園藝植物基因分離和克隆

1、關(guān)于園藝植物基因的分離與克隆第一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 文庫篩選法一、園藝植物基因組文庫的構(gòu)建二、園藝植物cDNA文庫的構(gòu)建三、目的基因的篩選 第二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、園藝植物基因組文庫的構(gòu)建 基因文庫的定義一組DNA或cDNA序列克隆的集合體。 基因文庫的類型基因組文庫：來自園藝植物基因組全部DNA片段組成的基因文庫，反映基因組的全部遺傳信息。cDNA文庫：將某一特定組織表達(dá)的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA組成的基因文庫，每個(gè)克隆只含1種mRNA信息，足夠數(shù)目克隆則包含細(xì)胞全部mRNA信息。cD

2、NA便于克隆和大量擴(kuò)增，不像基因組DNA含有內(nèi)含子很難表達(dá)。 第四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、園藝植物基因組文庫的構(gòu)建構(gòu)建的植物基因組文庫需滿足的條件文庫能夠覆蓋整個(gè)基因組。插入的DNA片斷比較大。文庫易于保存且較穩(wěn)定?；蚪M文庫構(gòu)建流程示意圖 第五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、園藝植物基因組文庫的構(gòu)建1.載體的制備1.1完整的基因組文庫所需要篩選的重組子數(shù)目Nln(1-P)/ln(1-f) 。N，重組子的數(shù)量；P，所要求的概率；f，某一插入片段與相應(yīng)生物基因組大小的比值。要以0.99的概率獲得番茄基因組（9.5108bp）20kb的插入片段，所需要篩選的

3、重組子數(shù)目為：Nln(1-0.99)/ln1-(2104/9.5108)=2.2105 第六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月 1.2載體的選擇： a）質(zhì)粒載體可承載15kb DNA左右片段 (有效的范圍為10kb) b）載體可承載25kb DNA左右片段(有效的范圍為15 kb) c）Cosmid 載體可承載45kb DNA左右片段(有效的范圍為40 kb) 第七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月1.3載體制備要求：純度高、去磷酸效果好。去磷酸化是為了提高載體和目標(biāo)片斷的連接效率。純度如果不高則會(huì)在重組克隆中含有大量的細(xì)菌基因組DNA，影響文庫的質(zhì)量。第八張，PPT共一百

4、零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、園藝植物基因組文庫的構(gòu)建要求：一般提取的DNA相對(duì)分子量至少應(yīng)該是文庫最終平均插入片斷長度的3-5倍。如插入片斷達(dá)到100kb以上，則要求提取的基因組DNA分子量要達(dá)到500kb以上。實(shí)踐證明：提取的基因組DNA分子量越大，得到的重組克隆的插入片斷越大。2.大片段基因組DNA的制備第九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組DNA的不完全酶切2.1根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇合適的限制性內(nèi)切酶 a) 四個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/256 b) 六個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的限制酶出現(xiàn)的幾率: 1/40962.2分離目的酶切片段大小的確定 a) 克隆單個(gè)基因：20kb2.3

5、DNA不完全酶切條件的確定 a) 確定限制酶用量，改變酶切時(shí)間 b) 固定酶切時(shí)間，改變限制酶的用量第十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月DNA的不完全酶切相同時(shí)間不同量第十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.大片段DNA與克隆載體連接3.1酶切片段的分離與純化）低熔點(diǎn)瓊脂糖回收目的片段）試劑盒回收目的片段10 kb第十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2酶切片段與克隆載體連接連接體系中的四種連接方式：載體自連、載體和基因組DNA片斷的連接、基因組DNA片斷的自連和基因組片斷之間的連接。只有基因組DNA和載體之間的連接才是所需要的。如何提高它們之間的連接

6、效率是連接反應(yīng)的關(guān)鍵?？梢酝ㄟ^調(diào)整載體與基因組DNA的比例來達(dá)到較好的效果。一般比例為1:51:15.第十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月 基因組DNA片段3凹端的不完全補(bǔ)平的策略-GATC-CTAG- GATC-CTAG -Sau3AI-GA GATC-CTAG AG-KlenowdATP /dGTP-CTCGAG-GAGCTC-XhoIKlenowdCTP /dTTP-CTC TCGAG-GAGCT CTC-互補(bǔ)GEM-11基因組DNAVector 第十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月4.載體的遺傳轉(zhuǎn)化電轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)化大腸桿菌使用最普通的一種手段。插入片段越大，轉(zhuǎn)化

