葉綠體色素的提取分離及理化性質(zhì)鑒定課件

1、葉綠體色素的提取、分離、理化性質(zhì)鑒定及含量測(cè)定 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模悍治鲂@中兩種植物材料葉綠體色素的差異內(nèi)容：葉綠素a和b含量差異；綠色素與黃色素的含量差異色素提取分離的原理;葉綠素測(cè)定的方法及其原理； 綠色素與黃色素的純化原理及步驟；葉綠素的理化性質(zhì)的鑒定方法實(shí)驗(yàn)原理 Photosynthesis Thermosynechococcus elongatus(藍(lán)細(xì)菌)PS IPS II光合色素的脂溶性- 酒精、丙酮等有機(jī)溶劑提取Chl是雙羧酸的酯-皂化反應(yīng)-葉綠素與類胡蘿卜素分離Chl的取代反應(yīng)：卟啉環(huán)中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn 2+取代光學(xué)特性： Chla Chlb有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰-含量測(cè)

2、定時(shí)選擇葉綠素特有的紅光吸收峰波長(zhǎng)；第二單線態(tài)10-12 S第一單線態(tài)10-9 S基態(tài)能量三線態(tài)10-310-2 S分子內(nèi)能量傳遞傳向反應(yīng)中心吸收430nm光吸收670nm光680nm熒光熱能熱能熱能磷光Chl的熒光和磷光現(xiàn)象-反射光中能觀察到呈紅色的熒光；葉綠素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，光容易受強(qiáng)光的破壞葉綠體色素的分離方法 紙層析方法：根據(jù)色素在不同有機(jī)溶劑中的溶解度不同以及在吸附劑上的吸附能力不同，可將它們彼此分離開。 （定性，小量）（今天選擇做）皂化反應(yīng)和萃取分離方法（大量，定量）葉綠素a和b含量的測(cè)定方法分光光度法根據(jù)Lambert-Beer定律 ： OD1=Caka1+Cbkb1 （1） O

3、D2=Caka2+Cbkb2 （2） Ca=12.7 OD663-2.69 OD645 （3） Cb=22.9 OD645-4.68 OD663 （4） CT= Ca+ Cb=8.02 OD663+20.21 OD645 （5） Ck=4.7OD440- 0.27Ca+b葉綠體色素的理化性質(zhì)（1）葉綠素與類胡蘿卜素都有一定的吸收光譜，可用分光鏡檢查或用分光光度計(jì)精確測(cè)定；（2）葉綠素在光照下可產(chǎn)生暗紅色的熒光；（3）葉綠素的化學(xué)性質(zhì)很不穩(wěn)定，易受強(qiáng)光破壞； （今天選擇做）（4）葉綠素中的鎂可被H+取代而成褐色的去鎂葉綠素；加入銅鹽作用，后者則成為綠色的銅代葉綠素。 實(shí)驗(yàn)材料和器材實(shí)驗(yàn)材料：（兩

4、組組合，每組做一種植物材料，最后兩組結(jié)果放在一起分析）器材：721型分光光度計(jì)、電子天平、量筒、研缽、剪刀、漏斗、濾紙、移液管（1mL）、試管及試管架、洗耳球、酒精燈等。 試劑：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%鹽酸、碳酸鈣、石英砂等實(shí)驗(yàn)步驟鮮葉4 g，加丙酮10 ml及少許碳酸鈣和石英砂，勻漿，以漏斗過(guò)濾之再加丙酮20 ml洗并過(guò)濾，即為色素提取液。放于暗處備用。用于綠色素與黃色素的分離取20 ml取3 ml于另一試管中1滴1滴加濃鹽酸，直至溶液出現(xiàn)褐綠色 加醋酸銅晶體少許，慢慢加熱溶液，則又產(chǎn)生鮮亮的綠色 分別觀察在反射光和透射光一側(cè)，提取液的顏色有無(wú)不同 ；觀察色素溶液的吸收光譜 取少許于另

5、一試管中23415實(shí)驗(yàn)步驟取20 ml色素提取液加到盛有20 ml乙醚的分液漏斗中，搖動(dòng)綠色素與黃色素的分離沿漏斗邊緣加入30 ml蒸餾水，輕輕搖動(dòng)分液漏斗，靜止10分鐘，溶液即分為兩層。棄去下層水相；再用蒸餾水沖洗乙醚溶液1次，棄去下層水相。加入8ml 30KOH甲醇過(guò)飽和溶液，用力搖動(dòng)分液漏斗5分鐘以上，皂化要徹底，直至顏色變?yōu)樽睾稚?靜置約10min 加蒸餾水約10ml，搖動(dòng)后靜置分離，則得到黃色素層和綠色素層 分別收集并保存于試管中 5 觀察色素溶液的吸收光譜 (1)調(diào)節(jié)分光計(jì)，觀察電燈光的光譜；(2)觀察色素丙酮提取液，用丙酮將溶液稀釋1倍比較之；(3)觀察黃色素乙醚溶液，用乙醚將溶

6、液稀釋1倍比較之；(4)觀察皂化葉綠素甲醇溶液，用甲醇將溶液稀釋1倍比較之； （今天選擇做）(5)觀察銅代葉綠素溶液。 （今天選擇做）實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟葉綠素a和b的測(cè)定鮮葉0.5 g，加丙酮5 ml及少許碳酸鈣和石英砂，勻漿，將勻漿轉(zhuǎn)入量筒中，并用適量80%丙酮洗滌研缽，用80%丙酮定容至10ml 吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，過(guò)濾，濾液備用取上述色素提取液4ml，以80%丙酮為對(duì)照，分別測(cè)定663nm、645nm和 440nm處的光密度值。 按公式（3）、（4）、（5）分別計(jì)算色素提取液中葉綠素a、葉綠素b、及葉綠素a+b的濃度，類胡蘿卜素濃度。再根據(jù)稀釋倍數(shù)分別計(jì)算每g鮮重葉片中色素的含量。 注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中注意安全，石油醚、丙酮等試劑要遠(yuǎn)離火源。尤其注意做銅代反應(yīng)時(shí)避免傷人。研磨過(guò)程中丙酮要少量多次加入，以免研磨時(shí)四處飛濺。葉綠素要避光保存。實(shí)驗(yàn)作業(yè) 1