201011298銀耳多糖單糖組成分析的三種色譜方法比較

1、銀耳多糖單糖組成分析的三種色譜方法比較韓威1，姜瑞芝2，陳英紅2，高陽3，高其品3*(1延邊大學(xué)，吉林延吉133002；2吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春130012；3長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林長春130117)摘要：為選擇一種準(zhǔn)確快捷的方法測定銀耳多糖的單糖組成，對薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)三種色譜方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，前兩種方法的測定結(jié)果均不理想，而HPLC法，操作簡便，靈敏度高，分離效果好，信息完整。測定結(jié)果為由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、巖藻糖組成，其摩爾比為0.24：1.00：0.06：0.29：0.25。HPLC法對酸性雜多糖組成糖分析是一

2、種比較理想的選擇。關(guān)鍵詞：銀耳多糖；單糖組成；TCL；GC；HPLCComparisonofthreekindsofchromatographicmethodsformonosaccharidecompositionanalysisofTremellapolysaccharideHanWei1,JiangRui-zhi2,ChenYing-hong2,GaoYang3,GaoQi-pin3*(1.YanbianUniversity,Yanji133002,China;2.AcademyofTraditionalChineseMedicineandMaterialMedicalofJilinPr

3、ovince,Changchun130012,China;3.ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China)Abstract：TofindanaccurateandfastmethodtodeterminethemonosaccharidecompositionofTremellapolysaccharide,thinlayerchromatography(TLC),gaschromatography(GC)andhighperformanceliquidchromatography(HPLC)wascompared.Th

4、eresultsofTLCandGCwerenotsignificant.However,HPLCwasasimplemethod,showedhighsensitivity,goodresolutionandintegrityinformation.TheresultofHPLCanalysisshowedthatthemonosaccharidecompositionwereGlc,Man,GlcA,XylandFuc,withthemolepercentageof0.24:1.00:0.06:0.29:0.25.Consequently,HPLCisthemostsuitablemeth

5、odformonosaccharidecompositionanalysis.Keywords：Tremellapolysaccharide;monosaccharidecomposition;TLC;GC;HPLC銀耳(TremellafuciformisBerk)是真菌類銀耳科銀耳屬植物，也叫白木耳，基金項(xiàng)目：一五國家科技重大專項(xiàng)(No.2009ZX09103-333)；國家自然科學(xué)基金(No.30873370)*通訊作者Tel：(0431)86172070；E-Mail： HYPERLINK mailto:gaoqipin gaoqipin在我國有悠久的藥食兼用歷史，具有增強(qiáng)人體免疫力的

6、作用。近年來，對銀耳多糖的化學(xué)及藥理活性方面的研究很多，有提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗?jié)?、增?qiáng)腫瘤患者對放、化療的耐受力及升高白細(xì)胞等作用1-4。多糖研究中單糖組成分析是一項(xiàng)重要內(nèi)容，隨著科學(xué)儀器及研究手段地發(fā)展，目前已有多種方法應(yīng)用于多糖的單糖組成分析中，但不同的分析方法報(bào)道的結(jié)果有一定差異5-9。為進(jìn)一步了解各分析方法的特點(diǎn)和差異，本文以銀耳多糖為研究對象，分別采用薄層色譜法、糖醇乙酸酯衍生物、糖醇乙酸酯酰胺衍生物氣相色譜法及柱前衍生高效液相色譜法進(jìn)行了單糖組成分析，并對各方法的特點(diǎn)和測定結(jié)果進(jìn)行了比較，為多糖組成糖分析提供科學(xué)參考依據(jù)。材料與儀器纖維素板（美國Sigma公

7、司）；752紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器科技有限公司）；9790型氣相色譜儀（浙江溫嶺），色譜柱為1%OV-225不銹鋼填充柱（2mX0.3cm）；LC-2010C高效液相色譜儀（日本島津）；SPD-M10A紫外檢測器；色譜柱為XDB-C18分析柱（Agilent公司）（4.6mmX150mm）銀耳子實(shí)體（產(chǎn)自福建省古田縣）購自市場；牛血清白蛋白對照品（BSA）,單糖標(biāo)準(zhǔn)品：巖藻糖（Fuc）、阿拉伯糖（Ara）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）、甘露糖醛酸（ManA）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）均購自美國Sigma公司；衍生化試劑：1-苯

