腫瘤壞死因子

1、腫瘤壞死因子 近年來，人們一直都在尋找攻克惡性腫瘤的方法，但到目前為止仍然沒有十分有效的治療手段。所以,尋找具有生物活性的細胞毒性分子誘導腫瘤細胞凋亡逐漸成為腫瘤生物治療領(lǐng)域關(guān)注的焦點。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)是迄今發(fā)現(xiàn)的直接殺傷惡性腫瘤作用最強的生物活性因子，能特異性殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯的毒性作用，因而受到人們的普遍重視。2目前普遍認為，TNF最早是1975年由Carswell發(fā)現(xiàn)的。Carswell在研究中觀察到，經(jīng)卡介苗致敏的小鼠被注射大腸桿菌內(nèi)毒素后，血清中出現(xiàn)一種物質(zhì)，該物質(zhì)在體內(nèi)可以使移植腫瘤發(fā)生出血、壞死，遂將該物質(zhì)命名為腫瘤壞

2、死因子(tumor necrosis factor, TNF)3 自Carswell發(fā)現(xiàn)TNF后，許多學者進行的其他研究均觀察到TNF在體外和體內(nèi)對多種腫瘤細胞有明顯的細胞毒作用。1984年P(guān)ennica等首次克隆了人TNF-的cDNA，并在大腸桿菌中表達成功。20世紀80年代末，西方國家就已批準了人TNF治療惡性腫瘤的臨床試驗，但因毒副作用太強而未能進行下去。4隨著對TNF結(jié)構(gòu)和作用機制的深入研究，一些高效、低毒的TNF變構(gòu)體不斷涌現(xiàn)，TNF的臨床研究又有了新的進展。下面簡單介紹一下TNF。TNF的結(jié)構(gòu)與功能TNF的生物學活性TNF抗腫瘤作用的機制TNF的基因療法5TNF的結(jié)構(gòu)與功能把巨噬細

3、胞產(chǎn)生的tnf命名為tnf- ，把t淋巴細胞產(chǎn)生的淋巴毒（lymphotoxin,lt)命名為tnf-。tnf-又稱惡質(zhì)素。6tnf-是一種單核因子，主要由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，lps是較強的刺激劑。ifn-、m-csf、gm-csf對單核細胞/巨噬細胞產(chǎn)生tnf-有刺激作用，而pge則有抑制作用。前單核細胞系u937、前髓細胞系hl-60在pma刺激下可產(chǎn)生較高水平的tnf-。t淋巴細胞、t細胞雜交瘤、t淋巴樣細胞系以nk細胞等在pma刺激下也可分泌tnf-。sac、pma、抗igm可刺激正常b細胞產(chǎn)生tnf-。此外，中性粒細胞、lak、星狀細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞亦可產(chǎn)生tnf-。7t

4、nf-是一種淋巴因子，抗原和絲裂原均可刺激t淋巴細胞分泌tnf-。pma刺激rpmi1788b淋巴母細胞可分泌高水平tnf-。8人的tnf-基因長約2.76kb，小鼠為2.78kb，結(jié)構(gòu)非常相似，均由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，與mhc基因群密切連鎖，分別定位于第6對和第17對染色體上。人 和小鼠tnf-基因分別定位于第6和第17號染色體。hutnf-分子由205個氨基酸殘基組成，含34氨基酸殘基的信號肽，成熟型hu tnf-分子為171個氨基酸殘基，分子量25kda。9腫瘤壞死因子的作用借助機體免疫功能，對同一腫瘤產(chǎn)生直接和間接雙重活性的抗癌效應，并使營養(yǎng)血管出血壞死。刺激成纖維細胞(修復

5、)增殖。抑制脂蛋白的脂質(zhì)活性。增進凝血因子及組織因子(血液凝固 )的活性。10誘導產(chǎn)生IL-2(白介素2，參與抗腫瘤效應)及IL-6增強中性粒細胞(趨化、吞噬和殺菌 )對血管內(nèi)皮的黏附性。產(chǎn)生菌溶刺激因子等。在體外對人類腫瘤細胞(如鼻咽癌、子宮癌、白血病等)有直接抑制增殖作用。在體內(nèi)可引起腫瘤壞死、瘤體縮小以致消失。11TNF的生物學活性 TNF是一種真正的多效因子，具有多種生物學效應。它可直接作用于T細胞、B細胞、NK細胞等效應細胞， 在細胞水平上發(fā)揮作用。與受體結(jié)合，引起細胞破壞、死亡損傷內(nèi)皮細胞，激活凝血系統(tǒng)引起機體發(fā)熱促進細胞的增殖和分化，調(diào)節(jié)機體免疫功能抑制新骨生成、刺激骨吸收激活嗜

