 或 室溫室溫室溫脫水劑的配制方法如下：二、脫水和浸透 配制的脫水劑充分混合后，應(yīng)放在 4冰箱中保存。由于乙醇與環(huán)氧樹脂不能很好地混溶，可能會(huì)影響包埋塊的質(zhì)量，如果選用環(huán)氧樹脂包埋，用乙醇脫水后，最好再用環(huán)氧丙烷處理20-30分鐘，以置換出樣品中的乙醇。二、脫水和浸透(三)浸透的目的和方法1、浸透的目的：用包埋劑逐步替代浸入樣品內(nèi)部的脫水劑，以填充樣品超微結(jié)構(gòu)的各個(gè)空

23、間。 因?yàn)榘駝┑恼扯纫让撍畡┐蟮枚啵砸铆h(huán)氧丙烷與包埋劑配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐漸增加，以提高樣品的質(zhì)量。環(huán)氧丙烷能與環(huán)氧樹脂類的包埋劑能較好地混溶，有助于達(dá)到逐級(jí)浸透的目的。二、脫水和浸透 浸透液的配制和使用方法：1、環(huán)氧丙烷：包埋劑3：1(VV) 30-60分鐘2、環(huán)氧丙烷：包埋劑1：1(VV) 30-60分鐘3、環(huán)氧丙烷：包埋劑1：3(VV) 30-60分鐘4、100包埋劑 1-2小時(shí) 在室溫或30-35下浸透，必要時(shí)用慢速搖床相助能提高浸透的效果。浸透的時(shí)間可以靈活掌握。)二、脫水和浸透（三）、包埋與聚合一、普通超薄切片術(shù)（3） 浸透與包埋目的使包埋劑浸透樣品后，

24、固化成硬塊（一）包埋 經(jīng)過脫水和浸透的樣品不能直接進(jìn)行超薄切片，還需要用某種在一定條件下能聚合成硬塊的單體樹脂，來填充樣品的各個(gè)空間，我們把這一過程稱為包埋。 包埋的目的是一方面要支撐樣品本身的超微結(jié)構(gòu)，另一方面能用于切片。我們把具有這種特性的單體樹脂稱為包埋劑。三、包埋與聚合（二）包埋劑的選擇 理想的包埋劑應(yīng)該具備以下特征：1、處于液態(tài)時(shí)粘度小、易滲透；固化后既不膨脹也不收 縮，并有一定的機(jī)械強(qiáng)度助于保存樣品的超微結(jié)構(gòu)。2、在電子束的轟擊下性能應(yīng)該比較穩(wěn)定，不易升華、變 形和斷裂，并且質(zhì)地均勻，不干擾樣品本身的超微結(jié) 構(gòu)并有良好的電子透過性。3、染色效果好和對(duì)人體毒害小。三、包埋與聚合包埋劑

25、按其性質(zhì)可以分為：1、脂溶性包埋劑2、水溶性包埋劑3、熱聚合包埋劑4、低溫聚合包埋劑等。三、包埋與聚合幾種常用的包埋劑1、環(huán)氧樹脂類包埋劑：多為脂溶性包埋劑，同時(shí)屬于一類熱塑型樹脂。 優(yōu)點(diǎn)：熱聚合時(shí)收縮小和在電子束的轟擊下不易變形 破裂等； 缺點(diǎn)：液態(tài)時(shí)對(duì)皮膚和粘膜有刺激作用，固化后包埋 塊易受潮變軟，使切片困難和結(jié)構(gòu)模糊等。 配制環(huán)氧樹脂包埋劑時(shí)最好戴防護(hù)手套，并在通風(fēng)條件下操作；固化的包埋塊要放入干燥器中保存。三、包埋與聚合2、水溶性包埋劑：先用它來代替乙醇(或丙酮)作為脫水劑進(jìn)行脫水，接著用它來包埋。 水溶性包埋劑可避免用乙醇(或丙酮)脫水時(shí)所引起的對(duì)樣品中某些成分的抽提，特別對(duì)脂類成分

26、有較好的保存作用。 這種包埋劑對(duì)生物樣品中的生化活性破壞小，所以常用于電鏡細(xì)胞化學(xué)的研究。三、包埋與聚合水溶性包埋劑的不足之處： 在切片和染色過程中，超薄切片易被水溶解而破碎。解決辦法： 在包埋的最后一步，用環(huán)氧樹脂來替代水溶性包埋劑，再進(jìn)行聚合。三、包埋與聚合(三)包埋劑的配制 單純用某一種物質(zhì)作包埋劑往往效果不理想，常用多種物質(zhì)配制成復(fù)合包埋劑。一些常用的參考配方有： 1、環(huán)氧樹脂EPON 812 2國(guó)產(chǎn)環(huán)氧樹脂618 3GMA 4LK4M三、包埋與聚合 目前常用的包埋劑是國(guó)產(chǎn)618環(huán)氧樹脂或進(jìn)口812環(huán)氧樹脂等。 進(jìn)口環(huán)氧樹脂812包埋劑：由812樹脂、 DDSA、NMA、 DMP-30

