課題2__多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課件

1、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))， 是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為DNA體外擴(kuò)增技術(shù)。 課題2 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段切纏河奶星輪點(diǎn)枚臆噓脯劉吊引體壯佰謄導(dǎo)纓例到偽馴剛霜科仕帛廈視艇課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段1、DNA分子的組成成分和結(jié)構(gòu)DNA 分子的基本組成單位是 .共有 種,每個(gè)基本單位是由一分子的 、一分子的 、和一分子的 構(gòu)成。脫氧核甘酸4磷酸堿基脫氧核糖？ 那么DNA分子的平面結(jié)構(gòu)怎樣呢？二 、基礎(chǔ)知識(shí)瞄奶椽屠途練乘腆硯崎概柵懂皺失伊皇敵伴摸凳甥憋卑麓爭(zhēng)莆酮鹽箭耽肅課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多

2、聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段脫氧核糖含氮堿基磷酸AGCT1、DNA的基本單位脫氧核苷酸12345O糧判纂癡五鏡賺蝶貶偉瀕雄指掐醚框攻友衫紡顱睫八蠻邦箭沃庇流歧嘩卜課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、DNA分子的平面結(jié)構(gòu)ATGCAGCT氫鍵5端3端5端3端 識(shí)別 ： DNA分子的3 端與5 端-OH端為3 ; 磷酸基團(tuán)的末端為5。叫佐痕姐吶唆票刃羨總蓋赤傲熾仙襯勃佳卵伺泌媚爺追雞洲磁擯瀾征跑炸課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、DNA分子復(fù)制的過程參與的組分在DNA復(fù)制中的作用解旋酶打開DNA雙鏈DNA母鏈提供DNA復(fù)

3、制的模板4種脫氧核苷酸合成子鏈的原料DNA聚合酶催化合成DNA子鏈引物使DNA聚合酶能夠從引物的3 端開始連接脫氧核苷酸聯(lián)哲汲姚鋼設(shè)忘熬措禾跌霧踏視卵熏吸鎳憂押津汀尹倔慢勇蔚叛漿棧啪輕課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶引物（ RNA）打開DNA雙鏈模板合成子鏈原料催化子鏈合成使DNA聚合酶能從引物3端開始連接脫氧核苷酸 思考：體內(nèi)DNA復(fù)制的條件是什么？ 體外擴(kuò)增DNA 如何提供相似環(huán)境？ 變性（ 80-100 ）Taq聚合酶（耐高溫）2030個(gè)核苷酸構(gòu)成DNA或RNA絳族簍棱正春烽皺歲參晌駒痢乳謎停害渙漬僚撇籬垂

4、秸凍辱公捕鄧剿冪概課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段DNA雙鏈單鏈變性（加熱80-100 ）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA 分子的熱變性原理：變性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈有利于引物和引物與兩條單鏈的結(jié)合供礙蜜桐潔允藏?cái)克と嘿A習(xí)爪敢糊增鄭蘑撼秤灤樂汾墩愛紊冰梁鹼等賴衙課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段一、PCR的原理（ PCR的技術(shù)原理）1234522557294時(shí)間（min）溫度（）適溫延伸高溫變性低溫復(fù)性重復(fù)13步30輪3、DNA復(fù)制的方向DNA的合成方向總是從子鏈的5端向3端延伸2、步驟：變性 復(fù)性延伸豢興舀焙兆墳

5、珍旭撅垮檬橫財(cái)瘡情蔭飼秤接藍(lán)班逃甘鄒魔柒鉤丘伯克煮吮課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR技術(shù)的原理總結(jié) 利用DNA分子的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解旋與結(jié)合，從而完成體外DAN分子的擴(kuò)增。 體外DNA復(fù)制的條件： 四種脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶、引物、 模板；緩沖溶液和嚴(yán)格控制溫度的溫控設(shè)備。復(fù)制的方向：子鏈的5端向 3端延伸。炭匝曬蓬憐天彎綸郎市赴任懈虜?shù)行笈筒放搴┟炀b書庇覆終躺棠狹宋課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段二、PCR的反應(yīng)過程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物變性95oC復(fù)

6、性55oC延伸72oC5/3/3/5/又諧載躇救治砸住憚哪藻噪聘丟吾鏈標(biāo)拂昨璃霜鵝肝什零灌薪瓢盛絨籠豐課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段5引物15引物2第二次復(fù)制第一次復(fù)制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循環(huán)（復(fù)制）后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬（220）倍以上。驟連建岸仕隧偏譬驅(qū)師靈挎袱蝴渾攝瘴煙幣頤刷琢辱竊烈彩棘鉤庫越嘯陣課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段每個(gè)循環(huán)包括：變性 復(fù)性延伸 從第二輪循環(huán)開始，上一次循環(huán)的產(chǎn)物也可以作為模板參與反應(yīng)，并且由引物延伸而成的DNA單鏈會(huì)與引物

7、結(jié)合，進(jìn)行DNA的延伸，這樣，DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)過程總結(jié)旋瑩韓缽到舊希凳零蔫統(tǒng)快館沉日跑鉑棲右豢謬饑戊纜仆耀瘧第遷衍扁倫課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段三、 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作1、PCR儀設(shè)備及用具2、微量離心管一種薄壁塑料管，總?cè)莘e為0.5ml3、微量移液器 用于定量轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體，其上的一次性吸液槍頭用一次更換一次實(shí)質(zhì)上一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器夢(mèng)嗅耕苗力只陌謬割羌鴨微及照鍵沙康兄坍秋事茫占綸浴共鞋闖天郡傍了課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶

8、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段三、 PCR反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)操作（1）按配方將所需試劑擺放在實(shí)驗(yàn)桌上（準(zhǔn)備）（2）用微量移液器按配方在微量離心管中依次加入各組分（移液）（3）蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指輕輕彈擊管壁（混合）（4）將微量離心管放在離心機(jī)上（離心）（5）將離心管放入PCR儀上，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序（反應(yīng)）循環(huán)數(shù)變性復(fù)性延伸第一次94C,10min30次4，30s55，30s72，1min最后一次4，1min55，30s72，1min五巨孿砌臉昏幽筆瑰檄松呆柞膘宿魂沛海凌纓扎死閱痰迸瀾鑰涌賞恃麻戈課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)DNA 含量

9、的測(cè)定：稀釋對(duì)照調(diào)零測(cè)定計(jì)算（公式見P63）波長260nm處讀數(shù)蒸餾水做對(duì)照50倍酉鞏儲(chǔ)疤唁規(guī)烷鬃割謂哈掖銀奎趁犬王燎底儲(chǔ)盔魯朝邱忙卉蚌碰?；昌x客課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段（一）理論上DNA擴(kuò)增數(shù)目的計(jì)算四、課題成果評(píng)價(jià)1 、一條DNA，復(fù)制n次， DNA為2 n2 、 a條DNA，復(fù)制n次， DNA為a x2 n（二）實(shí)驗(yàn)中DNA含量的測(cè)定1 、原理 可以通過測(cè)量DNA含量來評(píng)價(jià)擴(kuò)增的效果，DNA在260nm的紫外線波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，峰值的大小與DNA的含量有關(guān)凌踴訣害圭認(rèn)鄉(xiāng)并湯刪褪亢弛吟斡墟預(yù)遣辣骸桶咋能葵兔結(jié)猾烴沮風(fēng)猜箋課題2_多聚酶鏈?zhǔn)?/p>

10、反應(yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2 、過程稀釋2L PCR反應(yīng)液，加入98L蒸餾水，即將樣品進(jìn)行50倍稀釋對(duì)照調(diào)零以蒸餾水作為空白對(duì)照，在波長260nm處，將紫外分光光度計(jì)的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零取DNA稀釋液100L至比色杯中，測(cè)定260nm處的光吸收值測(cè)定并計(jì)算DNA含量（g/mL）50(260nm的讀數(shù))稀釋倍數(shù)陣崎遏扔恥親目甕隔放腑馬鉀須孜漳葉帝曹敘塢冗怒盲雁謀餓秒凌林稠拋課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段50：在厚度為1cm比色杯中的吸光值為1, DNA 的含量為50g /ml的舜袒樊鐳沉扇烹徊撮只族跟屠方販矽海摯來雁鑒愁酣狠酶陸夜趨

11、伴篷摘禮課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段體內(nèi)DNA復(fù)制與PCR的技術(shù)區(qū)別：體內(nèi)復(fù)制PCR技術(shù)解旋在解旋酶作用下，細(xì)胞提供ATP，部分解開加熱到94oC,雙鏈全部解開，不需解旋酶引物一小段RNA一般用DNA片段DNA聚合酶細(xì)胞自身的DNA聚合酶（不耐高溫）TaqDNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn)半保留復(fù)制，邊解旋邊復(fù)制，多起點(diǎn)復(fù)制。半保留復(fù)制，完全解旋后復(fù)制，從模板鏈的一端開始復(fù)制。復(fù)制的方向子鏈的5端向 3端延伸子鏈的5端向 3端延伸穿梆階螺嚏躍培淬接茫昌殿疽汐禍柯訖場(chǎng)墊孽寢愿狀葵宰穴帕垃植螞辛卷課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段

12、課堂小結(jié)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段PCR原理DNA的復(fù)制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復(fù)性受溫度影響PCR過程變性復(fù)性延伸操作步驟配制PCR反應(yīng)體系移入離心管放入PCR儀設(shè)置工作參數(shù)DNA擴(kuò)增測(cè)定含量稀釋調(diào)零測(cè)定并讀數(shù)計(jì)算柒堆宣霄愿抓四宿癡養(yǎng)咸猖力駕數(shù)緯畝鶴棗醒迷扣輝觀臭夏何搏缺寵森郭課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段練習(xí)鞏固1、關(guān)于PCR技術(shù)的應(yīng)用，錯(cuò)誤的一項(xiàng)是A 古生物學(xué)、刑偵破案、DNA序列測(cè)定B 診斷遺傳疾病、基因克隆、古生物學(xué)C DNA序列測(cè)定、基因克隆、刑偵破案D 診斷遺傳疾病、合成核苷酸、DNA序列測(cè)定局斡謙瀑百寥丑詢額楓簿械屈闡轟撤華尤嘛寬狽纏渣抱驕數(shù)遁庭陀仲藏澆課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段課題2_多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增DNA片段2、DNA的合成方向總是從子鏈的哪一端向哪一端延伸？3、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是A 原理簡(jiǎn)單 B 原料易找C TaqDNA聚合酶有耐熱性D 快速、高效、靈活、易于操作從子鏈的5端向3端延伸某迭著司僚孫呼稼正鰓