免疫組化7.PPT

1、 第七章 免疫組化結(jié)果的分析和判斷（要求：理解， 熟記， 會用） 第一節(jié) 免疫組化結(jié)果的判斷原則 免疫組化結(jié)果的判斷原則概括起來有以下幾點(diǎn)： 必須同時設(shè)對照染色。沒有對照染色的免疫組化染色結(jié)果是不可信的。 抗原表達(dá)必須在特定部位。如LCA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上；CK應(yīng)定位在細(xì)胞漿內(nèi)；PCNA及p53蛋白應(yīng)定位在細(xì)胞核內(nèi)；EMA應(yīng)定位在細(xì)胞膜上，等等。不在抗原所在部位的陽性著色，一概不能視為陽性。 陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。由于檢測方法靈敏度有高低之分，有時可因染色方法靈敏度不夠，而導(dǎo)致陰性反應(yīng)，判斷時應(yīng)注意。 盡量避開出血、壞死及切片刀痕和界面邊緣細(xì)胞的陽性表達(dá)，特別是酶免疫標(biāo)記。因?yàn)檫@類陽性著色

2、多系內(nèi)源干擾，或系人為因素所致。 對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的意義不能絕對化，應(yīng)結(jié)合臨床資料、X線等影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析。 第二節(jié) 對照染色設(shè)計(jì) (一）對照染色的目的 設(shè)對照的目的是為了排除假陰性和假陽性。假陰性的原因主要有三：組織處理不當(dāng)，抗原丟失過多或被遮蔽；抗體失活、效價過低或稀釋度不合適（主要指一抗，即特異性抗體）；染色步驟遺漏及差錯，或顯色劑的選擇、緩沖液的pH和離子強(qiáng)度不當(dāng)?shù)取?假陽性均系由多種因素造成的非特異著色所致，原因主要有：自發(fā)熒光或內(nèi)源酶等干擾；抗體試劑不純(特別是一抗）；操作失誤，如污染、切片干枯或顯色劑操作不當(dāng)?shù)?；Fc受體的干擾，等等。（二）對照的種類及其選用目的 對照染

3、色大致可分為陽性組織對照、陰性組織及陰性試劑對照和自身對照四大類：陽性組織對照 指用已證實(shí)含有靶抗原的同源及不同源組織切片或細(xì)胞涂片與待檢實(shí)驗(yàn)切片同時作同樣處理和免疫染色的組織對照。正確的結(jié)果應(yīng)呈現(xiàn)陽性，目的是為了證實(shí)所用免疫組化染色流程的有效性，排除假陰性的可能。 陰性組織對照 指用已證實(shí)不含靶抗原的同步處理和免疫標(biāo)記染色的組織對照。正確的結(jié)果應(yīng)為陰性，目的是除外假陽性。陰性試劑對照 是指用于證實(shí)在免疫組化染色中所用試劑，尤其是特異性抗體試劑的有效性和可靠性而所設(shè)立的同步免疫染色對照，包括有：空白對照；替代對照；吸收試驗(yàn)和抑制試驗(yàn)，等。目的在于除外假陽性和證實(shí)所用免疫組化試劑及其技術(shù)方法的有

4、效性和待檢實(shí)驗(yàn)切片免疫標(biāo)記陽性結(jié)果的可靠性?？瞻讓φ?指以緩沖液（PBS、TBS等）取代第一抗體（主要的，必要時還可做第二抗體及橋聯(lián)抗體的空白取代），其他各步不變的試劑對照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。 取代對照 指以所用方法第一抗體同源動物的正常血清，或與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的抗體(靶生物缺如的)取代第一抗體，其他步驟不變的試劑對照染色，結(jié)果應(yīng)為陰性。吸收試驗(yàn) 是指用事先經(jīng)過量抗原吸收的第一抗體上清液取代第一抗體，其他步驟不變的免疫染色試劑對照。結(jié)果應(yīng)是陰性或陽性著色明顯減弱（吸收不全時）。 抑制試驗(yàn) 是指用標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗體（可以是一抗，也可以是二抗或橋抗體）兩者的混合物作試劑，其他步驟不變的免疫組化染色試

5、劑對照，結(jié)果其陽性著色應(yīng)成比例的減弱（等量或1：9）。此試劑對照多用于直接法。 這類陰性試劑對照的選用原則是：空白對照不能省，其他對照在預(yù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)盡量多做，尤其是應(yīng)用新抗體試劑；對照必需與實(shí)驗(yàn)片同步進(jìn)行染色；對照的結(jié)果應(yīng)附合要求。 自身對照 是指在同一標(biāo)記切片上的自身組織成分的陰性背景對照。即與靶抗原陽性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的顯色，結(jié)果應(yīng)為陰性或著色較淺，需與陽性著色成分呈鮮明對比。目的在于排除內(nèi)源性干擾產(chǎn)生的假陽性和因抗原彌散移位造成的錯誤結(jié)果。 第三節(jié) 非特異染色 非特異染色是指免疫組化染色過程中產(chǎn)生的非靶抗原的呈色結(jié)果，屬假陽性，又稱背景著色，能嚴(yán)重干擾免疫組化染色結(jié)果的正確

