第十六章抗生素類藥物的分析

1、第十六章抗生素類藥物的分析 定義： 抗生素是生物（動(dòng)物、植物和微生物）在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的（或并用化學(xué)、生物或生化方法衍生的），在低微濃度下有選擇性地抑制或影響它種生物機(jī)能的化學(xué)物質(zhì)的總稱。來(lái)源： 生物合成（發(fā)酵） 化學(xué)合成或半合成第一節(jié) 概 述 一、特點(diǎn)1. 化學(xué)純度低：同系物多、異構(gòu)體多、降解產(chǎn)物多2. 活性組分易變異：菌株變化、發(fā)酵條件改變3. 穩(wěn)定性差（本身分子結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易分解，使療效降低或失效甚至產(chǎn)生毒副作用）二.分類 內(nèi)酰胺類(青霉素類、頭孢菌素類) 氨基糖苷類(鏈霉素、慶大霉素、依替米星) 四環(huán)素類(四環(huán)素、金霉素、土霉素) 大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素、螺旋霉素、麥迪霉素) 多烯大環(huán)類

2、(制霉菌素、兩性霉素B) 多肽類(多黏菌素、放線菌素) 酰胺醇類抗生素（氯霉素） 抗腫瘤抗生素（有絲裂霉素、鹽酸多柔比星） 其它抗生素：鹽酸克林霉素、鹽酸林可霉素等。1. 根據(jù)產(chǎn)生抗生素的生物來(lái)源分類2. 根據(jù)抗生素的作用對(duì)象分類3. 根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類4. 根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類（一）鑒別1. 理化方法（1）官能團(tuán)顯色反應(yīng)（2）光譜法 （3）色譜法2. 生物學(xué)法三、抗生素的質(zhì)量分析1.影響藥物穩(wěn)定性的項(xiàng)目 酸堿度、水分等。2 影響藥物純度的項(xiàng)目 溶液澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘?jiān)⒅亟饘?、吸光度等?3. 與臨床安全性密卻相關(guān)的項(xiàng)目：異常毒性、熱原或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、

3、無(wú)菌等。4. 其它 ：如注射用普魯卡因青霉素還規(guī)定了懸浮時(shí)間與抽針試驗(yàn)等。（二）檢查青霉素鈉 Ch.P.（2010） 結(jié)晶性 酸堿度 溶液的澄清度與顏色 吸光度 有關(guān)物質(zhì) 青霉素聚合物 干燥失重 可見(jiàn)異物 不溶性微粒 細(xì)菌內(nèi)毒素 無(wú)菌（三）含量測(cè)定方法1. 抗生素微生物檢定法 藥典附錄測(cè)定抗生素抑菌或殺菌的能力優(yōu)點(diǎn)與臨床要求一致靈敏度高、用量少適用范圍廣，可用于未知藥物缺點(diǎn)操作繁瑣、測(cè)定時(shí)間長(zhǎng)、測(cè)定誤差大2. 理化方法以理化方法測(cè)定抗生素的效價(jià)適用于純度較高的結(jié)構(gòu)確定的抗生素優(yōu)點(diǎn)1. 準(zhǔn)確度高2. 簡(jiǎn)單、快速不一定代表生物效價(jià)易受雜質(zhì)干擾缺點(diǎn)3. 抗生素活性表示方法以效價(jià)表示，即指每毫升或每毫

4、克中含有抗生素的有效成分的多少。磺芐西林鈉 Ch.P.（2010）【含量測(cè)定】 精密稱取本品適量，用滅菌水制成每1ml中約含1000單位的溶液，照抗生素微生物檢定法（附錄 A）測(cè)定。1000磺芐西林單位相當(dāng)于1mg的C16H18N2O7S2。 第二節(jié) -內(nèi)酰胺類抗生素 主要藥物： 青霉素類 頭孢菌素類青霉素類頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán) -內(nèi)酰胺環(huán)青霉素類6-氨基青霉烷酸（6APA）*手性C酸性不穩(wěn)定酰胺側(cè)鏈青霉素（芐青霉素） 包括青霉素鉀、青霉素鈉、普魯卡因青霉素。氨芐西林（氨芐青霉素）.阿莫西林（羥氨芐青霉素）.磺芐西林鈉（磺芐青霉素鈉）頭孢菌素類7-氨基頭孢菌烷酸（7ACA）*手性C酸