6、中性粒細胞和巨噬細胞12TNF抗腫瘤作用的機制通過TNF受體介導的對腫瘤細胞的直接殺傷作用抑制細胞生長和誘導凋亡通過損傷腫瘤的血供系統(tǒng)而導致腫瘤的壞死通過引起腫瘤局部的炎癥反應和機體的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的多藥耐藥，增加對化療藥物的敏感性13TNF的基因療法TNF基因?qū)朊庖呒毎栽鰪娖涿庖邭?1993年首次將TNF基因?qū)隩 細胞，與未轉(zhuǎn)染的T 細胞比較，轉(zhuǎn)染細胞產(chǎn)生大量TNF，但與相同條件下轉(zhuǎn)染的腫瘤細胞相比產(chǎn)量很低。隨后，Tashiro等將TNF基因?qū)隠AK細胞，使LAK細胞膜表面TNF呈陽性，分泌量增加，細胞毒活性增強。14 將TNF基因?qū)肽[瘤細胞以誘導機體免疫

7、系統(tǒng)產(chǎn)生更有效的免疫應答 有實驗證實局部的TNF高濃度可在宿主沒有毒性反應的情況下導致腫瘤消退。1992年Rosenberg等用TNF基因轉(zhuǎn)染自身腫瘤細胞，然后收集引流部位的淋巴細胞，經(jīng)體外加IL-2培養(yǎng)擴增后回輸給病人。期望通過遺傳工程技術(shù)使腫瘤細胞額外產(chǎn)生TNF，刺激局部的淋巴細胞和趨化全身其它部位的淋巴細胞到達腫瘤部位，增強免疫殺傷作用，但臨床效果不佳。15TNF突變型由于多數(shù)學者認為TNF的細胞毒活性是由TNFR-p55介導的，因此研究者們主要致力于改建能選擇性地與TNFR-p55結(jié)合的TNF突變型。已報道有些TNF突變型能選擇性地結(jié)合TNFR-p55,而與TNFR-p75的親合力很低

8、。人們希望這些TNF突變型用于臨床治療時能突出其抗瘤效應，而同時盡可能地降低其毒副作用。16受體選擇性TNF突變型 TNF的生物學活性是通過TNFR介導的。當TNF與TNFR結(jié)合后即內(nèi)化并降解，產(chǎn)生一系列細胞內(nèi)信號，導致不同的生物學活性。雖然目前對兩類TNFR是否有分工及如何分工尚無一致意見，但二者細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)差別很大，幾乎可以肯定它們在細胞內(nèi)信號 傳遞上存在差異。由于多數(shù)學者認為TNF的細胞毒活性是由TNFR-p55介導的，因此研究者們主要致力于改建能選擇性地與TNFR-p55結(jié)合的TNF突變型。已報道有些TNF突變型能選擇性地結(jié)合TNFR-p55,而與TNFR-p75的親合力很低。人們希望這

9、些TNF突變型用于臨床治療時能突出其抗瘤效應，而同盡可能地降低其毒副作用。17 不分泌性 TNF突變型Kriegle等首先發(fā)現(xiàn)，人T N F-a有兩種形式，即26k D膜結(jié)合型及17kD分泌型。認為這兩種形式的人T N F-a均有細胞毒活性。此后，另一些學者發(fā)現(xiàn)膜結(jié)合型TNF在殺傷TNF敏感的靶細胞中起主要作用。1990年，Perze等通過缺失突變?nèi)薚 N F-a得到一個僅表達在細胞膜表面、不分泌的TNF突變型。他們用這種不分泌的 TNF突變型基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞發(fā)現(xiàn)，這種不分泌的TNF突變型能殺傷腫瘤細胞及 病毒感染細胞，且能將其作用局限在靶細胞附近而不引起TNF分泌所導致的全身性毒副作