6、判斷，應(yīng)竭力避免或減輕。其原因涉及免疫組化染色流程的各個環(huán)節(jié)，可來自： 內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源酶、內(nèi)源性生物素等)；試劑污染(質(zhì)量差，交叉反應(yīng)，F(xiàn)c受體干擾等)；組織處理不當(dāng)(組織固定不及時或固定不良所導(dǎo)致的抗原彌散移位、洗滌不充分所導(dǎo)致的游離試劑殘留等)。 糾正的方法視原因而異，可在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用有針對性的糾正對策，即對癥下藥(具體糾正方法不展開講了，同學(xué)們可以自己閱讀講義p123-126) 。第四節(jié) 陽性標(biāo)記的形態(tài)特征和判斷 免疫組化標(biāo)記具有一定形態(tài)特點(diǎn)，若能熟練掌握則有助于對免疫組化標(biāo)記結(jié)果的正確判斷。特點(diǎn)包括定性、定位和定量三方面。 免疫顯色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，實(shí)

7、際工作中常采用強(qiáng)度和密度結(jié)合的方法綜合計(jì)量，與抗原含量有關(guān)；陽性細(xì)胞的著色形態(tài)及組織分布特點(diǎn)主要是定位指標(biāo)，與功能有關(guān)。 一、陽性標(biāo)記免疫特征：分弱(+)、中(+)、強(qiáng)(+)三級。免疫熒光法（FITC為例） 則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光； 免疫酶標(biāo)記（HRP- DAB/H2O2）則表現(xiàn)為淡黃色細(xì)顆粒、棕黃色顆粒和褐黃色粗顆粒，后者耀眼易見。一般圖片照像，原則上多取強(qiáng)陽性區(qū)域。二、陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 可分為胞膜型；胞核型；胞質(zhì)(漿)型；微絨毛型和復(fù)合型（胞膜-胞質(zhì)兼有，胞核-胞質(zhì)兼有，或微絨毛-胞質(zhì)兼有）等五種陽性細(xì)胞類型。這與抗原所在部位相

8、關(guān)聯(lián)，但應(yīng)注意排除因組織固定不好引起的抗原彌散假象，尤其是復(fù)合型圖像。三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征（以HRP-DAB/H2O2為例） 免疫組化染色陽性細(xì)胞在組織中的分布排列形式可以有如下7種：局灶型；彌漫型；片塊型；網(wǎng)狀型；腺管型；腔緣型和菊團(tuán)型，等。這主要取決于抗原抗體復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽性細(xì)胞在組織內(nèi)的群體分布特點(diǎn)。四、陽性標(biāo)記強(qiáng)度特征 依照細(xì)胞陽性著色程度（抗原含量），可分為弱陽性（+）1分；中等陽性（+）2分；強(qiáng)陽性（+）3分。依照陽性細(xì)胞數(shù)量，可分為：弱陽性（+ ，指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%以下）；中等陽性（+,指陽性細(xì)胞總數(shù)在25%49%)；強(qiáng)陽性（+ ，指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上)。目

9、前多采用積分綜合計(jì)量。計(jì)算公式為：（+）%x1 +（+）%x2+（+）%x3；總數(shù)值1.5者為(+)。至少隨機(jī)觀察5-10個HPF。第五節(jié) 染色失敗的可能原因 免疫組化染色的基本要求有二：實(shí)驗(yàn)切片的陽性抗原定位準(zhǔn)確，呈色鮮明，背景著色淺或無，二者的比值應(yīng)大于1（陽性/背景）；對照染色的結(jié)果應(yīng)附合要求。否則，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是錯誤的，或?yàn)榧訇栃曰驗(yàn)榧訇幮浴?假陽性是指實(shí)驗(yàn)切片呈陽性，陰性組織對照或陰性試劑對照也呈陽性的結(jié)果，謂之假陽性。其原因與內(nèi)源性干擾，試劑不純，交叉反應(yīng)等有關(guān)。 假陰性是指實(shí)驗(yàn)切片呈陰性，陽性組織對照及陰性試劑對照也均呈陰性的結(jié)果，謂之假陰性。其原因與組織處理不當(dāng)，組織細(xì)胞抗原丟失或試劑錯誤(如漏加、錯加、失效、變質(zhì)等),操作失誤等有關(guān)。 對照結(jié)果判斷：表中15結(jié)果無效，6、7結(jié)果可靠（）（）（）（）（）（）（）檢測標(biāo)本含抗體，結(jié)果可靠（）（）（）7檢測標(biāo)本不含抗體結(jié)合可靠（）（）（）6非特異染色（）（）（）5陽性對照不含定位抗原（）（）（）4陰性對照內(nèi)含定位抗原()()（）（）3非特異性染色（）（）（）2抗體失活，操作有誤（）（）（）1結(jié)果判斷檢測結(jié)果替代對照陰性對照陽性對照染色失敗原因：均為陰性均為弱陽性（除陰性對照）背景染色過深陽性對照好，待檢標(biāo)本弱陽性陽性對照無背景，待檢標(biāo)本背景深判斷原則：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)抗體選擇抗原定