5、性酰胺側(cè)鏈不穩(wěn)定UV頭孢氨芐.頭孢羥氨芐頭孢拉定頭孢噻吩鈉一、性質(zhì)1. 酸性 游離羧基酸性，易與堿成鹽。2. 旋光性 - 手性碳3. 紫外吸收特性 青霉素母核無(wú)吸收，但通常其側(cè)鏈有吸收；頭孢菌素母核O=C-N-C= C，在260nm處強(qiáng)吸收。214. 穩(wěn)定性 -內(nèi)酰胺環(huán)為四元環(huán)，張力大，且酰胺鍵易水解，不穩(wěn)定。 穩(wěn)定性與含水量和純度相關(guān)。 在水溶液中，易受酸、堿、酶、金屬離子或氧化劑的影響，發(fā)生水解和分子重排。23溫度氧化劑（頭孢噻吩鈉水溶液2524h失活8%）（青霉素鈉水溶液30 24h失活56%）Cu2+、Pb2+、Hg2+、Ag+24不同pH條件下青霉素鈉降解情況24半衰期(h) 2 3

6、 4 5 6 7 8 9 10 11pH青霉素的降解反應(yīng)青霉素青霉噻唑酸H2O/OH青霉素酶青霉酸pH2100青霉噻唑酰基羥胺酸NH2OH青霉烯酸pH4青霉胺CO2青霉醛HgCl2二、鑒別 本類藥物的鑒別試驗(yàn)，國(guó)內(nèi)外藥典中主要采用的方法為IR、HPLC、TLC法。（一）色譜法1. TLC 與對(duì)照品比較Rf值與斑點(diǎn)顏色2. HPLC 與對(duì)照品比較tR值（二）光譜法1. IR法特征官能團(tuán)：酰胺-內(nèi)酰胺2. UV法青霉素鈉1. 羥肟酸鐵反應(yīng) 內(nèi)酰胺OH-呈色Fe3+H+（三）呈色反應(yīng)頭孢哌酮 Ch.P.（2010）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水2ml與鹽酸羥胺溶液3ml，振搖溶解后，放置5分鐘

7、，加酸性硫酸鐵銨試液1ml，搖勻，顯紅棕色。2. 茚三酮反應(yīng)注射用頭孢拉定 Ch.P.（2010）TLC鑒別顯色劑: 茚三酮3. 三氯化鐵反應(yīng) 酚羥基 偶合呈色三氯化鐵 頭孢羥氨芐 Ch.P.（2010）【鑒別】（1）取本品適量，加水適量超聲使溶解并稀釋制成每1ml中約含的溶液，取溶液1ml，加三氯化鐵試液3滴，即顯棕黃色。4. 各種鹽的反應(yīng) 焰色鮮黃色 + 醋酸氧鈾鋅黃 Na+ 焰色紫色 + 0.1%四苯硼鈉 + Ac白 K+K+、Na+反應(yīng)（一）聚合物 1. 定義 高分子雜質(zhì)指抗生素藥品中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱。分子量一般在10005000道爾頓，個(gè)別可至10000道爾頓。 分為內(nèi)

8、源性和外源性雜質(zhì)。三、檢查34例 青霉素鈉 【檢查】青霉素聚合物 青霉素鉀【檢查】青霉素聚合物 阿莫西林 【檢查】阿莫西林聚合物（青霉噻唑蛋白 + 青霉素、青霉噻唑多肽類） 頭孢他啶 【檢查】頭孢他啶聚合物 頭孢曲松鈉 【檢查】頭孢曲松聚合物 頭孢哌酮鈉 【檢查】頭孢哌酮聚合物外源性雜質(zhì)：包括蛋白、多肽、多糖類雜質(zhì)或其與抗生素的結(jié)合物。主要來(lái)于自發(fā)酵工藝。內(nèi)源性雜質(zhì)：自身聚合物。生產(chǎn)或貯藏過(guò)程中產(chǎn)生。 2. 來(lái)源3. 高分子雜質(zhì)的分類 （1）青霉噻唑蛋白和青霉噻唑多肽 （2）青霉素聚合物 （3）頭孢菌素聚合物 364. 分析方法 反相色譜法 離子交換色譜法 凝膠色譜法（分子排阻色譜法）聚合物檢