27、四種藥品組成，操作簡(jiǎn)便，染色時(shí)間要求不嚴(yán)格，能保持細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)，切片性能好。812樹脂套裝812樹脂套裝（幾類物質(zhì)的混合物）環(huán)氧樹脂（基本成分）： 812樹脂氨類物質(zhì)（催化劑）： DMP-30酸酐（交聯(lián)）固化劑：DDSA臨苯二甲酸二丁酯（增塑劑）： NMA浸透的目的是用包埋劑逐步替代浸入樣品內(nèi)部的脫水劑，以填充樣品超微結(jié)構(gòu)的各個(gè)空間。 因?yàn)榘駝┑恼扯纫让撍畡┐蟮枚?，所以要用環(huán)氧丙烷與包埋劑配制不同比例的浸透液，使浸透液的粘度逐漸增加，以提高樣品的質(zhì)量。環(huán)氧丙烷能與環(huán)氧樹脂類的包埋劑能較好地混溶，有助于達(dá)到逐級(jí)浸透的目的。包埋 經(jīng)過脫水和浸透的樣品不能直接進(jìn)行超薄切片，還需要用某種在一定條件

28、下能聚合成硬塊的單體樹脂，來填充樣品的各個(gè)空間，我們把這一過程稱為包埋。 包埋的目的是一方面要支撐樣品本身的超微結(jié)構(gòu)，另一方面使能切片。 我們把具有這種特性的單體樹脂稱為包埋劑。包埋劑的選擇 包埋時(shí)需要選擇優(yōu)質(zhì)適用的包埋劑。理想的包埋劑應(yīng)該具備以下特征：1、處于液態(tài)時(shí)粘度小、易滲透；固化后既不膨脹也不收縮，并有一定的機(jī)械強(qiáng)度，有助于保存樣品的超微結(jié)構(gòu)和制備超薄切片。2、優(yōu)質(zhì)的包埋劑制備的切片，在電子束的轟擊下性能應(yīng)該比較穩(wěn)定，不易升華、變形和斷裂，并且質(zhì)地均勻，不干擾樣品本身的超微結(jié)構(gòu)并有良好的電子透過性。3、染色效果好和對(duì)人體毒害小。 目前常用多種成分聯(lián)合使用，以達(dá)到理想的結(jié)果。脫水劑+包埋

29、劑 1 ： 1 包埋劑包埋劑包埋劑 1h過夜12-48h24-48h37或 室溫 37 45 60 膠囊中膠囊中膠囊中*不要加蓋*室溫下干燥器中可保存相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間(四)包埋的操作方法 樣品經(jīng)過取材、固定、脫水、滲透以后，就可進(jìn)行包埋。包埋具體的操作方法： 1選擇包埋模具：目前最常用的各種類型的包埋模具有以下幾種。（圖） 三、包埋與聚合三、包埋與聚合 塑料和橡膠制的包埋模具可以反復(fù)使用若干次。其中扁盤型的模具適宜做定向包埋，包埋時(shí)將長(zhǎng)條狀樣品平放其中，切片時(shí)可以選擇一定的方向（正切或斜切等）。 圓柱型的塑料模具和橡膠模具在頂部已經(jīng)呈圓錐型或立體梯型，便于修塊。醫(yī)用膠囊便宜，修塊時(shí)稍煩瑣。 包埋時(shí)所

30、用模具一定要潔凈干燥，必要時(shí)在使用之前放入37烤箱中預(yù)干燥1-2小時(shí)。 三、包埋與聚合 2放樣品：先用注射器向包埋模具中注入一滴包埋劑，再用牙簽（事先用刀把頂尖部削?。┹p輕挑起一小塊樣品，在干燥潔凈的濾紙上沾一下（以吸去多余的滲透液），然后立即埋入包埋劑中，用牙簽將其輕輕撥到模具頂部正中的位置之后，緩緩注滿包埋液，液面高度以與模具的上緣持平為宜。三、包埋與聚合（五）聚合條件 使用不同的包埋劑，制備不同的樣品，需要的聚合條件也不同。有： 加溫聚合，降溫聚合，快速聚合，慢速聚合，普通光照聚合，紫外光照聚合等區(qū)分。三、包埋與聚合 浸透液的配制和使用方法：1、丙酮：包埋劑3：1(VV) 3060分鐘2

31、、丙酮：包埋劑1：1(VV) 3060分鐘3、丙酮：包埋劑1：3(VV) 3060分鐘4、100包埋劑 12小時(shí) (注：在室溫或3035下浸透，必要時(shí)用慢速搖床相助能提高浸透的效果。浸透的時(shí)間可以靈活掌握。)幾種常用包埋劑的聚合條件： 1EP()N812復(fù)合包埋劑：將包埋好的樣品放入干燥的自動(dòng)控溫的烤箱中，依次調(diào)節(jié)如下溫度即可完成聚合。 在37 ： 12小時(shí) 在45： 12-48小時(shí) 在60 ： 24小時(shí)三、包埋與聚合 如果在包埋時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)滲透時(shí)間，可以直接在60，24小時(shí)之內(nèi)完成聚合。 如果聚合時(shí)間已到，但樣品固化不好，軟似牛皮糖，究其原因或者因?yàn)榫酆系臅r(shí)間不足；或者因?yàn)榘駝┦艹薄Ｔ谶@類情