7、效率越低。 5.克隆的挑取、驗(yàn)證從文庫中隨機(jī)挑選一定量的克隆，搖菌，提取質(zhì)粒DNA，酶切后，脈沖電泳檢查插入片段的大小，并根據(jù)數(shù)目計(jì)算空載率。細(xì)胞器DNA的污染會(huì)降低文庫的實(shí)際容載量，一般用線粒體和葉綠體的探針對(duì)文庫進(jìn)行檢測。第十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月6.文庫的擴(kuò)增、分裝及保存 1) 影印濾膜保存法第十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月2）文庫在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增保存方法：從瓊脂糖平板上挑取已長出的克隆子轉(zhuǎn)入含適當(dāng)?shù)目股嘏囵B(yǎng)基中，混合的細(xì)菌生長數(shù)代后，其培養(yǎng)物于-70 oC儲(chǔ)存（加終濃度為25%的甘油）。缺點(diǎn)：因文庫菌落生長的不均勻性而導(dǎo)致文庫中某些特定的序

8、列過多或過少。第十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3) 保存單個(gè)克隆子于含有甘油的培養(yǎng)基中方法：從平板上挑選單個(gè)克隆子接種于合適的含抗生素的培養(yǎng)基中，菌體生長到一定濃度后，加入終濃度為25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。缺點(diǎn)：需保存的克隆子數(shù)過多，工作量大第十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月 真核生物基因組DNA十分龐大，其復(fù)雜程度是mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列。 采用電泳分離和雜交的方法，都難以直接分離到目的基因。這是從染色體DNA為出發(fā)材料直接克隆目的基因的一個(gè)主要困難。 高等生物一般具有105種左右不同的基因，但在一定時(shí)間階段的

9、單個(gè)細(xì)胞或個(gè)體中，都只有15%左右的基因得以表達(dá)，產(chǎn)生約15000種不同的mRNA分子?？梢?，由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆簡單得多。二、園藝植物cDNA文庫的構(gòu)建 第十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、園藝植物cDNA文庫的構(gòu)建 （一）普通cDNA文庫的構(gòu)建純化mRNA樣品的制備選擇特定發(fā)育階段的特定組織為分離mRNA的材料。mRNA的純化:利用mRNA的3末端的poly (A)尾巴與oligo (dT)互補(bǔ)雜交，使mRNA固定在固相介質(zhì)上，再將mRNA洗脫下來，制備出純化的mRNA樣品。mRNA樣品完整性的檢測：根據(jù)28S和18S rRNA電泳

10、條帶的亮度判斷RNA的完整性，從而間接地判斷mRNA的完整性。如果28S rRNA條帶的亮度是18S 的兩倍，RNA樣品完整；如果兩條帶的亮度反過來，說明RNA樣品部分降解；如果無清晰的條帶，說明RNA樣品已經(jīng)嚴(yán)重降解。 第二十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA第一鏈的合成 關(guān)鍵是獲得大量完整的cDNA拷貝。影響因素：模板mRNA的質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄酶、引物。反轉(zhuǎn)錄酶：禽源 (AMV)和鼠源反轉(zhuǎn)錄酶(M-MuLV)。 AMV：除具有DNA聚合酶活性外，還有很強(qiáng)的RNase H酶活性。M-MuLV ：RNase H活性比AMV低，但

11、反轉(zhuǎn)錄效率比AMV低。Superscript反轉(zhuǎn)錄酶：除去了MMLV的RNase H活性，更能保證cDNA第一鏈的全長和高產(chǎn)。引物常用oligo (dT)和隨機(jī)六聚體核苷酸。 第二十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNAcDNA第一鏈的合成 5ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 35ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 55ppp5G G AAAAAAAAAAAAAAOH 3TTTTTTTTTTTTTTp 5cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPs第二十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.1自身引導(dǎo)法合成

12、cDNA第二鏈的技術(shù)流程 3.雙鏈cDNA的合成 第二十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.2置換合成法利用RNase H將雜交雙鏈中的mRNA降解，形成多段仍與cDNA第一鏈保持雜交的RNA片段。利用這些RNA片段作為引物，引導(dǎo)合成第二鏈cDNA。隨著合成產(chǎn)物的延伸，除5末端的RNA引物外，所有作為引物的RNA片段均被新合成的互補(bǔ)鏈所置換。通過DNA連接酶作用，將各段互補(bǔ)鏈連接成完整DNA鏈。除去殘存的5末端RNA片段，并用T4 DNA聚合酶削平3端突出的單鏈cDNA，得到一個(gè)雙鏈形式的cDNA片段。該方法直接利用第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，避免了中間處理和純化過程造成的cDNA損失，是目