8、基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和三氟乙酸（TFA）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)方法銀耳多糖的制備取銀耳子實(shí)體10g,除去托盤，加20倍量的水，煎煮兩次，每次6h,合并濾液，濃縮至一定體積，加乙醇沉淀，靜置過夜，離心，沉淀冷凍干燥，即得。銀耳多糖理化性質(zhì)的測定采用苯酚-硫酸法10，以Man為對照品測定中性糖含量；采用間羥基聯(lián)苯法,以GlcA為對照品測定糖醛酸含量；采用Lowry法，以BSA為對照品測定蛋白質(zhì)含量。結(jié)果表明銀耳多糖由酸性雜多糖組成。銀耳多糖組成糖分析2.3.1薄層色譜法8銀耳多糖10mg,TFA水解，NaOH中和，蒸干，

9、殘?jiān)铀芙?，為供試品溶液。另取巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖對照品配成對照品溶液，點(diǎn)于同一纖維素薄層板上，以正丁醇-吡啶-冰醋酸-水（10：6：1：3）為展開劑，苯胺-鄰苯二甲酸顯色。2.3.2氣相色譜法糖醇乙酸酯衍生物氣相色譜法13精稱樣品20mg，TFA水解，蒸干。殘?jiān)蛹状即蹈?，反?fù)三次。其水溶液加0.3gDowexl樹脂攪拌1h，離心，上清液蒸干為中性糖部分。樹脂用0.1mol/LHCl洗脫，洗脫液蒸干得酸性糖部分。該部分經(jīng)硼氫化鈉還原后，分別進(jìn)行乙酸酯衍生化。另取巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品按供試品制備方法操作，制成對照品溶液。分別取1yL注

10、入氣相色譜儀，以1%OV-225為固定液，柱溫為195C。糖醇乙酸酯酰胺衍生物氣相色譜法14精稱樣品20mg，TFA水解，吹干。殘?jiān)蛹状即蹈桑磸?fù)三次。殘?jiān)M(jìn)行乙酸酯酰胺衍生化處理。另取巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖醛酸、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸對照品按供試品制備方法操作，制成對照品溶液。分別取1yL注入氣相色譜儀，以3%SP-2340為固定液，柱溫為程序升溫：190C-260C，5C/min。2.3.3PMP柱前衍生高效液相色譜法取各單糖對照品適量，加蒸餾水配成2x10-3mol/L的溶液；精確稱取銀耳多糖樣品20mg于具塞試管中，加入2mol/LTFA2mL，100

11、C水解8h，蒸干加甲醇溶解，再蒸干，重復(fù)4-5次，除盡TFA。取配好的2x10-3mol/L標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液以及多糖樣品溶液置于不同試管中，依次加入6mL0.5mol/L的PMP甲醇溶液和5mL0.3mol/LNaOH溶液，混勻；70C水浴反應(yīng)30min，取出，冷卻10min，用5mL0.3mol/LHCl中和，加入等體積氯仿萃取，取水層，重復(fù)3次，取上層靜置，待用。色譜條件為：色譜柱：AgilentXDB-C18分析柱；柱溫：40C；流動(dòng)相：A：磷酸鹽緩沖液（pH6.8）：乙腈（85:15，V/V）；B:磷酸鹽緩沖液（pH6.8)：乙腈(60:40,V/V)；流速：0.9mL/min；檢測波長：

12、250nm。梯度洗脫，時(shí)間梯度0min10min30min，相應(yīng)的濃度梯度為08%20%進(jìn)樣體積10“I。結(jié)果與討論理化性質(zhì)測定結(jié)果按2.2方法測定，銀耳多糖中性糖含量占73.3%，酸性糖含量占25.7%蛋白質(zhì)含量為2%。組成糖測定結(jié)果3.2.1薄層色譜法測定結(jié)果分析TLC法分析結(jié)果見圖1。此法操作簡單，快速，但由于多糖水解成單糖后其極性相近，達(dá)不到理想的分離效果，又由于TLC法靈敏度低，樣品中含量少的斑點(diǎn)模糊不清，所以，此法不能準(zhǔn)確確定銀耳多糖單糖組成。圖1薄層色譜法測定結(jié)果Fig1Theresultsofthinlayerchromatography1Fuc;2Ara;3Xyl;4Man;