32、況下，可以試著調(diào)到100再聚合12小時(shí)，或在60下再聚合24小時(shí)。 聚合好的軟硬適宜的樣品應(yīng)該固化成硬塊。三、包埋與聚合（四）、超薄切片 一、普通超薄切片術(shù) 超薄切片是一項(xiàng)很細(xì)致的、技術(shù)性較強(qiáng)的工作，需要反復(fù)實(shí)踐，才能熟練掌握。同時(shí)需要了解切片機(jī)的基本構(gòu)造和原理，并事先做好切片之前的一切準(zhǔn)備工作。四、超薄切片(一)超薄切片機(jī)的基本構(gòu)造和工作原理 目前有許多種型號(hào)的超薄切片機(jī)，但主要包括兩類： 1、熱脹式 2、機(jī)械式 常用的有LKBIII、LKBV型和NOVA等。（圖）四、超薄切片超薄切片機(jī)目前有許多種型號(hào)的超薄切片機(jī)，但主要包括兩類：1、熱脹式切片機(jī) 如瑞典LKB公司產(chǎn)品2、機(jī)械式切片機(jī) 如德

33、國(guó)leica公司， 美國(guó)RMC公司切片機(jī)的工作基本原理： 1、熱脹式切片機(jī) 利用金屬桿熱脹或冷縮時(shí)產(chǎn) 生的微小長(zhǎng)度變化來提供推進(jìn)2、機(jī)械式切片機(jī) 用微動(dòng)螺旋和微動(dòng)杠桿來提供微小推進(jìn) 我國(guó)使用較多的是瑞典LKB公司產(chǎn)品 隨著機(jī)械加工水平提高，目前市場(chǎng)上新產(chǎn)品都是機(jī)械式超薄切片機(jī)我校為L(zhǎng)KB公司的LKB-V型熱脹式切片機(jī)熱脹式切片機(jī)的工作原理： 打開開關(guān)金屬膨脹桿內(nèi)線圈通電膨脹桿加熱膨脹桿帶動(dòng)樣品向前膨脹馬達(dá)帶動(dòng)樣品上下運(yùn)動(dòng)樣品經(jīng)過刀口切割加熱電流和切割速度共同決定切割厚度樣品由下向上切割完成后有退刀動(dòng)作20分鐘左右的時(shí)間里，金屬膨脹桿可保持均勻而準(zhǔn)確地線性膨脹。為了使金屬膨脹桿在切片過程中始終保

34、持線性膨脹狀態(tài)，需要每切完一個(gè)樣品后，利用換樣品的時(shí)間，打開吹風(fēng)機(jī)冷卻片刻。否則持續(xù)加熱會(huì)使金屬膨脹桿失去原有的線性膨脹，切片的厚薄就不均勻了。LKB-V型熱脹式切片機(jī)主要構(gòu)造：電源控制箱主機(jī)部分LKB-V型熱脹式切片機(jī)電源控制箱：樣品臂加熱及冷卻樣品臂的升降控制樣品臂運(yùn)動(dòng)的手動(dòng)、自動(dòng)模式切削速度控制主機(jī)部分樣品臂帶加熱線圈和樣品定向頭刀臺(tái)可調(diào)整前后左右方位及角度動(dòng)圈式馬達(dá)可使樣品臂上下往返運(yùn)動(dòng)光源（熒光燈、聚光燈）照明、檢察刀刃立體顯微鏡觀察切片四、超薄切片四、超薄切片 三種切片機(jī)的結(jié)構(gòu)有所不同，自動(dòng)化程度也各異，都屬于熱脹式超薄切片機(jī)，基本的構(gòu)造和原理是相似。1熱脹式超薄切片機(jī)的基本構(gòu)造：

35、 主要由A主機(jī)調(diào)控、B對(duì)刀調(diào)節(jié)和C觀察照明三大部分組成。 A:主機(jī)調(diào)控包括動(dòng)力開關(guān)(ONOFF)、手動(dòng)切片控制鈕、自動(dòng)切片控制鈕、加熱開關(guān)鈕、切速調(diào)控鈕、切片厚度控制鈕和電吹風(fēng)開關(guān)等。四、超薄切片B:對(duì)刀調(diào)節(jié)包括樣品臂(它又包括樣品夾和調(diào)節(jié)樣品方向的一組鎳鈕等)、刀臺(tái)、刀角刻度指示(包括傾斜角和弧度角)、刀在水平方向左右移動(dòng)和前后移動(dòng)鈕、調(diào)節(jié)刀與樣品距離的組合鈕(包括粗調(diào)鈕、細(xì)調(diào)鈕和微調(diào)鈕)等。C：觀察照明包括滑動(dòng)式顯微鏡底座、雙筒立體顯微鏡、日光燈、白熾燈、顯微鏡傾斜度標(biāo)尺等。四、超薄切片2熱脹式超薄切片機(jī)的工作原理： 從模式圖中可看出，熱脹式超薄切片機(jī)的樣品臂(3)的尾部連著一塊簧片(5)

36、，它由特殊的合金制成。當(dāng)電熱絲(4)通電時(shí)，簧片受熱，在20分鐘左右的時(shí)間里，簧片可保持均勻而準(zhǔn)確地線性膨脹。 正是這種極微小的膨脹力，推動(dòng)樣品臂向刀的方向移動(dòng)。這樣，在完成一次切片的動(dòng)作時(shí)，就會(huì)切下一片超薄切片來。四、超薄切片 為了使切片能順利落入水槽，在每個(gè)切片動(dòng)作的間歇中和樣品臂拾起的同時(shí)，刀臺(tái)復(fù)位，以保證再切下一片。 為了使簧片在切片過程中始終保持線性膨脹狀態(tài)，需要每切完一個(gè)樣品后，利用換樣品的時(shí)間，打開吹風(fēng)機(jī)(6)冷卻片刻。否則持續(xù)加熱會(huì)使簧片失去原有的線性膨脹，切片的厚薄就不均勻了。四、超薄切片(二)切片前的準(zhǔn)備 超薄切片是極細(xì)致和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ?，要心平氣和，并充分做好一切?zhǔn)備工作。四