13、前合成cDNA第二鏈的常用方法。第二十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月置換合成法合成cDNA第二鏈的技術(shù)流程 第二十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3.3同聚物引導(dǎo)法 在第一鏈的3端用末端轉(zhuǎn)移酶加上一段同聚體dG。以oligo (dC)為引物合成第二鏈。該法最大的缺點(diǎn)是獲得的cDNA 5端上游有一段dG:dC殘基，可能會(huì)抑制表達(dá)過程中DNA的轉(zhuǎn)錄。但該法在最佳條件下可高效克隆mRNA的5端序列。第二十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA第二鏈的合成 dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA 能保留完整的5端序列5ppp5G G AAAAAOH

14、3TTTTTp 53 HO5ppp5G G AAAAACCCCCCCOH 33 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 53 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGG3 HOCCCCCCCTTTTTp 55 pGGGGGGGAAAAAOH 3NaOH退火KlenowdNTPs第二十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月雙鏈cDNA的克隆 cDNA的修飾 為了提高雙鏈cDNA片段與載體的連接效率，需要對(duì)cDNA進(jìn)行修飾，即給平端的雙鏈cDNA片段添加銜接頭。所謂銜接頭是人工合成的含有限制酶酶切位點(diǎn)的短雙鏈DNA片段，或者一端為限制酶粘性末端的雙

15、鏈DNA片段。用前一種銜接頭連接后，為了避免限制酶對(duì)cDNA片段內(nèi)部可能出現(xiàn)的酶切位點(diǎn)的切割，在添加銜接頭之前，文庫cDNA需經(jīng)甲基化酶處理。添加后一類型的銜接頭時(shí)，不必對(duì)文庫cDNA進(jìn)行修飾。第二十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月合成接頭和銜接頭cDNA合成接頭(含酶切位點(diǎn))酶切NotI, SalI與載體連接Optional: methylation 接頭中含稀有位點(diǎn)，如NotI, SalI(100kb一次)先甲基化ds cDNA，再連接接頭第三十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月雙鏈cDNA的克隆 cDNA的克隆 將制備的cDNA成功克隆到載體中去的關(guān)鍵問題是cDN

16、A和載體的比例。必須尋找一個(gè)適當(dāng)?shù)谋壤员苊鈫蝹€(gè)重組體中含有多個(gè)串聯(lián)cDNA分子或產(chǎn)生過高的非重組背景。為提高連接反應(yīng)效率，可在連接混合物中加適量PEG 8000。建成的cDNA文庫一般應(yīng)進(jìn)行效價(jià)測定并擴(kuò)增，以利多次篩選并長期保存。第三十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月cDNA文庫構(gòu)建流程示意圖 第三十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月5.普通cDNA文庫存在的主要不足 低豐度表達(dá)序列在文庫中出現(xiàn)的幾率很低，要想得到低豐度表達(dá)基因，至少要篩選106個(gè)克隆。構(gòu)建普通cDNA文庫所需的mRNA量比較大，達(dá)到數(shù)微克。篩選普通 cDNA文庫的工作復(fù)雜，需要很長時(shí)間，限制了基因

17、克隆的速度。第三十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、園藝植物cDNA文庫的構(gòu)建 （二）新型cDNA文庫的構(gòu)建PCR介導(dǎo)的cDNA文庫 原理：以cDNA第一鏈為模板，設(shè)計(jì)一組引物，通過PCR擴(kuò)增獲得多拷貝雙鏈cDNA。優(yōu)點(diǎn)：增加低豐度mRNA的克隆機(jī)會(huì)；利用僅有的幾個(gè)細(xì)胞或微量的mRNA建立較大的cDNA文庫。缺點(diǎn)：PCR合成的片段一般較短，大片段的全長擴(kuò)增困難；擴(kuò)增過程中錯(cuò)誤摻入率甚高；由于PCR對(duì)短片段的擴(kuò)增效率高于長片段，故mRNA的原始豐度難以在文庫中體現(xiàn)。應(yīng)用：適合于克隆來源困難的組織或細(xì)胞的基因。第三十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）新型cDNA文

18、庫的構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫 定義：某一特定組織或細(xì)胞的所有表達(dá)基因均包含其中，且含量相等的cDNA文庫。優(yōu)點(diǎn)：增加了克隆豐度極低的mRNA的機(jī)會(huì)。能發(fā)現(xiàn)普通cDNA探針?biāo)荒馨l(fā)現(xiàn)的稀有轉(zhuǎn)錄區(qū)。能估計(jì)大多數(shù)基因的表達(dá)水平，并發(fā)現(xiàn)組織特異性基因。第三十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）新型cDNA文庫的構(gòu)建染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫 用某一染色體或基因組區(qū)DNA與合成的cDNA池或已構(gòu)建的cDNA文庫雜交，將捕獲的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，便可構(gòu)建染色體或區(qū)域特異性cDNA文庫。其中的cDNA或定位于該染色體上或與之有同源性。染色體顯微切割技術(shù)的發(fā)展使得構(gòu)建的文庫更狹窄，更具特

