微生物快速檢測(cè)技術(shù)與原理講解課件

1、華粵企業(yè)集團(tuán)有限公司 2成立于1991年，是目前中國最具規(guī)模的實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備供應(yīng)商之一。目前是全球70多個(gè)品牌在中國的總代理，分別涉及生物制藥、微生物、分子生物、生物細(xì)胞、IVF及實(shí)驗(yàn)室耗材等領(lǐng)域。345常規(guī)微生物項(xiàng)目：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、大腸桿菌、酵母總數(shù)、霉菌總數(shù)致病微生物項(xiàng)目：沙門氏菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、彎曲桿菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志賀氏菌、假單胞菌等微生物檢測(cè)的發(fā)展趨勢(shì)快速化自動(dòng)化標(biāo)準(zhǔn)化全程追溯市場(chǎng)銷售環(huán)節(jié)要求快速出貨，尤其是一些保質(zhì)期較短的產(chǎn)品。減少物流的壓力，盡可能減少庫存，加快資金周轉(zhuǎn)。節(jié)約人力資源成本對(duì)于運(yùn)行HACCP質(zhì)量保證體系的企業(yè)來說，

2、快速檢測(cè)方法非常重要。可以快速檢測(cè)原料及半成品的微生物狀況，以采取相應(yīng)的措施控制最終產(chǎn)品的微生物情況?？焖贆z測(cè)產(chǎn)品不少，但真正使用的企業(yè)不多。原因一：成本的原因。絕大多數(shù)快速檢測(cè)產(chǎn)品來自國外，成本相對(duì)偏高，而中國的人力成本相對(duì)便宜，對(duì)于檢測(cè)量小的企業(yè)，不會(huì)考慮快速檢測(cè)；而對(duì)于每天檢測(cè)量大的企業(yè)又擔(dān)心成本問題。原因二：技術(shù)的原因。雖然市面上有不少微生物快速檢測(cè)產(chǎn)品，但或多或少都有一定的技術(shù)局限性。一方面與樣品的加工工藝有關(guān)（譬如添加防腐劑等），另外一方面與檢測(cè)產(chǎn)品的技術(shù)原理等有關(guān)。美國EPIC、Celsis、Millipore、PALL英國DWS Rabit奧地利Sylab Bactrac 法國

3、 Bact/Alert 3D、Tempo美國Soleris， Biolumix 法國AES Chemunex Bactiflow、D-count、RDI 日本DoxATP法：EPIC、CelsisMPN法：Tempo膜過濾染色法： Millipore、PALL電化學(xué)法：DWS Rabit 、SyLab Bactrac 4300、 Dox顏色變化：Soleris、Biolumix、Bact/Alert 3D流式細(xì)胞技術(shù)： AES Chemunex Bactiflow、D-count激光掃描技術(shù)： AES Chemunex RDIATP （三磷酸腺苷）來源于細(xì)菌、酵母 、霉菌、生物膜組織殘留、人的

4、污染等用于食品、化妝品和藥品企業(yè)對(duì)生產(chǎn)線和管道進(jìn)行快速清潔程度檢測(cè)。改良后用于食品、化妝品的商業(yè)無菌檢測(cè)或終產(chǎn)品檢驗(yàn)。EPICCelsis優(yōu)點(diǎn)：通常用于進(jìn)行商業(yè)無菌檢測(cè)?？纱蟠罂s短庫存時(shí)間，減少物流壓力和成本。缺點(diǎn)：ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對(duì)儀器的清洗保養(yǎng)要求特別高。另外，客戶通常懷疑假陰性和假陽性的可能，特別是用ATP單個(gè)檢測(cè)代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測(cè)，其風(fēng)險(xiǎn)是一定存在的。(如保溫增菌時(shí)間不夠，菌數(shù)未達(dá)到一定數(shù)量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標(biāo)菌未大量增菌等原因)美國默克Millipore Milliflex Quantum 美國Pall公司的Pallchek可過濾樣品經(jīng)