9、查方法： 多用分子排阻色譜法。即根據(jù)分子量差異進(jìn)行分離的凝膠色譜法。 凝膠色譜具有分子篩的作用，讓藥物分子自由的進(jìn)入凝膠顆粒表面，而高分子雜質(zhì)被排阻，不能進(jìn)入顆粒內(nèi)部；色譜過(guò)程中凝膠對(duì)藥物的吸附作用大于對(duì)高分子雜質(zhì)的吸附作用，可使高分子雜質(zhì)與藥物分離。3839高分子雜質(zhì)定量測(cè)定法： 1. 主成分自身對(duì)照法 2. 面積歸一化法3. 限量法4. 自身對(duì)照外標(biāo)法 -內(nèi)酰胺類抗生素的高分子雜質(zhì)具有高度的不均一性和不確定性，故無(wú)法制備對(duì)照品，不能采用對(duì)照品法定量。 在以水，0.01%SDS或0.5%葡萄糖溶液作為流動(dòng)相時(shí)，-內(nèi)酰胺類抗生素可締合形成表觀分子量較大的締合物，該締合物在Sephadex G

10、10 凝膠色譜系統(tǒng)中的色譜行為與高分子雜質(zhì)一樣，表現(xiàn)為單一的色譜峰。利用這一特點(diǎn)，在Sephadex G 10 凝膠色譜系統(tǒng)中制定了新的定量方法-自身對(duì)照外標(biāo)法。41例1 青霉素鈉 Ch.P.（2010） 【檢查】青霉素聚合物 照分子排阻色譜法（附錄 H）測(cè)定。 填充劑 葡聚糖凝膠G-10（40120m） 流動(dòng)相磷酸鹽緩沖液（） 2HPO42PO4（61:39) 流動(dòng)相B 水 流速 波長(zhǎng) 254nm n700（按藍(lán)色葡聚糖2000計(jì)） 雜質(zhì)限量0.08% 頭孢呋辛酯 - HPLC 異構(gòu)體 規(guī)定峰面積大小比值有關(guān)物質(zhì) 主成分自身對(duì)照法（二）異構(gòu)體和有關(guān)物質(zhì)（三）2-乙基己酸 -內(nèi)酰胺環(huán)制備過(guò)程中

11、，采用游離酸與2-乙基己酸鈉作用生成鈉鹽，并在2-乙基己酸中直接析出鈉鹽結(jié)晶，易殘留2-乙基己酸。檢查方法：GC（雜質(zhì)對(duì)照品法） 頭孢哌酮鈉 Ch.P.（2010）【檢查】吸光度 取本品約1g精密稱定，置10ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（附錄 A），在430nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，不得大于。（四）吸光度（五）有機(jī)溶劑 部分藥物需檢查有機(jī)溶劑。（六）結(jié)晶性 固態(tài)物質(zhì)分為結(jié)晶質(zhì)和非結(jié)晶質(zhì)兩大類，可用下列方法檢查物質(zhì)的結(jié)晶性。（1）偏光顯微鏡法； （2）X射線粉末衍射法。（七）水分 影響穩(wěn)定性的重要因素。（八）其他特殊雜質(zhì)頭孢克洛含量測(cè)定 Ch.P.（2010）【含

12、量測(cè)定】填充劑 十八烷基硅烷鍵合硅膠流動(dòng)相 磷酸二氫鉀溶液乙腈（928） （pH3.4)對(duì)照品 頭孢克洛（含頭孢克洛-3-異構(gòu)體） 兩者分離度應(yīng)大于四、含量測(cè)定（一）高效液相色譜法（二）碘量法原理： 內(nèi)酰胺類不直接與碘反應(yīng)； 內(nèi)酰胺類水解產(chǎn)物可與碘發(fā)生定量反應(yīng)。反應(yīng)分兩步進(jìn)行：應(yīng)：嚴(yán)格控制反應(yīng)條件 采用標(biāo)準(zhǔn)品平行操作 （2）氧化-還原反應(yīng)（無(wú)固定量關(guān)系，易受溫度、pH值和時(shí)間等因素影響）（1）水解反應(yīng)（按化學(xué)計(jì)量進(jìn)行） 青霉素中本身含有降解雜質(zhì)，或樣品中含其它雜質(zhì)，可能消耗碘，碘揮發(fā)也帶來(lái)?yè)p失。 以未經(jīng)水解的樣品做空白。方法：供試液+緩沖液+碘液+回滴（空白）+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴對(duì)照液