10、用。因此人們設想，如果將這種TNF突變型用于基因治療，既可增強抗瘤效應，又可以克服TNF分泌量過高引起的毒副作用，有可能解決野生型TNF基因用于基因治療中所存在的一些問題。18TRAIL及其受體腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)或稱凋亡素2配體(Apo2 ligand,Apo-2L), 是近幾年發(fā)現(xiàn)的一個可誘導腫瘤細胞凋亡的TNF家族成員。19TRAIL最大的優(yōu)點是它可以選擇性誘導腫瘤細胞凋亡,但對正常細胞沒有毒副作用。因此,TRAIL已經(jīng)成為許多研究的熱點,并有可能成為新一代的抗腫瘤藥物。20TRAIL的

11、結(jié)構(gòu)特點人TRAIL分子屬型跨膜蛋白,包括胞漿區(qū)(14aa)、跨膜區(qū)(26aa)和胞膜外區(qū)(241aa)。C端(細胞外區(qū)域)保守性強,能形成幾個折疊,再形成典型的夾心結(jié)構(gòu),進而形成同源三聚體的亞結(jié)構(gòu);N端(細胞內(nèi)區(qū)域)沒有信號肽序列,其發(fā)揮功能的部位主要位于胞外區(qū)。21TRAIL受體TRAIL是通過與其細胞膜受體結(jié)合發(fā)揮誘導凋亡作用的,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了5種TRAIL受體,它們都可以與TRAIL發(fā)生特異性結(jié)合,并且不與其它細胞毒配體結(jié)合。22死亡受體TRAIL-R1和TRAIL-R2均屬于TNFR(TNFreceptor)基因超家族成員。它們分別具有一段死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,簡稱D

12、D),與TRAIL結(jié)合后可誘導腫瘤細胞凋亡,故又被稱作死亡受體。TRAIL-R1也稱死亡受體4(death receptor-4,DR4), DR4屬型跨膜蛋白，它的胞外區(qū)有兩個半胱氨酸富集區(qū)(cysteine-rich domain, CRD),胞內(nèi)有一段由70個氨基酸組成的死亡結(jié)構(gòu)域。23 TRAIL-R2也稱死亡受體5(DR5), DR5也屬型跨膜蛋白, 它的胞外和胞內(nèi)區(qū)也分別含有兩個半胱氨酸富集區(qū)及一段死亡結(jié)構(gòu)域。 DR5過表達可引起多種細胞發(fā)生凋亡,例如: Jurkat為TRAIL敏感細胞株,細胞表面DR5高水平表達,當用DR5的單克隆抗體(DR5mAb)與Jurkat細胞表面的DR

13、5作用后,TRAIL對Jurkat細胞的殺傷功能幾乎完全被阻斷。24誘騙受體 TRAIL-R3和TRAIL-R4因為沒有死亡結(jié)構(gòu)域,或死亡結(jié)構(gòu)域不完整,雖然可以與TRAIL結(jié)合,但不能傳遞死亡信號,無法誘導細胞凋亡,故被稱為誘騙受體。這類受體可能在正常細胞抵制TRAIL的誘導凋亡作用中扮演重要角色。25TRAIL-R3也稱誘騙受體-1 ( decoy receptor-1,DcR1)它是一個糖基磷脂酰肌醇(glycophos-phatidyl inosito,l GPI)錨定的細胞表面蛋白。DcR1與TRAIL親和力較高,它有5個糖基化位點,去糖基化可以增強DcR1與TRAIL的親和力。它在胞

14、外區(qū)含有一段與死亡受體同源性很高的半胱氨酸富集區(qū),不同點在于它沒有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域,因此可以與TRAIL結(jié)合但不能傳遞死亡信號。26 TRAIL-R4也稱DcR2,它是一個由386氨基酸編碼的型跨膜蛋白, 與死亡受體相比,DcR2的C端缺少52個氨基酸,即胞內(nèi)有一段不完整的死亡結(jié)構(gòu)域,故也不能傳遞死亡信號。27TRAIL的作用機制 TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡的機制TRAIL誘導細胞凋亡主要有兩個途徑: (1)半胱天冬酶(caspase)和死亡受體相關(guān)的細胞凋亡途徑; (2)線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號途徑。TRAIL與其他TNF家族成員一樣,可以誘導多種腫瘤細胞凋亡,而且對抑癌基因p53突變造成的對

15、放療、化療不敏感的腫瘤細胞也有較好的誘導凋亡的作用。28半胱天冬酶(caspase)和死亡受體相關(guān)的細胞凋亡途徑 TRAIL三聚體能誘發(fā)死亡受體DR4和DR5三聚體化。死亡受體一端通過胞外區(qū)的半胱氨酸富集區(qū)與TRAIL結(jié)合并被活化,另一端通過胞內(nèi)區(qū)的死亡結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白(adaptor pro-tein)C端的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合,接頭蛋白再以其N端死亡效應域(DED)與半胱天冬蛋白酶原(pro-caspase)在末端的局部募集并串連結(jié)合,形成TRAIL-死亡受體-接頭蛋白-pro-caspase死亡誘導信號復合物(DISC)29促使pro-caspase自身水解成為有活性的caspase-8。Ca