5、膜過濾后，將菌截留在特殊的濾膜上，濾膜放置在培養(yǎng)基表面增菌后取出，加入熒光試劑，熒光染料在微生物體內(nèi)分解后積累，通過檢測(cè)熒光信號(hào)來到達(dá)計(jì)數(shù)的功能優(yōu)點(diǎn)：縮短培養(yǎng)時(shí)間，提高靈敏度，適合于菌數(shù)較低的可過濾產(chǎn)品使用。缺點(diǎn)：儀器較昂貴，運(yùn)行成本比較貴?；贛PN(最大近似值)原理，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)計(jì)數(shù)Tempo 將一定濃度的樣品稀釋液加入定量的專用培養(yǎng)基后，通過充填方式將樣品液充填至48孔測(cè)試卡后，經(jīng)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)（細(xì)菌總數(shù)測(cè)定要求37培養(yǎng)40h），根據(jù)各孔道內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，由讀卡站進(jìn)行熒光檢測(cè)，自動(dòng)讀取結(jié)果并換算出樣品中的目標(biāo)菌數(shù)值。優(yōu)點(diǎn)： 自動(dòng)動(dòng)化程度高一些。缺點(diǎn)：主要用于檢測(cè)菌落總數(shù) 耗材成本昂貴英國DWS

6、公司的Rabit奧地利Sylab公司的Bactrac4300日本的DOXBactrac4300DWS RabitDetection Time (DT)電導(dǎo)率單位對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期界限值IDT與樣品中的菌數(shù)的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系 校準(zhǔn)曲線表示菌數(shù)對(duì)數(shù)與IDT的關(guān)系校準(zhǔn)時(shí)，同時(shí)做電化學(xué)法和標(biāo)準(zhǔn)方法，將菌數(shù)與IDT填入表格中，自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并自動(dòng)計(jì)算相關(guān)系數(shù)及離散度。Log cfuA (DT) + b優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)成本低，檢測(cè)時(shí)間明顯縮短。 可用于微生物生長(zhǎng)曲線測(cè)定，微生物抑菌研究，防腐劑和消毒劑研究等領(lǐng)域。缺點(diǎn)：儀器較昂貴，定量檢測(cè)時(shí)需要校正曲線。目前只能檢測(cè)細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群和大腸桿菌方法的準(zhǔn)確性和檢測(cè)精度

7、值得考慮需要專用的電極盒，試劑相對(duì)也比較貴美國的Soleris、Biolumix法國的BacT/Alert 3DBiolumix微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)底部瓊脂層的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間。培養(yǎng)基內(nèi)含有顏色指示劑與阻抗法類似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。缺點(diǎn)：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。與阻抗法類似，可以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。缺點(diǎn)：需要購買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。BacT/Alert 3D 主要應(yīng)用在醫(yī)院臨床的血培養(yǎng)；以及藥品和食品等無菌產(chǎn)品的檢測(cè)基于微生物生成產(chǎn)生CO2的原理。CO2積累越多，底部的CO2傳感器顏色由藍(lán)綠色變淺，由L

8、ED發(fā)射一束光至底部，探頭檢測(cè)反射光的強(qiáng)度。光強(qiáng)度與微生物數(shù)量有一定關(guān)系。優(yōu)點(diǎn)：用于臨床血培養(yǎng)缺點(diǎn)：耗材太貴，而且含有對(duì)環(huán)境有害AsCO2丹麥Foss BactoScan FC法國AES chemunex Bactiflow 、D-count可用于非過濾產(chǎn)品流式計(jì)數(shù) : 線性流體 單細(xì)胞分析 靈敏的檢測(cè)頭對(duì)微生物進(jìn)行核酸染色，用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)FOSS BactoScan FC 優(yōu)點(diǎn)：速度快(50-150樣品/小時(shí))缺點(diǎn)：死活細(xì)胞一起檢測(cè)，消耗成本較高，儀器比較難保養(yǎng)，靈敏度不夠高適合牛奶企業(yè)檢測(cè)原奶中細(xì)菌總數(shù)Chemunex公司將流式細(xì)胞技術(shù)與活細(xì)胞熒光探針標(biāo)記及激光掃描技術(shù)相結(jié)合，推出