37、、超薄切片1、切片用品 包括解剖鏡、制刀機(jī)、玻璃條、載網(wǎng)、鑷子(細(xì)尖嘴)、培養(yǎng)皿、濾紙、睫毛筆、注射器(2或5mL)、重蒸水、95乙醇、樣品盒、酒精燈、石蠟(塊或片)、綢布、小玻璃缸（直徑10cm，高10cm以上）、載玻片、新刀片（單面或雙面），以及制備支持膜的溶液(如：0.3-0.5孚爾瓦氯仿溶液)等。四、超薄切片2、修塊 聚合好的樣品塊是不能直接拿到切片機(jī)上切片的，必須將其整修一番，去除外周的包埋介質(zhì)，暴露出表面積小于0.1mm2，和低于0.2mm的小方臺(tái)。(1)把樣品塊固定在樣品夾上，用解剖鏡觀察，先用鋒利的 刀片在水平方向削，以去除樣品表面多余的樹脂，直到 暴露出樣品。(一般看到切下的

38、薄片中有黃褐色的痕跡 時(shí)，說明已切到組織或細(xì)胞了)(2)沿組織塊四周分別向斜下方（約30度角）傾斜切四刀， 使包埋塊頭部形成一個(gè)立體梯形的平臺(tái)。（圖）四、超薄切片四、超薄切片四、超薄切片(3)在平臺(tái)上選一小塊面積（約0.1mm2），其間充滿組織 或細(xì)胞(即無空脂區(qū)域)，并沿其四周分別再稍稍傾斜 （約30度角）切四刀，使樣品塊平臺(tái)的上方暴露出一個(gè) 高約0.2mm的小立方臺(tái)。注意如果小方臺(tái)過高，切片 時(shí)容易連根碰掉；小方臺(tái)面積過大，不容易切出均勻 的和足夠簿的切片；并且小方臺(tái)表面至少要有兩條邊 互相平行，這將有利于在切片時(shí)對(duì)刀。（圖）四、超薄切片 3、制刀 可選用鉆石刀或玻璃刀進(jìn)行超薄切片。鉆石刀

39、的質(zhì)量好，不用特意制備，市售有多種型號(hào)供選擇，經(jīng)久耐用，切片時(shí)容易對(duì)刀和切出優(yōu)良的連續(xù)切片，特別適宜切質(zhì)地硬的樣品。但其價(jià)格昂貴，更需精心保護(hù)。四、超薄切片超薄切片用到有兩種：鉆石刀 由天然鉆石加工而成玻璃刀 使用玻璃制作而成切片用刀鉆石刀優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)地堅(jiān)硬，經(jīng)久耐用缺點(diǎn)：價(jià)格昂貴，而且容易損壞，需要小心保護(hù)。切割對(duì)象：用來切割硬質(zhì)樣品，如金屬、礦石、骨骼、有厚細(xì)胞壁的植物材料。生產(chǎn)廠家：奧地利的LKB和美國(guó)的RCM、SPI使用：鉆石刀無需制備，但使用前后都需要作適當(dāng)清洗玻璃刀 優(yōu)點(diǎn)：制作簡(jiǎn)便，價(jià)格低廉缺點(diǎn)：刀刃較脆，不耐用。切割對(duì)象：切割普通樣品。使用：適合初學(xué)者使用。玻璃刀制刀用的玻璃是一種特

40、制的硬質(zhì)玻璃。玻璃刀需現(xiàn)用現(xiàn)做，一般在使用前新鮮裁制，以免沾染灰塵或碰壞，做好的玻璃刀在空氣中會(huì)有風(fēng)化作用，玻璃內(nèi)部的分子運(yùn)動(dòng)也會(huì)導(dǎo)致刀刃變鈍。玻璃刀的制作，目前多用制刀機(jī)裁制。制刀機(jī)制刀機(jī)操作簡(jiǎn)單，制出的刀合格率也比較高。而且還可以根據(jù)需要制作出不同刀角（knife angle）的玻璃刀。我校電鏡室為L(zhǎng)KB切片機(jī)配套用LKB 7800型制刀機(jī) 玻璃刀的制作 制刀時(shí)，先將玻璃條洗凈晾干，制成方塊（如作45刀）或菱形塊（如作35刀），然后，沿著稍偏離對(duì)角線的方向劃割，便可得到兩把三角形的刀。 玻璃刀檢查 按上述方法制成的玻璃刀，必須在解剖鏡下用聚光鏡的投射光照射或用暗視野顯微鏡下檢查。刀刃平整光

41、滑無鋸齒狀波紋者適用。 玻璃刀水槽制作經(jīng)檢查后的玻璃刀還須在刀上作一小水槽（trough），以便在切片時(shí)讓切下來的超薄切片漂浮在液面上。水槽通常都是由預(yù)先成形的金屬片、塑料水槽或膠帶制成。為了防止漏水，水槽和玻璃刀相接處須用石蠟或指甲油焊封。 玻璃刀需臨用之前制做，刀刃易脆裂，通常一把刀切一個(gè)樣品就得廢棄，適宜切質(zhì)地較軟的樣品。 制刀：是指用制刀機(jī)制備玻璃刀的方法。 (1)制刀機(jī)的構(gòu)造：常用的LKB 7800B型制刀機(jī)。（圖） (2)制刀的方法：制刀過程要嚴(yán)格按規(guī)定操作，動(dòng)作要輕緩，切忌用力過猛，并注意及時(shí)清理制刀機(jī)臺(tái)面上的碎玻璃渣，以免影響成刀的質(zhì)量。四、超薄切片四、超薄切片四、超薄切片玻璃