19、異性。第三十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）新型cDNA文庫的構(gòu)建消減cDNA文庫又稱差示文庫，常用于克隆不同組織或同一組織在不同的生理狀態(tài)下表達(dá)有差異的基因。在一定條件下用過量不含目的基因的驅(qū)動(dòng)方(driver)與含有目的基因的試驗(yàn)方(tester)進(jìn)行雜交，選擇性地去除相同基因雜交形成的復(fù)合物，將含有目的基因的未雜交部分收集后構(gòu)建相應(yīng)的文庫。由于消減cDNA文庫的富集作用，使所需篩選的克隆數(shù)減少幾十到上百倍。第三十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月基因組DNA文庫cDNA文庫基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較第三十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年

20、6月三、目的基因的篩選 根據(jù)目的基因的核苷酸序列篩選 根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，以基因組DNA或mRNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。如果得到的只是基因部分序列，可以將其克隆至載體，作為探針篩選cDNA文庫和基因組文庫獲得全長基因。用探針直接篩選庫，若能得到其它植物已分離的相關(guān)基因，則可以直接用作探針篩選cDNA文庫和基因組文庫，獲得研究植物的目的基因。第三十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月根據(jù)目的基因的表達(dá)特性篩選 如果已知基因表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的氨基酸序列，就可以反推出原來基因的核苷酸序列。從N端對(duì)10多個(gè)連續(xù)的氨基酸進(jìn)行序列測定，選擇連續(xù)6個(gè)以上簡并程度最低的氨基酸，按

21、各種可能的序列結(jié)構(gòu)合成寡核苷酸探針庫，從cDNA文庫和基因組文庫中篩選全長的基因。缺點(diǎn)：在實(shí)驗(yàn)中得到純度高、數(shù)量足夠的目的基因表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）是很困難的，蛋白質(zhì)測序也花費(fèi)較高，難度較大。第四十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR法篩選基因文庫 將基因文庫分裝96孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)一段時(shí)間后，分別從同一行或同一列孔中吸取少量培養(yǎng)物合并。以此混合物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)凝膠電泳的結(jié)果判定相應(yīng)行或列混合孔中是否含有陽性克隆。對(duì)含有陽性克隆的行或列孔中的培養(yǎng)物再次分裝，經(jīng)培養(yǎng)后進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。如此反復(fù)操作，直至獲得陽性克隆。第四十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第二

22、節(jié) 圖位克隆技術(shù)一、分離基因的程序 二、優(yōu)缺點(diǎn)第四十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、分離基因的程序 （一）圖位克隆技術(shù)的定義及原理定義：根據(jù)目標(biāo)基因在染色體上的位置進(jìn)行基因克隆的一種方法。原理：首先找到一個(gè)與目標(biāo)基因相連的DNA分子標(biāo)記，然后通過染色體步移技術(shù)克隆分離出目標(biāo)基因。當(dāng)基因與標(biāo)記之間的距離小于基因組文庫中克隆的平均插入片段大小時(shí)，就可直接篩選到含有目標(biāo)基因的克隆，這種方法稱為染色體登陸(chromosome landing)。 第四十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）分離基因的程序目的基因的初步定位利用分子遺傳圖譜確定與目的基因連鎖的分子標(biāo)記。目

23、的基因區(qū)域的物理作圖將分子標(biāo)記之間的遺傳距離（cM）轉(zhuǎn)化為物理距離（堿基數(shù)），構(gòu)成該基因區(qū)域的物理圖譜。構(gòu)建并篩選含有大插入片段的基因組文庫用與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選大片段基因組文庫，獲陽性克隆。第四十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）分離基因的程序構(gòu)建目的基因區(qū)域跨疊克隆群以陽性克隆的末端作為探針篩選基因組文庫，獲得含有目標(biāo)基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段跨疊群。目的基因的精細(xì)定位和染色體登陸以目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記為探針，通過染色體登陸獲得含目標(biāo)基因的陽性克隆。外顯子的分離和鑒定利用篩選cDNA文庫、外顯子捕捉等技術(shù)獲得候選基因，通過功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定目標(biāo)基因。第四十五張