13、+緩沖液+碘液+回滴（空白）+堿+酸+緩沖液+碘液+回滴 要求做空白及應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照平行測(cè)定測(cè)定條件（1）必須堿性水解完全后才能測(cè)定（2）該法用不加堿水解的樣品作空白，可消除降解產(chǎn)物及其他耗碘雜質(zhì)的干擾（3）1mol樣品消耗4mol I2，靈敏度高（4）碘與青霉噻唑酸作用以，溫度在2426為好（5）采用對(duì)照品平行測(cè)定 （三）汞量法水解水解青霉胺絡(luò)汞1. 原理 青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，但其堿水解產(chǎn)物青霉噻唑酸及繼續(xù)水解產(chǎn)物青霉胺都可與汞鹽定量反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量可計(jì)算青霉素的含量 2. 測(cè)定方法（1）樣品測(cè)定（2）降解物測(cè)定 3. 測(cè)定條件（1）第二次突躍為終點(diǎn)，反應(yīng)摩爾比11（2）水解必須完全

14、（3）該法用不加堿水解的樣品作空白，可消除降解產(chǎn)物的干擾（4）本法的優(yōu)點(diǎn)是不需要對(duì)照品對(duì)照 （四）硫醇汞鹽法325-345nm處最大吸收（咪唑）（五）酸堿滴定法過(guò)量的NaOH以鹽酸滴定酸堿滴定法（水解后剩余滴定法） 1. 原理 青霉素或頭孢菌素可被堿水解，并且堿性水解定量完成。 2. 測(cè)定條件（1）所用的水必須是新沸的，臨用時(shí)用氫氧化鈉液調(diào)至pH8（2）測(cè)定中避免吸收空氣中的二氧化碳 60第二節(jié) 氨基糖苷類抗生素一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1. 化學(xué)結(jié)構(gòu)堿性環(huán)己多元醇61鏈霉素streptomycin（堿性環(huán)己多元醇）鏈霉胍鏈霉糖N-甲基葡萄糖胺（氨基糖）鏈霉雙糖胺慶大霉素gentamycin（復(fù)合物）

15、（氨基糖）絳紅糖胺（氨基糖）加洛糖胺脫氧鏈霉胺（堿性環(huán)己多元醇）慶大霉素C復(fù)合物 慶大霉素C1 R1、R2=CH3 R3=H 慶大霉素C2 R1=CH3 R2=R3=H 慶大霉素C1a R1、R2、R3=H 慶大霉素C2a R1= R2=H R3=CH365巴龍霉素paromomycin（堿性環(huán)己多元醇）脫氧鏈霉胺D-核糖D-葡萄糖胺（氨基糖）巴龍霉糖（氨基糖）巴龍胺巴龍二糖胺66奈替米星netilmicin脫氧鏈霉胺（堿性環(huán)己多元醇）（氨基糖）絳紅糖胺（氨基糖）加洛糖胺672. 性質(zhì)（1）溶解性與堿性溶解性 水溶性（多-OH）堿性 -NH2 可與酸成鹽 臨床上多用硫酸鹽68（2）旋光性 手性

16、C硫酸慶大霉素硫酸巴龍霉素硫酸卡那霉素50mg/ml水溶液69（3）穩(wěn)定性鏈霉素穩(wěn)定OH-葡萄糖胺鏈霉糖OH-麥芽酚反應(yīng)坂口反應(yīng)坂口反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)71鏈霉素（4）UV鏈霉素max=230nm72（一）茚三酮反應(yīng) -氨基醇、羥基胺類藍(lán)紫色二、鑒別試驗(yàn)茚三酮-氨基、伯胺某些羥基胺類酮式烯醇式+縮合74例 硫酸小諾霉素 Ch.P.（2010） 【鑒別】（1）取本品約5mg，加水溶解后，加0.1%茚三酮的水飽和正丁醇溶液1ml與吡啶ml，在水浴中加熱5分鐘，即顯藍(lán)紫色。75（二） Molisch反應(yīng)水解或蒽酮761. -萘酚呈色原理2. 蒽酮呈色原理例 阿米卡星 Ch.P.（2010）【鑒別】（1）取