42、刀制作方法：(3)刀的檢驗(yàn)與保護(hù)：明顯的劣質(zhì)刀是出現(xiàn)雙刀跟(即無刀緣)、刀緣凸起、刀緣凹陷或刀緣上有明顯的裂損等，這樣的刀都不能用。為了減少切片時(shí)的麻煩，有必要在制作水槽之前，先檢查一下刀緣是否有用肉眼不易看出的微小的損傷，及時(shí)淘汰劣質(zhì)玻璃刀。（圖）四、超薄切片四、超薄切片(4)水槽的制作：水槽的作用是使切下的超薄切片漂浮于水面上，便于展平和撈片。有硬塑料制的水槽和用軟膠條現(xiàn)粘制的水槽。前者使用方便，只要用蠟封住即可。制作步驟： a先剪下一段適當(dāng)長(zhǎng)的膠條，如圖示粘在玻璃刀上。(注意粘好后，膠條的上邊與刀緣形成的平面應(yīng)與刀的底面平行，便于切片時(shí)調(diào)節(jié)) b借助酒精燈和小鐵片條為工具，用適量的石蠟封

43、住水槽的三個(gè)邊緣，以防漏水。四、超薄切片四、超薄切片4、載網(wǎng) 載網(wǎng)是用來撈超薄切片的，以便繼續(xù)進(jìn)行染色和觀察。市售有多種類型的載網(wǎng)供我們選擇(圖)。 一般載網(wǎng)的外直徑都是3mm， 對(duì)于一般普通組織超薄切片，可選用 200-300目的載網(wǎng)；對(duì)于過小的和過碎的樣品，可選用400目的載網(wǎng)；對(duì)于不易查找的樣品，可選用帶字母記號(hào)的載網(wǎng)，以幫助記憶目標(biāo)的位置等。載網(wǎng)有：銅、金、鉑金、不銹鋼和鎳制等多種，常用的是銅網(wǎng)和不銹鋼網(wǎng)。四、超薄切片四、超薄切片一般載網(wǎng)的外直徑都是3mm載網(wǎng)有正反面，光面為正對(duì)于一般普通組織超薄切片，可選用200300目的載網(wǎng)；對(duì)于過小的和過碎的樣品，可選用400目的載網(wǎng)；對(duì)于不易查

44、找的樣品，可選用帶字母記號(hào)的載網(wǎng)，以幫助記憶目標(biāo)的位置等。在使用之前，新網(wǎng)和舊網(wǎng)都需要進(jìn)行清洗，清洗的目的除了使載網(wǎng)潔凈之外，還有除去載網(wǎng)的靜電以便撈片的作用。對(duì)于新的載網(wǎng)，直接用95的乙醇或100%丙酮浸泡一下，再用重蒸水沖洗后自然晾干即可。清洗舊載網(wǎng)的方法：(1)氯仿法：用氯仿浸泡(2)燒灼法：用乙醇火焰燒灼片刻(3)濃硫酸法：用濃硫酸浸泡 如果樣品有特殊要求，如做免疫電鏡標(biāo)記時(shí)，最好選用化學(xué)惰性較大的金網(wǎng)和鎳網(wǎng)，以減少其它化學(xué)反應(yīng)的干擾和對(duì)載網(wǎng)的銹蝕，從而提高樣品的質(zhì)量。 在使用之前，新網(wǎng)和舊網(wǎng)都需要進(jìn)行清洗，清洗的目的除了使載網(wǎng)潔凈之外，還有除去載網(wǎng)的靜電以便撈片的作用。對(duì)于新的載網(wǎng)，

45、直接用95的乙醇浸泡一下，再用重蒸水沖洗后自然晾干即可。四、超薄切片清洗舊載網(wǎng)的方法：(1)氯仿法： 把舊網(wǎng)放入錐形瓶中，用氯仿浸泡若干天（經(jīng)?；蝿?dòng)可以幫助殘存的樣品從載網(wǎng)上脫落）接著用重蒸水沖洗數(shù)次，再用100乙醇洗一次后，放到墊有濾紙的培養(yǎng)皿中自然晾干。四、超薄切片(2)燒灼法： 取一個(gè)小托盤，上面平放一個(gè)30mL的小柑鍋，倒入95的乙醇，小心點(diǎn)燃，用舊鑷子夾住一個(gè)舊網(wǎng)在火焰的中心部藍(lán)火苗(又稱還原焰)上燒灼片刻，然后直接松開鑷子，讓載網(wǎng)落入小柑鍋中。 切忌在外層黃火苗處即氧化焰中燃燒，因此處溫度高。四、超薄切片 另外還要注意掌握燒灼的時(shí)間，太短不易徹底燒干凈，太長(zhǎng)容易使載網(wǎng)過熱變形，以燒