16、spase-8可以激活caspase級聯(lián)反應,進一步募集和激活caspase家族中的下游信號傳導酶,直至最終激活效應酶caspase-3,誘導細胞凋亡。30線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號途徑在線粒體途徑中, caspase-8被激活后通過線粒體釋放細胞色素C(Cytochrome C)來激活caspase-3誘導細胞發(fā)生凋亡。具體途徑是: DISC激活caspase-8后, caspase-8催化Bcl-2家族蛋白Bid(Bcl-2 inhibi-tory BH3-domain)降解生成截短的Bid( tBid), tBid導致線粒體釋放Cytochrome C與Apaf-1(Apoptosis p

17、rotease-activator factor-1)和dATP共同促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,進而活化效應蛋白caspase-3,最終導致細胞凋亡。31此外，死亡受體與配體結(jié)合后，促使磷脂酶C水解卵磷脂生成甘油二脂，甘油二脂使蛋白激酶C-6活化，蛋白激酶C-6能夠使磷脂爬行酶-3（Phospholipid scramblases 3 PLS 3 ）磷酸化，之后促進線粒體膜上磷脂的雙向運動，與Bid(Bcl-2家族蛋白)相互作用，導致細胞色素C的釋放，促使procaspase-9自身催化形成有活性的caspase-9,進而活化效應蛋caspase-3,最

18、終導致細胞凋亡。32線粒體相關(guān)的細胞凋亡信號途徑半胱天冬酶(caspase)相關(guān)的細胞凋亡途徑33正常細胞或腫瘤細胞抗TRAIL誘導凋亡的機制TRAIL最大的優(yōu)點是它可以選擇性誘導腫瘤細胞凋亡,但對正常細胞沒有毒副作用。雖然DR4和DR5在腫瘤細胞和正常細胞中的表達水平相當,但兩種細胞對TRAIL的敏感性確相差甚遠,這就不能合理解釋正常細胞存在TRAIL抗性的原因,直至人們發(fā)現(xiàn)了TRAIL的誘騙受體才解釋了其中部分原因。34 DcR1和DcR2廣泛的表達于人體各正常組織,但在變異細胞中低表達甚至不表達,它們與死亡受體競爭性結(jié)合TRAIL,由于沒有死亡結(jié)構(gòu)域或死亡結(jié)構(gòu)域不完全,胞外區(qū)雖然可以同T

19、RAIL特異性結(jié)合,但胞內(nèi)區(qū)不能通過DD同接頭蛋白結(jié)合激活caspase-8,不能通過caspase的級聯(lián)效應激活效應蛋白caspase-3,最終無法誘導細胞凋亡。腫瘤細胞由于缺乏誘騙受體的保護而易被TRAIL殺傷。35近年來許多研究顯示,除了誘騙受體對細胞的保護作用外,TRAIL還能通過激活Akt途徑核因子B(NFB)、蛋白激酶C(PKC)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成員等多種機制調(diào)節(jié)TRAIL的凋亡誘導活性。此外,死亡受體核苷酸的突變和OPG的競爭性作用也可能造成細胞對TRAIL的抗性。36TRAIL在腫瘤治療中的應用TRAIL因其對正常細胞沒有毒副作用的優(yōu)點，現(xiàn)已成為腫瘤治療研

20、究領(lǐng)域研究的熱點。TRAIL可以誘導近2/3的腫瘤細胞系發(fā)生凋亡，對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、腎臟腫瘤和白血病細胞等均有抑制細胞生長和細胞毒效應。37雖然TRAIL可以誘導多種腫瘤細胞凋亡，是一種較有前途的抗腫瘤藥物，但是，仍存在一些對TRAIL敏感性低的腫瘤細胞,在一定程度上限制了它的應用。近年來,人們在TRAIL與離子射線、抗真菌藥、化療藥、基因毒性藥和細胞因子的聯(lián)合治療方面做了大量研究，并取得了比較滿意的結(jié)果，使TRAIL在抗癌領(lǐng)域更加有效的發(fā)揮功能。研究發(fā)現(xiàn)，重組TRAIL與化療藥物順鉑共同使用時，二者的協(xié)同作用對卵巢癌細胞的誘導凋亡作用明顯強于兩者單獨使用。38雖然人們通過大量的研究已經(jīng)