24、，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、優(yōu)缺點(diǎn) 主要應(yīng)用于基因組較小、分子標(biāo)記連鎖圖密度較高和轉(zhuǎn)化系統(tǒng)比較穩(wěn)定成熟的植物。對(duì)于基因組較大、重復(fù)序列較多的園藝植物，圖位克隆法要步移大量的DNA片段，投資大，效率低；而且DNA大片段插入文庫含有許多嵌套克隆或克隆后的重排現(xiàn)象等原因，使得染色體步移十分困難。對(duì)于這些植物，可以通過構(gòu)建高密度的分子遺傳圖譜和尋找物理距離目的基因很近的分子標(biāo)記，使得染色體步移的距離大大縮小。第四十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法一

25、、轉(zhuǎn)座子的分類二、分離基因的程序三、優(yōu)缺點(diǎn)四、T-DNA標(biāo)簽法 第四十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、轉(zhuǎn)座子的分類 （一）轉(zhuǎn)座子的定義與功能定義染色體上一段可以移動(dòng)的DNA序列，可以從一個(gè)基因座位轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因座位。功能當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)時(shí)，就會(huì)使插入位置的基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；而當(dāng)轉(zhuǎn)座子切離時(shí)，又使目的基因恢復(fù)活性。第五十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月（二）轉(zhuǎn)座子的分類DNA轉(zhuǎn)座子通過DNA復(fù)制和直接切離兩種方式獲得可轉(zhuǎn)移片段，重新插入基因組DNA中。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 由RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)座子，即作為DNA的轉(zhuǎn)座子首先被轉(zhuǎn)錄為RNA，再借助

26、反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成DNA，插入到新的染色體位點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座過程的。第五十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、分離基因的程序 采取農(nóng)桿菌介導(dǎo)等適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化方法把轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入目標(biāo)植物，設(shè)法將轉(zhuǎn)座子插入到目標(biāo)基因內(nèi)部或鄰近位點(diǎn)，引起表型突變。通過表型篩選獲得純合突變株。構(gòu)建純合突變株的核基因組文庫。以轉(zhuǎn)座子片段作為探針，從該基因組文庫中篩選含轉(zhuǎn)座子片段的克隆。以該克隆作為探針，篩選另一正常植株的核基因組文庫，獲得完整的正常目的基因。第五十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆基因示意圖 第五十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽

27、法可在不了解基因產(chǎn)物的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下分離植物基因。局限性該技術(shù)的前提條件是要篩選出轉(zhuǎn)座子插入的突變體。在實(shí)際操作中，由于轉(zhuǎn)座頻率往往很低，因此需要篩選的突變體群體較大。對(duì)于那些須在特定環(huán)境或特定發(fā)育階段才有突變表型的基因，往往由于看不到明顯的突變表型而被忽略。由于基因的功能補(bǔ)償?shù)葯C(jī)制的作用，即使有些基因產(chǎn)生了插入突變，也可能看不到突變表型，因而不能運(yùn)用該方法。第五十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、 T-DNA標(biāo)簽法原理：T-DNA能夠從農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定地整合到植物宿主的基因組中，從而使整合位置上的基因失活或產(chǎn)生突變，通過T-DNA上的標(biāo)記基因(如GUS等基因)就

28、可檢測突變位置，得到與T-DNA相連的DNA片段，以此制備探針篩選野生型基因文庫，就可得到與突變相應(yīng)的完整基因。缺點(diǎn)由于T-DNA的可移動(dòng)性，不易獲得較穩(wěn)定的突變遺傳系。由于高等植物基因組中大量的重復(fù)序列存在，也降低了獲得目標(biāo)突變體的效率，實(shí)驗(yàn)周期較長。第五十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第四節(jié) 基因差異表達(dá)技術(shù) 一、mRNA差異顯示技術(shù)二、抑制性消減雜交技術(shù)三、代表性差異分析法四、基因表達(dá)系列分析五、cDNA-AFLP技術(shù) 第五十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、mRNA差異顯示技術(shù) 原理根據(jù)大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3端具有Poly(A)結(jié)構(gòu)，利用含Oligo

29、 (dT)的寡聚核苷酸作為引物，將總mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后通過PCR技術(shù)和變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離差異cDNA 片段，從而篩選出目的基因。第五十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月基本步驟從不同植物或組織中提取總mRNA。用Oligo(dT)12MN為引物(其中，MG/C/A，NG/C/T/A)，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用與反轉(zhuǎn)錄相同的錨定引物和由10 個(gè)堿基組成的隨機(jī)引物對(duì)生成的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳在相鄰泳道上分析，找到差異表達(dá)的cDNA條帶。回收差異表達(dá)的條帶，將其作為探針進(jìn)行Northern雜交或篩選