46、灼后載網(wǎng)又重放金屬光澤為宜；燒完之后，用玻璃片蓋住小柑鍋口，使火焰熄滅。再用重蒸水沖洗載網(wǎng)若干次，最后用100乙醇洗一次后，撈出放入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中自然晾干。四、超薄切片5、支持膜 載網(wǎng)的目數(shù)再高也是有孔隙的，為了防止極微小的樣品在撈片時(shí)漏掉；或切片在電子束的轟擊下卷曲；或?yàn)榱思訌?qiáng)孔隙大的載網(wǎng)的支持作用等，需要在載網(wǎng)上復(fù)蓋一層支持膜。四、超薄切片清洗好銅網(wǎng)后，應(yīng)在銅網(wǎng)上覆蓋一層薄膜，叫做支持膜用以支持所要觀察的各種樣品。厚約20nm較常用的有：孚爾瓦膜、碳膜、火棉膠膜等。 孚爾瓦膜它的支持力較強(qiáng)，但制備較復(fù)雜。 碳膜分辨力高，化學(xué)性能穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度也較高，常用于加固其它膜。 火棉膠膜機(jī)械強(qiáng)度

47、較小，但容易制備。 支持膜制備方法 (1)孚爾瓦膜(Formvar Film)：配制0205的孚爾瓦氯仿溶液，用潔凈光滑的載玻片浸入深約3cm，稍停留一下即勻速取出，自然風(fēng)干。再用鋒利的針尖沿著載玻片浸過溶液的那部分的邊緣劃一道痕。 事先準(zhǔn)備好一個(gè)小玻璃缸，并注滿清水。將載玻片傾斜著（或垂直）緩緩插入水中，一片(或兩片)透明的薄膜就飄在水面上了。 如果飄浮的膜顯示五額六色或似白霧并有條紋，說明膜過厚和不均勻，則棄之不用，再重新做，以免影響成像的質(zhì)量。 接著再往薄膜上輕輕擺上載網(wǎng)，排列盡量均勻，并用攝子逐一輕輕壓一下，以粘牢，再用一個(gè)干凈的載玻片或一片濾紙輕輕壓住膜一側(cè)的邊緣，并順勢(shì)翻動(dòng)，將膜連

48、同載網(wǎng)一起撈出，放入鋪著濾紙的培養(yǎng)皿中自然晾干。 整個(gè)過程都要注意防塵。 (2)火棉膠膜：準(zhǔn)備一個(gè)小玻璃缸，注滿重蒸水，向液面上點(diǎn)滴1一2火棉膠醋酸戊酯溶液，隨即展開形成一層透明的薄膜。為了防塵，挑掉第一張膜，再如上重做一張膜。接著選擇均勻平展的部位輕輕擺上載網(wǎng)，如圖所述撈起即可。四、超薄切片 (3)碳膜：制備碳膜需用真空噴鍍儀，常用掃描電鏡樣品制備時(shí)用的真空噴鍍儀制備碳膜載網(wǎng)與支持膜載網(wǎng)是用來撈超薄切片的，以便繼續(xù)進(jìn)行染色和觀察。市售有多種類型的載網(wǎng)供我們選擇。銅網(wǎng) (常用)不銹鋼網(wǎng)(常用)鎳網(wǎng)金網(wǎng)如果樣品有特殊要求，如：做免疫電鏡標(biāo)記時(shí)，最好選用化學(xué)惰性較大的金網(wǎng)和鎳網(wǎng)，以減少其它化學(xué)反應(yīng)

49、的干擾和對(duì)載網(wǎng)的銹蝕，從而提高樣品的質(zhì)量。*切片保存于樣品盒 支持膜有多種，并且各有特長(zhǎng)。 較常用的有：孚爾瓦膜、碳膜、火棉膠膜等。 孚爾瓦膜：一般制成20nm左右厚，它的支持力較 強(qiáng)，但制備較復(fù)雜。 碳 膜：只需幾個(gè)納米厚，它的特點(diǎn)是分辨力 高，化學(xué)性能穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度也較高， 常用于加固其它膜。 火棉膠膜：機(jī)械強(qiáng)度較孚爾瓦膜小，但容易制備， 較為常用。四、超薄切片支持膜制備方法: (1)孚爾瓦膜：配制0.2-0.5的孚爾瓦氯仿溶液，用潔凈光滑的載玻片浸入深約3cm，稍停留一下即勻速取出，自然風(fēng)干。再用鋒利的針尖沿著載玻片浸過溶液的那部分的邊緣劃一道痕。 事先準(zhǔn)備好一個(gè)小玻璃缸，并注滿清水。將

50、載玻片傾斜著（或垂直）緩緩插入水中，一片(或兩片)透明的薄膜就飄在水面上了。 如果飄浮的膜顯示五額六色或似白霧并有條紋，說明膜過厚和不均勻，則棄之不用，再重新做，以免影響成像的質(zhì)量。四、超薄切片 接著再往薄膜上輕輕擺上載網(wǎng)，排列盡量均勻，并用攝子逐一輕輕壓一下，以粘牢，再用一個(gè)干凈的載玻片或一片濾紙輕輕壓住膜一側(cè)的邊緣，并順勢(shì)翻動(dòng)，將膜連同載網(wǎng)一起撈出，放入鋪著濾紙的培養(yǎng)皿中自然晾干。整個(gè)過程都要注意防塵。 四、超薄切片(2)火棉膠膜： 準(zhǔn)備一個(gè)小玻璃缸，注滿重蒸水，向液面上點(diǎn)滴1-2火棉膠醋酸戊酯溶液，隨即展開形成一層透明的薄膜。為了防塵，挑掉第一張膜，再如上重做一張膜。接著選擇均勻平展的部