21、對TRAIL有了比較深入的了解，但具體的信號轉(zhuǎn)導機制、基因調(diào)控、在健康或病體體內(nèi)的確切作用等許多方面仍不十分清楚。隨著對這種活性大分子的研究繼續(xù)深入, TRAIL可能將是一種具有廣闊臨床應用前景的抗癌藥物。39 腫瘤壞死因子與疾病 應用TNF在治療腫瘤等方面開始臨床期試驗，也可與IL-2治療腫瘤，目前認為全身用藥的療效不及局部用藥，后者如病灶內(nèi)注射，局部濃度高且副作用也較輕。近年來已采用TNF基因治療開始對黑素瘤等腫瘤進行臨床驗證。值得重視的是TNF又與臨床某些疾病的發(fā)生有關(guān)。 近來一些研究證實在動物實驗中一些胰腺外或其他器官(如肺臟)的炎癥及組織破壞的發(fā)展往往需要某些細胞因子受體的激活，表明

22、這些細胞因子可能參與了胰腺炎多器官功能衰竭的發(fā)生發(fā)展。例如：腫瘤壞死因子(TNF-)與急性胰腺炎及多器官功能衰竭的關(guān)系 40例如： 動物在注入TNF-后能復制出類似內(nèi)毒素休克時出現(xiàn)的高熱、心動過速、低血壓和基礎代謝率增高等癥狀。在動物實驗中直接注射TNF-可引起低血壓，代謝性酸中毒和血液濃縮，甚至數(shù)分鐘內(nèi)致實驗動物死亡。將重組TNF-注入大鼠體內(nèi)幾分鐘后發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)呼吸頻率加快，換氣過度，乳酸堆積，酸中毒，繼而血壓下降。當TNF-被拮抗后，胰腺及肺等胰腺外臟器的炎癥與損傷被控制，低血壓被阻止，生存率提高。以抗TNF-多克隆抗體對胰腺炎大鼠進行預處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)比對照組在血淀粉酶、血鈣離子、血細胞

23、比容、血糖等各個指標上都有明顯改善(P0.001)，從另一個方面證實了TNF-在急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。41 牛皮癬和銀屑病關(guān)節(jié)炎(PsA)：目前，腫瘤壞死因子抑制劑正處于用于牛皮癬和銀屑病關(guān)節(jié)炎的后期階段的臨床研究階段。該藥物種類將是銀屑病關(guān)節(jié)炎市場中增長的主要驅(qū)動力。對于牛皮癬市場，該研究認為如果象預料的那樣，使用抗腫瘤壞死因子治療劑能夠相當好地控制皮膚癥狀，這些藥物也將在患有銀屑病關(guān)節(jié)炎的患者亞群中獲得特定的立足點。 42 充血性心力衰竭：重要的臨床和臨床前證據(jù)證明，充血性心力衰竭與腫瘤壞死因子的生物活性的高水平有關(guān)。該研究認為抗腫瘤壞死因子藥物的開發(fā)者將會進一步考慮該種藥物用

24、于充血性心力衰竭。 膿毒癥：臨床試驗已適當?shù)刈C明腫瘤壞死因子在減少死亡率方面的確切的有益的作用。 43最新成果重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子 目前，世界上第一種重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子藥物已經(jīng)研制成功，改造后的這株腫瘤壞死因子與天然腫瘤壞死因子相比，毒性降低了90倍，對腫瘤細胞的殺傷活性提高100到1000倍，對腫瘤生長抑制率達到了60%以上 。這種藥物適用于聯(lián)合化療對實體瘤進行治療，無明顯副作用。經(jīng)過500多名腫瘤患者的臨床應用，這一基因工程藥物對胃癌、腸癌、腎癌、黑色素瘤、頭頸部腫瘤等惡性腫瘤的治療有效率達到27.86%，尤其對非小細胞肺癌的治療有效率達到50%。 44 腫瘤壞死因子的臨床研究感染性休克 ：目前認為革蘭氏陰性桿菌或腦膜炎球菌引起的彌漫性血管內(nèi)凝血、中毒性休克是由于細菌內(nèi)毒素刺激機體產(chǎn)生過量TNF-，引起發(fā)熱