30、cDNA文庫，獲得差異表達(dá)的基因全長。第五十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月mRNA差異顯示技術(shù)示意圖 第五十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月5-AAAAAAAAAAAA mRNA NNTTTTTTTTTTTTanchor primer1st strand cDNANNTTTTTTTTTTTTNNNNNNN10-13bp arbitrary primerPCR (36-38C)anchor + arbitrary primersseparation onpolyacrylamide gelABDifferential Display第六十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作

31、于2022年6月第六十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月Differential HybridizationcDNAlibrarylow density(1,000/150mm)Replica plaque liftingmRNA (sample A)mRNA (sample B)labeled probelabeled probehybridization第六十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)在基因序列未知的情況下，直接用來鑒定和克隆差異表達(dá)基因，具有簡便、快速、RNA用量少、效率高等優(yōu)點(diǎn)。主要用于比較兩種以上特定生理狀態(tài)或不同發(fā)育階段的mRNA樣品間基因

32、表達(dá)的差異。缺點(diǎn)假陽性特別高，可達(dá)70%，增加了后續(xù)工作的難度。由于PCR 的敏感性，mRNA 差異顯示技術(shù)重復(fù)性較差。擴(kuò)增片段較小(110500 bp)，不能代表差異表達(dá)的基因。只能擴(kuò)增靠近Poly（A）mRNA 3端不大于600 bp 的區(qū)域。對(duì)高拷貝mRNA有較強(qiáng)的傾向性，不能用于低拷貝的mRNA。第六十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月二、抑制性消減雜交技術(shù) 原理以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA消減雜交。所謂抑制PCR是利用非目標(biāo)基因片段兩端的長方向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，無法作為模板與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增。第六十四張，PPT共一百零二頁

33、，創(chuàng)作于2022年6月基本步驟提取含有目的基因的待測組織(tester)和不含目的基因的對(duì)照組織（driver)的mRNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用限制性內(nèi)切酶將兩種不同的cDNA切割為小片段。將tester cDNA分為兩份，分別連接不同的接頭。用過量的driver cDNA分別與這兩種tester cDNA進(jìn)行第一次消減雜交，會(huì)產(chǎn)生：單鏈tester、雙鏈tester/tester、雙鏈tester/driver、單鏈driver及雙鏈driver /driver。第六十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月基本步驟混合兩份雜交樣品，并加入新的變性driver cDNA進(jìn)行第二次消減

34、雜交，從而形成一種新的雜交組分，即分別含有不同接頭的雙鏈cDNA分子 （tester-adaptor 1/tester- adaptor 2）。補(bǔ)平變性后分子的粘性末端。以接頭 1和接頭 2序列為引物對(duì)其進(jìn)行第一輪PCR。用與接頭內(nèi)側(cè)序列互補(bǔ)的另一對(duì)引物進(jìn)行第二輪PCR，富集差異表達(dá)的目的基因片段。用第二輪PCR產(chǎn)物構(gòu)建相應(yīng)的差減cDNA文庫，克隆差異表達(dá)基因。第六十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月抑制性消減雜交技術(shù)示意圖 第六十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)假陽性率大大降低，陽性檢出率為50%以上。目的序列富集程度較高，且豐度相對(duì)一致，確保了低豐度表達(dá)

35、的cDNA有被檢測的可能，極大地提高了檢測效率；靈敏度很高，重復(fù)性強(qiáng)。一次SSH實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)富集上百個(gè)差別表達(dá)的基因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)勝過DDRT-PCR。缺點(diǎn)需要較多的mRNA，因而某些特殊樣本不容易獲得。更多地依賴于PCR技術(shù)，不能同時(shí)對(duì)多個(gè)材料進(jìn)行比較。材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測。第六十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月三、代表性差異分析法 原理以差減雜交為基礎(chǔ)，從基因組水平篩選和克隆基因的方法。充分利用了PCR反應(yīng)中雙引物以指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈模板，而單引物僅以線性形式擴(kuò)增單鏈模板這一特性，并通過降低cDNA群體復(fù)雜性和多次更換cDNA兩端接頭等方法，特異地?cái)U(kuò)增目的

36、基因片斷。 第六十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月基本步驟 分別提取試驗(yàn)組T和驅(qū)動(dòng)組D的RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后加上接頭，以接頭特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性酶切除去接頭后，給T組酶切產(chǎn)物連上新的接頭，使之區(qū)別于D組的cDNA。用過量的D組酶切產(chǎn)物與經(jīng)“修飾”過的T組cDNA混合，經(jīng)變性、退火復(fù)性后形成T-D、T-T和D-D雜交分子。利用T組新接頭的特異接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，T-T同源雜交分子將得到有效擴(kuò)增。重復(fù)23次差減雜交步驟，盡可能去除共有序列，對(duì)差異表達(dá)基因片段進(jìn)行更有效的富集?？寺〔町惐磉_(dá)基因。 第七十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺

37、點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)免去了物理方法分離單、雙鏈的繁瑣操作，通過接頭“修飾”設(shè)計(jì)，借助PCR技術(shù)即能使目的片段得到有效擴(kuò)增，減少假陽性。差減雜交在擴(kuò)增后的cDNA群體之間進(jìn)行，不再受供試的mRNA量的限制，拓寬了差減雜交的應(yīng)用范圍。一次實(shí)驗(yàn)可分離得到多個(gè)在T組和D組間差異表達(dá)基因的cDNA克隆，并能發(fā)現(xiàn)與表型相關(guān)的異?；?，檢測基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)。第七十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點(diǎn) 缺點(diǎn)目的基因間豐度的差異在數(shù)輪差減雜交后的群體中保留了下來，在后續(xù)的篩選中，高豐度的差異基因容易得到，低豐度的差異基因不易檢出，而低豐度的表達(dá)產(chǎn)物往往代表相對(duì)重要的基因。分離出來的差異基因也可能與其表型

38、無關(guān)，增加了后續(xù)鑒定的工作量。對(duì)樣品T組和D組的純度要求很高，如果兩組材料間差別較大，則用此方法將達(dá)不到鑒定差別表達(dá)基因的目的。第七十二張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月四、基因表達(dá)系列分析基因表達(dá)系列分析（SAGE）是通過快速和詳細(xì)分析成千上萬個(gè)EST（express sequenced tags）來尋找出表達(dá)豐富度不同的SAGE標(biāo)簽序列。在此方法中，通過限制性酶切可以產(chǎn)生非常短的cDNA（10-14bp）標(biāo)簽，并通過PCR擴(kuò)增和連接，隨后對(duì)連接體進(jìn)行測序。SAGE大大簡化和加快了3端表達(dá)序列標(biāo)簽的收集和測序。同DD一樣，SAGE是一個(gè)“開放”的系統(tǒng)，可以發(fā)現(xiàn)新的未知的序列。在進(jìn)行

39、標(biāo)本的比較之前，SAGE在cDNA的產(chǎn)生和處理上需要較多個(gè)步驟。 第七十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第七十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月biotin第七十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月五、cDNA-AFLP技術(shù) 原理與基本步驟 提取植物總RNA后，先將樣本mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。同時(shí)利用2 個(gè)分別識(shí)別6堿基和4堿基序列的限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行酶切。酶切片段分別與接頭連接，然后利用與接頭互補(bǔ)的引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。再在引物3末端加23個(gè)選擇性堿基進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，最后在測序膠上展示，可獲得 1001000 bp 間的重復(fù)性好、清晰的條帶。通過比較不同來源

40、的mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物，就可以獲得差異表達(dá)的基因的片段。 第七十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月EcoR IMse I（限制性內(nèi)切酶）EcoR I接頭Mse I接頭EcoR I引物+AMse I引物+C（預(yù)擴(kuò)增）EcoR I引物+AACMse I引物+CAA（選擇擴(kuò)增）（連接）（電泳檢測）第七十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)在理論上cDNA-AFLP可產(chǎn)生的條帶的種類是無限的，它可以對(duì)生物體全部mRNA樣品進(jìn)行篩選。在cDNA酶切片段兩端加上統(tǒng)一引物作為PCR擴(kuò)增的模板，提高了PCR反應(yīng)的嚴(yán)謹(jǐn)性，具有重復(fù)性高，假陽性率低的特點(diǎn)，因此，其可靠性大大地提高，

41、重復(fù)性可達(dá)95%以上。此外，由于cDNA-AFLP絕大部分?jǐn)U增的是mRNA的編碼區(qū)序列，它可以獲得比DDRT-PCR更加豐富的信息。擴(kuò)增條帶的強(qiáng)度能準(zhǔn)確反映基因間表達(dá)量的差別。缺點(diǎn)整個(gè)操作過程繁瑣，假陽性率有時(shí)也較高。第七十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 同源序列法 一、基于同源序列的侯選基因法二、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) 第七十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、基于同源序列的侯選基因法 基本策略 根據(jù)已知基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，以待分離此基因的植物基因組DNA或cDNA為模板直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測序并與已知基因進(jìn)行序列比較，從而確定該基因是否為待