51、位輕輕擺上載網(wǎng)，如(1)所述撈起即可。因?yàn)榛鹈弈z膜的機(jī)械強(qiáng)度還不及早爾瓦膜，所以需要再噴一層碳膜（一般2-3nm）用以加固。四、超薄切片(3)碳膜： 制備碳膜需用真空噴鍍儀，常用掃描電鏡樣品制備時(shí)用的真空噴鍍儀制備碳膜，（圖）四、超薄切片其它用品：超薄切片專用鑷子、氯仿、雙面刀片、濾紙、50ml燒杯、剪刀、角匙、100ml廣口棕色試劑瓶、雙蒸水、放置銅網(wǎng)的平皿 等等超薄切片的步驟：修塊安裝包埋塊；安裝玻璃刀；調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離與角度（對(duì)刀）；調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置；調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片；將切片撈在有支持膜的載網(wǎng)上。 在進(jìn)行超薄切片前，首先必須對(duì)包埋塊進(jìn)行修整。目的：使包埋塊中組織

52、暴露出來。首先依樣品的位置，將包埋塊頂端削平，露出組織，然后再削去周圍的包埋劑及無關(guān)的部分，把要觀察的部分修成錐體（但注意不要把錐體修得過于突出，否則在切片的過程中容易產(chǎn)生振紋），并將頂端的平面修成邊界明顯的平整的梯形（或方形）。 修塊把修好的包埋塊固定在定向頭上，然后鎖住樣品桿，把定向頭固定在樣品桿上。固定時(shí)，必須使組織塊切面的底邊成水平放置，若是修成梯形的切面要讓長(zhǎng)邊在下方。此外，夾持器夾著包埋塊的位置應(yīng)盡可能靠近樣品面，以減少切片時(shí)的振動(dòng)。 安裝包埋塊把裝有水槽的刀插入到刀夾并固定。此時(shí)，刀邊應(yīng)緊靠著刀夾的前緣，刀刃應(yīng)與刀臺(tái)上的標(biāo)志桿等高，并根據(jù)組織塊軟硬程度不同，調(diào)節(jié)切割角度（cutt

53、ing angle，是實(shí)際刀角（knife angle）和刀間隙角（clearance angle）之和），當(dāng)?shù)督且呀?jīng)確定時(shí)，只能調(diào)節(jié)刀的間隙角，通常為4-5，如果是鉆石刀可根據(jù)說明書中推薦的刀角來選擇（一般為6左右）。安裝玻璃刀對(duì)刀是超薄切片過程中極為重要而又較難掌握的一環(huán)。對(duì)刀時(shí)，操作者必須十分仔細(xì)。否則，將無法切出切片。對(duì)刀的步驟：鎖定樣品桿和裝刀后，先調(diào)整顯微鏡的位置及刀的位置，使其能看清刀刃以及能看到樣品塊的位置，調(diào)整樣品面的位置讓切面的兩個(gè)平行邊與刀刃平行。然后選擇好的刀刃段，用粗調(diào)進(jìn)刀，直至在組織塊的表面觀察到影子（反射像）時(shí)，仔細(xì)觀察影子，并調(diào)整刀刃與樣品面的角度，使刀刃與樣品

54、面完全平行（此時(shí)影子是平行的且上下移動(dòng)樣品塊時(shí)影子經(jīng)過樣品面的范圍的粗細(xì)是不變的），最后用細(xì)調(diào)進(jìn)刀，使影子呈一條幾乎覺察不出來的狹縫為止。此時(shí)，若使樣品面在刀刃上下運(yùn)動(dòng)，則可看到刀刃剛剛接觸到樣品面。調(diào)節(jié)刀與組織塊的距離與角度（對(duì)刀）對(duì)完刀后，即可向刀槽內(nèi)注入雙蒸水或15%乙醇溶液。開始可注入過量的液體并使液面成凸面，以保持浸濕刀刃，然后，在顯微鏡下吸回一些液體，當(dāng)液面出現(xiàn)一反射光的亮面為止。這個(gè)亮面不僅可以體現(xiàn)所需的水面，而且通過它還可以觀察切片的質(zhì)量及估計(jì)切片的厚度。如果刀刃浸濕和亮面無法同時(shí)滿足時(shí)，可以在保持刀浸濕的最低水面的情況下嘗試調(diào)整燈的角度注意當(dāng)水面過高時(shí)，切片很難連接成帶，而且

55、樣品面和刀背容易沾濕。調(diào)節(jié)水槽液面高度與燈光位置加水后，即可打開自動(dòng)切片開關(guān)進(jìn)行切片。切片開始時(shí)，切片可稍厚一些（約80-90nm）然后可根據(jù)切片的情況調(diào)節(jié)切片速度和厚度，直至切出滿意的切片。調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片切片機(jī)上雖然有切片厚度指示標(biāo)志，但并非代表切片的實(shí)際數(shù)值，可以結(jié)合切片在亮水面上的干涉色來粗略估計(jì)切片的厚度。這種顏色是由切片頂面反射的光波和與切片與水的界面反射的光波之間的干涉所產(chǎn)生的。切片過厚，實(shí)際上不能用于電鏡觀察。要獲得較好的圖象，一般需要銀白色到淡黃色的切片。調(diào)節(jié)加熱電流及切片速度，切片切片厚度與顏色50nm灰色60-90nm銀灰色90-150nm金黃色150-190