13、5Gal;6Glc;79樣品3.2.2氣相色譜法測定結(jié)果分析糖醇乙酸酯衍生氣相色譜法測定結(jié)果分析采用糖醇乙酸酯衍生物氣相色譜法分析結(jié)果見圖2。該法具有較高的靈敏度，組成糖分析結(jié)果表明，銀耳多糖中性糖由Fuc、Xyl、Man和Glc組成，酸性糖由GlcA組成，中性糖和酸性糖各組份均可達(dá)到基線分離。但是，此方法必須對中性糖和酸性糖分離后分別制備衍生物測定，使實(shí)驗(yàn)量增大。圖2糖醇乙酸酯衍生物氣相色譜法測定結(jié)果Fig2Theresultsofalditolacetatesprecolumn-derivatizationgaschromatographyA:1Fuc;2Xyl;3Man;4Glc;5未知

14、物B:6GlcA糖醇乙酸酯酰胺衍生物氣相色譜法測定結(jié)果分析采用糖醇乙酸酯酰胺衍生物氣相色譜法分析，盡管中性糖和酸性糖兩部分的信息可在同一張圖譜中出現(xiàn)，但從靈敏度看對含量少的組分檢測不出來。從標(biāo)準(zhǔn)糖圖譜的分離效果看五碳糖的分離效果理想，而六碳糖和糖醛酸均達(dá)不到基線分離。此方法可應(yīng)用于單糖組分較少的多糖組成分析。結(jié)果見圖3。圖3糖醇乙酸酯酰胺衍生物樣品氣相色譜法測定結(jié)果Fig3Theresultsofalditolacetatesamideprecolumn-derivatizationgaschromatography1Fuc;2Xyl;3Man;4Glc;5未知物;6GlcA3.2.3PMP柱

15、前衍生高效液相色譜法測定結(jié)果利用PMP衍生物在紫外250nm處有較強(qiáng)的吸收，本實(shí)驗(yàn)考察了不同衍生化溫度（60C、70C、80C）、衍生化時(shí)間（30min、45min、60min）對測定結(jié)果的影響，得出最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度70C,反應(yīng)時(shí)間30min。在此條件下，對銀耳多糖衍生物進(jìn)行液相色譜分析均具有良好的分離度。采用PMP-HPLC法分析結(jié)果如圖4。其中峰1-6依次為PMP、Man、GlcA、Glc、Xyl和Fuc，其中各單糖的摩爾比為Glc:Man:GlcA:Xyl:Fuc=0.24:1.00:0.06:0.29:0.25。這與文獻(xiàn)6報(bào)道的結(jié)果有所不同，原因可能是不同的提取分離方法得到的多

16、糖組分不同。Fig4TheresultsofPMPprecolumn-derivatizationHPLC1PMP;2未知物;3Man;4GlcA;5Glc;6Xyl;7Fuc4結(jié)論TLC法雖無需衍生化處理，操作簡單，但各單糖之間的分離效果差，適合于單糖組成較為簡單的多糖的定性分析。應(yīng)用糖醇乙酸酯、糖醇乙酸酯酰胺衍生物氣相色譜法和PMP柱前衍生高效液相色譜法，樣品均需要衍生化處理，但前兩者衍生化處理步驟十分繁瑣，而且糖醇乙酸酯酰胺衍生氣相色譜法的分離效果也不好，而PMP-HPLC法最適合對單糖組成比較復(fù)雜的酸性雜多糖的分析，該方法操作簡便,分離效果，重現(xiàn)性，穩(wěn)定性及信息的完整性都好于其它方法。

17、此方法可作為多糖的單糖組成分析的最佳測定方法。參考文獻(xiàn)NieW（聶偉）,ZhangYX（張永祥）,ZhouJH（周金黃）.AreviewofresearchonpharmacologyofTremellapolysaccharides.PharmClinChiMaterMed（中藥藥理與臨床）,2000,16:44-46.XuWQ（徐文清）,WangXJ（王雪姣）,HuangJ（黃潔），eta1.SeparationandStructuralFeaturesofaNeutralHeteropolysaccharideA-BTFAlkaloidExtraceofTremellafuciformB

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