17、本品約10mg，加水1ml溶解后，加0.1%蒽酮的硫酸溶液4ml，即顯藍(lán)紫色。78（三） N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對(duì)二甲氨基苯甲醛H+櫻桃紅色（Elson-Morgan反應(yīng)）水解對(duì)二甲氨基苯甲醛H+Elson- Morgan反應(yīng)OH- (縮合)乙酰丙酮例 硫酸新霉素 Ch.P.（2010）【鑒別】（1）取本品約10mg，加水1ml溶解后，加鹽酸溶液（9100）2ml，在水浴中加熱10分鐘，加8%氫氧化鈉溶液2ml與2%乙酰丙酮水溶液1ml，置水浴中加熱5分鐘，冷卻后，加對(duì)二甲氨基苯甲醛試液1ml，即顯櫻桃紅色。（四）麥芽酚（Maltol）反應(yīng)鏈霉素特征反應(yīng)H+紫紅色82Ma

18、ltol反應(yīng)H+ Fe3+分子重排麥芽酚83例 硫酸鏈霉素 Ch.P.（2010） 【鑒別】（2）取本品約20mg，加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液，置水浴上加熱5分鐘，加硫酸鐵銨溶液（取硫酸鐵銨，加硫酸溶液5ml使溶解） ，即顯紫紅色。84（五）坂口（Sakaguchi）反應(yīng)鏈霉胍特有反應(yīng)水解橙紅色次溴酸鈉8-羥基喹啉（或- 萘酚）85Sakaguchi反應(yīng)+例 硫酸鏈霉素 Ch.P.（2010） 【鑒別】（1）取本品約，加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至約15，加次溴酸鈉試液3滴，即顯橙紅色。（七）色譜法TLC、HPLC法（八）光譜法 IR 、U

19、V法（六）硫酸鹽反應(yīng) 多為硫酸鹽，顯硫酸鹽的鑒別反應(yīng)。 見(jiàn)Ch.P. （ 2010 ）附錄。例 慶大霉素 BP（2010） 取硫酸慶大霉素10mg，加水1ml和40%的硫酸溶液5ml，在水浴中加熱100分鐘，冷卻，用水稀釋至25ml。取該溶液進(jìn)行紫外掃描，在240-330nm范圍應(yīng)無(wú)最大吸收。三、有關(guān)物質(zhì)及組分分析（一）有關(guān)物質(zhì)（二）硫酸鹽測(cè)定 EDTA測(cè)定法或HPLC法（三）組分測(cè)定90慶大霉素C1 、C2 、C1a*對(duì)微生物的活性無(wú)明顯差異*毒副作用和耐藥性不同發(fā)酵菌種不同工藝差別C組分比例不一致規(guī)定各組分的相對(duì)百分含量Ch.P.、BPUSPHPLC法慶大霉素C組分測(cè)定C1 25%-50%

20、C1a 15%-40%C2a + C2 20%-50% 要求：方法：HPLC慶大霉素本身無(wú)紫外吸收，可衍生化max = 330nmpH10.4巰基醋酸HPLC（紫外檢測(cè)） USP(29)、Ch.P(2000)93942. 離子對(duì)HPLC法（電化學(xué)檢測(cè)器） BP（2005）3. HPLC法（蒸發(fā)光散射檢測(cè)器） Ch.P.（2010）硫酸慶大霉素 Ch.P.（2010）【檢查】慶大霉素C組分 照高效液相色譜法（附錄 D）測(cè)定。填充劑 十八烷基硅烷鍵合硅膠(pH0.88.0)流動(dòng)相 三氟醋酸-甲醇（92:8）檢測(cè)器 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器標(biāo)準(zhǔn)品 慶大霉素、小諾霉素 小諾霉素與慶大霉素各組分峰應(yīng)滿足分離度要

21、求。96硫酸慶大霉素C組分的HPLC-ELSD色譜圖慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品（A）及其樣品（B）的HPLC-ELSD色譜圖 1-硫酸鹽；2-慶大霉素C1a；3-慶大霉素C2；4 慶大霉素C2b；5-慶大霉素C2a；6-慶大霉素C1 ；7-未知雜質(zhì) AB 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light-scattering Detector）是質(zhì)量型檢測(cè)器，只與待測(cè)物質(zhì)的量相關(guān)，無(wú)所謂其光學(xué)性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)。因此對(duì)于許多沒(méi)有光學(xué)吸收特征的生物性物質(zhì)的檢測(cè)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器提供了新一代的檢測(cè)方法。 三、含量測(cè)定 主要用微生物檢定法。部分藥物采用HPLC法。 例 硫酸鏈霉素 Ch.P.（2010）【含量