56、nm紫色190-240nm藍(lán)色240-280nm綠色(三)切片的方法 切片的技術(shù)性較強(qiáng)，要反復(fù)實(shí)踐才能操作自如。常用的超薄切片機(jī)有多種類型，性能和外觀上有一些區(qū)別，但一般都是熱脹式的。1切片的程序：(1)接通電源，開機(jī)(此時(shí)應(yīng)聽到蜂鳴音，說明線路接通)。四、超薄切片(2)松一下樣品臂再鎖任，蜂鳴音止住。打開照明燈(檢查刀緣時(shí)用白熾燈，切片照明時(shí)用熒光燈。)(3)安放樣品(注意擺正和夾牢)。(4)安放刀并夾牢，用玻璃刀時(shí)要使刀緣、樣品頭和標(biāo)尺在一個(gè)水平面上。選擇刀角(一般26度)。四、超薄切片(5)用體視顯微鏡觀察對(duì)刀，搬動(dòng)燈架調(diào)節(jié)熒光燈的角度，使樣品和刀緣處明亮。接著調(diào)節(jié)刀座的方向，使刀緣和樣

57、品的下邊緣平行。再緩緩移動(dòng)刀座，使刀緣的右邊靠近樣品頭。先用粗調(diào)節(jié)鈕順時(shí)針旋轉(zhuǎn)進(jìn)刀(每轉(zhuǎn)一周，刀臺(tái)向進(jìn)刀方向移動(dòng)0.5mm，其調(diào)節(jié)范圍大約10mm)，當(dāng)樣品頭平面上顯示出刀緣的暗影時(shí)，說明二者之間距離已很近。再用細(xì)調(diào)節(jié)鈕順時(shí)針方向旋轉(zhuǎn)進(jìn)刀(每轉(zhuǎn)一格，刀臺(tái)向進(jìn)刀方向移動(dòng)1jm)，直到樣品頭與刀緣之間僅有一絲間隙。四、超薄切片(6)繼續(xù)用細(xì)調(diào)節(jié)鈕順時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)刀，每次24格為宜，同時(shí)用手動(dòng)試切，邊進(jìn)刀邊切，直到切下完整的切片為止(注意要緩緩進(jìn)刀，防止把樣品頭整個(gè)切掉)。(7)松開樣品臂，用注射器向水槽中緩緩注入重蒸水，調(diào)節(jié)水面與刀緣平行，同時(shí)邊調(diào)節(jié)邊移動(dòng)熒光燈的角度，使水面干涉光呈乳白色。四、超薄切

58、片(8)將刀座平行移動(dòng)，使刀緣左邊13處最鋒利的部分對(duì)準(zhǔn)樣品。轉(zhuǎn)到自動(dòng)切片，選擇適當(dāng)切速(一般2或5mms)。調(diào)節(jié)切片厚度，并通過顯微鏡觀察切片的情況，判斷切片的厚度，隨時(shí)應(yīng)變處理。(9)切出足夠的切片后，關(guān)閉自動(dòng)切片，用鑷子夾住載網(wǎng)，有支持膜的那面朝下，并使其平面與水槽的水面平行，輕輕沾起切片，再用一小片濾紙吸去鑷子上多余的水，然后輕輕放入樣品盒中自然晾干。四、超薄切片(10)撈完切片之后，在換樣品的同時(shí)，打開電吹風(fēng)冷卻片刻，以保持切片機(jī)有良好的持續(xù)切片性能。全部完成切片工作后，一定要鎖住樣品臂，取下樣品夾頭，擦干凈臺(tái)面，并關(guān)閉所有的電源。四、超薄切片2切片中可能出現(xiàn)的問題和解決的辦法： (

59、1)產(chǎn)生問題的原因：切片的質(zhì)量往往受到諸多因素的影響，切片中很可能會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題，特別是有關(guān)切片質(zhì)量的問題。如：切片開裂、切片過厚(表面的干涉光五額六色)、切片上有一行行的平行排列的條紋或縱行的劃痕、切片不能連續(xù)成串等。 四、超薄切片a影響包埋塊質(zhì)量的因素包埋劑是否混合均勻聚合的條件(溫度和時(shí)間等)是否合適樣品滲透是否充分等。b切片準(zhǔn)備工作方面的因素修塊是否規(guī)范刀口是否鋒利水槽的制作是否規(guī)范等。c切片過程中的某些因素刀角的選擇(過大或過小)；刀和樣品的安裝(是否牢固和標(biāo)準(zhǔn))；切速的選擇(過快或過慢)；對(duì)刀是否規(guī)范等。四、超薄切片d其它方面的因素附近是否有大型機(jī)械震動(dòng)源電壓是否穩(wěn)定室溫是否

60、過高或過低等 (2)可能出現(xiàn)的問題和相應(yīng)的措施：a切片上有顫紋：這是切片中常出現(xiàn)的問題之一，其表現(xiàn)為切片上布滿平行于刀緣的條紋，或粗或細(xì)，疏密不一；這是在切片過程中有震顫引起的。b，切片破碎：切片破碎是不宜撈取的，不完整的片子在電鏡觀察時(shí)往往也得不到良好的圖像。c切片不能連成帶：有的研究工作需要觀察連續(xù)切片，如果切下的片都一個(gè)個(gè)散開，就無法撈片。四、超薄切片d.切片厚薄不均：同一張切片有厚有薄的表現(xiàn)是切片的干涉色不一致，即有深有淺或五顏六色，這將直接影響成像的質(zhì)量。e其它： 1、切片帶水指樣品塊頭部有水和刀背上沾水，使無法正常切片。解決的辦法是用干凈的濾紙條吸掉，但要注意操作時(shí)切勿碰刀緣。如果