9、最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的D-count 和ScanRDI微生物快速檢測(cè)儀。其最大的特點(diǎn)是只檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)，速度比較快。EnzymeViability substrateFree fluorochromeMicro-organismDetectorDetectorLaserFlow Cell細(xì)胞標(biāo)記 細(xì)胞計(jì)數(shù) 直接單細(xì)胞標(biāo)記 細(xì)胞無增菌要求直接對(duì)活細(xì)胞和酵母、霉菌進(jìn)行標(biāo)記D-countChemScan RDI2. 標(biāo)記3. 激光掃描1. 過濾 1. 過濾2. 標(biāo)記3. 激光掃描樣品過濾預(yù)標(biāo)記60 min濾膜轉(zhuǎn)移ChemScanRDI 儀器分析標(biāo)記30 min優(yōu)點(diǎn)：速度非常

10、快，尤其是激光掃描技術(shù)缺點(diǎn)：耗材太貴、維護(hù)保養(yǎng)比較復(fù)雜 流式細(xì)胞技術(shù)需要復(fù)雜的前處理 激光掃描技術(shù)只適合于可過濾樣品流式細(xì)胞技術(shù)和激光掃描技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)顯色培養(yǎng)基法：技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。免疫學(xué)方法：產(chǎn)品最多，特異性和敏感性都很高，但有假陽性存在，陽性結(jié)果需要確認(rèn)。通常的原理有ELISA、熒光酶免、免疫磁分離等方法。市場(chǎng)上的產(chǎn)品多。分子生物學(xué)方法：以基因探針檢測(cè)法和PCR法為主。基因芯片：研究熱點(diǎn)。 顯色及熒光底物技術(shù)顯色及熒光底物: 由化學(xué)及合成技術(shù)獲得 特殊酶天然裂解相似結(jié)構(gòu)的分子 酶裂解時(shí)釋放發(fā)色及熒光混合物專一性酶活性，目視觀察底物結(jié)構(gòu)共價(jià)鍵 (糖苷的, 肽聚, 磷酸二氫聚 )由酶進(jìn)行專一

11、性識(shí)別糖類脂類蛋白胨色 原底 物 結(jié) 構(gòu)共價(jià)鍵結(jié)合專一酶糖類脂類蛋白胨色原非裂解底物:不顯色 糖類脂類蛋白胨色源 游離或二聚物可顯色ALOA 原理:Beta-glucosidase activityBlue colonies-葡萄糖苷酶活性，藍(lán)色Phospholipase activityOpaque halo 磷酸酶活性，混濁暈Listeria spp.Listeria monocytogenes免疫磁分離法+定量PCRMatrix公司的免疫純化系統(tǒng)ELISA方法3M Tecra 公司的免疫捕獲快速檢測(cè)(略)GLISA-膠體金免疫層析致病菌快速檢測(cè)條(略)熒光酶免Vidas系列產(chǎn)品(略)Pa

12、thatrixAuto免疫純化15分鐘定量PCR快速確認(rèn)1hr基因探針法及PCR方法在國外已經(jīng)有相當(dāng)成熟的表現(xiàn)。有普通PCR，熒光PCR，實(shí)時(shí)熒光PCR（定量PCR）等多種方法?；蛱结樂ㄒ话阋残枰鼍缓蠹犹结樤噭╇s交，然后在熒光顯微鏡或熒光檢測(cè)器下獲得結(jié)果。PCR方法一般不需增菌太長(zhǎng)時(shí)間，通過PCR方法對(duì)待測(cè)微生物的特征片斷進(jìn)行擴(kuò)增，然后通過凝膠電泳或熒光PCR技術(shù)判斷結(jié)果。試劑盒開發(fā)相對(duì)比較容易，只要找出特征的基因片斷，合成出引物即可。目前客戶比較關(guān)注的致病菌，包括沙門氏、李斯特氏、大腸桿菌O157、副溶血弧菌、霍亂弧菌、志賀氏菌等均有PCR試劑盒供應(yīng)。BAXGene-trakGen-probeVe