42、分離基因。用已知序列的基因制備探針，篩選待分離基因的植物核DNA或cDNA文庫。再對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序，并與已知基因序列進(jìn)行同源性比較，最后經(jīng)轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因。 第八十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月氨基酸序列比較設(shè)計(jì)簡并引物PCR擴(kuò)增文庫篩選/RACE第八十一張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月需要注意的問題 由于密碼子的簡并性和不同的同源序列間同源程度的差異，簡并引物的特異性要設(shè)計(jì)得當(dāng)。由于同源序列并不專屬于某一基因家族，因而擴(kuò)增產(chǎn)物不一定是某一基因家族成員。基因家族成員往往成簇存在，克隆的基因片段是否為目的基因尚需進(jìn)一步轉(zhuǎn)化鑒定。 第八十二張，PPT共一百零二

43、頁，創(chuàng)作于2022年6月二、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) 基本步驟 從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中，比較分析待克隆基因的保守序列區(qū)段。以此保守序列設(shè)計(jì)特異或簡并引物，從待測植物組織的cDNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得待分離基因的cDNA片段。通過RACE技術(shù)獲得cDNA的5和3端，并與已知基因序列進(jìn)行同源性比較。轉(zhuǎn)化鑒定是否為待分離的基因。 第八十三張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3RACE利用絕大部分mRNA的3末端具有poly(A)，以O(shè)ligo（dT）和一個(gè)接頭組成的接頭引物(adaptor primer，AP)反轉(zhuǎn)錄mRNA，得到加接頭的第一鏈cDNA。根據(jù)已獲得的待分離基因cDN

44、A片段設(shè)計(jì)兩條特異引物GSP1 (gene specific primer 1，GSP1)和GSP2 (gene specific primer 2，GSP2)，分別與已知的接頭引物進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，從而獲得該基因的3端。第八十四張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月3RACE技術(shù)示意圖 第八十五張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月5RACE經(jīng)典方法用待分離基因的反向特異引物GSP反轉(zhuǎn)錄總RNA為第一鏈cDNA，在未知的cDNA的5端加上一個(gè)接頭。再用GSP和接頭引物經(jīng)PCR擴(kuò)增出待分離基因的5端。 環(huán)化5RACE 設(shè)計(jì)目的基因5磷酸化的反向特異引物GSP0，并在其遠(yuǎn)端（靠近5

45、端）設(shè)計(jì)兩條反向特異引物GSP1和GSP2，在其近端（靠近3端）設(shè)計(jì)兩條正向特異引物GSP3和GSP4。用GSP0反轉(zhuǎn)錄總RNA為第一鏈cDNA，然后通過T4 RNA連接酶環(huán)化cDNA，并以此環(huán)化cDNA為模板用GSP1和GSP4與GSP2和GSP3進(jìn)行兩輪巢式PCR擴(kuò)增，從而獲得待分離基因的5端。 第八十六張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月5環(huán)化RACE技術(shù)示意圖 第八十七張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月獲得基因全長的途徑 一種方法是對(duì)3 RACE和5 RACE的產(chǎn)物序列的重疊區(qū)域分析，經(jīng)過拼接獲得全長cDNA。另外一種方法是通過分析RACE產(chǎn)物的3和5端序列，重新設(shè)計(jì)

46、合成相應(yīng)引物，PCR擴(kuò)增出全長cDNA。 第八十八張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)操作速度快，節(jié)省時(shí)間，可在短期內(nèi)獲得全長的cDNA。只需極少量的起始反應(yīng)物質(zhì)，具有快速、簡便、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用性強(qiáng)等許多優(yōu)點(diǎn)。尤其環(huán)化5RACE無須去帽或加錨等煩瑣步驟，且全部使用特異引物，因而幾乎不存在產(chǎn)生非特異產(chǎn)物的可能。 缺點(diǎn)利用RACE技術(shù)來獲得全長基因經(jīng)常會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤的擴(kuò)增和克隆結(jié)果，尤其是對(duì)于豐度較低、長度較長的基因。經(jīng)常出現(xiàn)由于引物的不匹配而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，有時(shí)需要進(jìn)行幾輪巢式擴(kuò)增來達(dá)到獲得特異性擴(kuò)增的目的，然而多輪擴(kuò)增又容易提高PCR反應(yīng)的錯(cuò)誤發(fā)生率。 第八十九張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 基因芯片技術(shù) 一、基因芯片的類型二、基本程序三、優(yōu)缺點(diǎn)第九十張，PPT共一百零二頁，創(chuàng)作于2022年6月一、基因芯片的原理（一）基因芯片的原理 將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后使其與待測的標(biāo)記樣品基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)