22、測(cè)定】精密稱取本品適量，加滅菌水定量制成每1ml中約含1000單位的溶液，照抗生素微生物檢定法（附錄 A）測(cè)定， 1000鏈霉素單位相當(dāng)于1mgC21H38N7O12。第四節(jié) 四環(huán)素類抗生素一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)（一）化學(xué)結(jié)構(gòu)ABCD432156789101112碳原子編號(hào)四環(huán)素（TC）tetracycline102金霉素 （CTC）chlortetracycline氯四環(huán)素103土霉素 （OTC）oxytetracycline氧四環(huán)素104多西環(huán)素 （DOTC）doxycycline強(qiáng)力霉素脫氧土霉素105美他環(huán)素（METC） metacycline106兩性弱酸性、UV、旋光性弱堿性二甲胺基

23、弱堿性酚羥基、烯醇型羥基 弱酸性1. 酸堿性（二）性質(zhì) 兩性溶解性2. 旋光性 手性C3. UV 共軛體系4. 與金屬離子生成有色配位化合物酚羥基、烯醇基Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+109有強(qiáng)烈熒光110（1）差向異構(gòu)化5. 不穩(wěn)定性 111土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化112（2）降解性質(zhì)A. 酸性降解113114pH2pH2115B. 堿性降解（熒光）二、鑒別（一）HPLC法例 鹽酸土霉素 Ch.P.（2010）【鑒別】 （2）在含量測(cè)定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時(shí)間應(yīng)與對(duì)照品溶液主峰的保留時(shí)間一致（二）TLC法固定相：硅藻土 EDTA：克服痕量金屬離子存在引起 的

24、拖尾現(xiàn)象。黏合劑： EDTA+甘油流動(dòng)相：含EDTA 例 鹽酸土霉素 Ch.P.（2010）【鑒別】（2）取本品與土霉素對(duì)照品，分別加甲醇制成每1ml中含1mg的溶液；另取土霉素與鹽酸四環(huán)素對(duì)照品，加甲醇制成每1ml中各含1mg的混合溶液，照薄層色譜法（附錄 B）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各1l，分別點(diǎn)于同一薄層板上，取4%乙二胺四醋酸二鈉溶液（）5ml，加至乙酸乙酯-三氯甲烷-丙酮（2:2:1）200ml中為展開(kāi)劑，展開(kāi)后，晾干，用氨蒸氣熏后，置紫外光燈（365nm）下檢視，混合溶液應(yīng)顯示2個(gè)完全分離的斑點(diǎn)，供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度及位置應(yīng)與相應(yīng)的對(duì)照品溶液的主斑點(diǎn)相同。（三）IR 法（四

25、）UV 法（五）化學(xué)鑒別法1. H2SO4反應(yīng)例 鹽酸金霉素 Ch.P.（2010）【鑒別】（1）取本品約，加硫酸2ml即顯藍(lán)色，漸變?yōu)殚蠙炀G色，加水1ml后，顯金黃色或棕黃色。2. 三氯化鐵反應(yīng)酚羥基與三氯化鐵反應(yīng)。例 鹽酸四環(huán)素 Ch.P.（2010）【鑒別】（1）取本品約，加硫酸2ml，即顯深紫色，再加三氯化鐵試液1滴，溶液變?yōu)榧t棕色。 三、檢查（一）鹽酸四環(huán)素中有關(guān)物質(zhì) 4-差向四環(huán)素 脫水四環(huán)素 差向脫水四環(huán)素 土霉素 鹽酸金霉素檢查方法：HPLC （加校正因子的主成份自身對(duì)照法）例 鹽酸四環(huán)素 Ch.P.（2010）【檢查】有關(guān)物質(zhì) 取本品適量，加/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含的溶液，作為供試品溶液；精密量取2ml，置100ml量瓶中， 加鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照溶液。照含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件，取對(duì)照溶液10l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%。精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各10l，分別注入液相色譜儀。記錄色譜圖至主成份保留