二代測序(NGS)實驗方案和應(yīng)用

1、這里為您介紹二代測序的相干流程和利用.之楊若古蘭創(chuàng)作隨著人類基因組工程的完成，對于低花費的測序技術(shù)的需求促進(jìn)了高通量二代測序技術(shù)的發(fā)展.這些新的測序平臺答應(yīng)進(jìn)行高通量測序，具有廣泛的利用：全基因組從頭測序或者重測序目標(biāo)序列重測序轉(zhuǎn)錄組分析微生物組研討基因調(diào)控研討NGS 序列二代測序儀器有很多種組合，在通量、片段長度、精確度、每一輪測序成本、每百萬堿基對測序成本、初始成本、規(guī)格和技術(shù)方面存在存在差別 .從規(guī)格和初始成本的角度而言，二代測序儀器可輕松地分類為更窄的范圍，也就是所謂的“臺式測序儀”和高通量儀器 .臺式測序儀使得任何實驗室都可以像使用real-time PCR樣，本人進(jìn)行測序.這些儀器

2、可以和一些靶標(biāo)序列富集技術(shù)相結(jié)合，用在一些臨床的利用中，其中：選定的靶標(biāo)基因用于深度分析，以檢測罕見的突變，或者檢測多樣樣本中（比方癌癥樣本）中的突變. 目前，這些儀器的通量在10Mb 到 7.5 Gb 之間，但是隨著硬件，軟件和試劑的持續(xù)改善，通量也在穩(wěn)步添加 .高通量測序儀非常適合于大量的，基因組范圍的研討，每次測序能測定600 Gb 的序列.一些如許的高通量和高精度的平臺，能測定的片段長度絕對較短，這對于高反復(fù)性的序列和未知基因組的從頭測序就可能成為成績.與此相反，也有一些儀器能測序的片段較長（達(dá)到2500 bp）,但是其精度和測序能力（90 Mb）要低很多.還有一些測序能力位于兩 者之

3、間的儀器（ 800 bp ， 700 Mb） .是以，利用決定了哪一種儀器是最合適的 .有一種新的方法被稱作“納米孔測序” . 這類技術(shù)中，根據(jù)一個 DNA 鏈通過一個合成的或者蛋白納米孔道所惹起的電流的改變，可以確定通過這個孔道的堿基.這理論上可以僅用一步就測序一個完好的染色體，而不須要生成新的 DNA 鏈.DNA 測序二代 DNA 測序的工作流程如下：DNA 樣本制備文庫構(gòu)建和驗證文庫分子大規(guī)模平行克隆擴(kuò)增測序二代測序 DNA 樣本的質(zhì)量控制首先，評價基因組DNA 的質(zhì)量是非常須要的（完好性和純度） .凝膠電泳法基因組 DNA 的完好性和大小，可以用慣例或者脈沖場瓊脂糖凝膠電泳（PFGE）

4、來檢測 慣例的凝膠電泳的精確度不高，這是因為大的 DNA 分子在凝膠中挪動的時候，實質(zhì)上是用一種與尺寸有關(guān)的方式一路挪動的 .但是，它仍然能夠提供完好性（大小范圍）和純度（ RNA 凈化物在凝膠底部構(gòu)成脫尾條帶)方面的無效信息.是以，它仍然是評價基因組DNA 質(zhì)量的無效方法之一.注： RNA 凈化會導(dǎo)致DNA 濃度高估，而且按捺一些下流步調(diào).如果能肯定有RNA 凈化，則可使用去DNase 的 RNaseI 處理樣本 .分光光度測定法分光光度儀在260 nm 和 280 nm 處讀數(shù)的比例(A260/ A280)可以用來估計DNA 絕對于一些接收紫外光的雜質(zhì)(比方蛋白)的純度.純凈的DNA的A2

5、60/A280比例大約為1.7-1.9.注：想要獲得精確的 A260/A280 值，須要在弱堿性的緩沖溶液中測定吸光度(比方, 10 mM Tris?Cl, pH7.5).第二個步調(diào)是測定基因組DNA 的濃度 .分光光度法DNA的濃度可以通過使用分光光度儀測定其在260 nm波長的吸光度來確定.Nanodrop 目前被廣泛使用，因為它須要的樣本量少（1以l）,而且使用方便（不須要比色皿為了確保結(jié)果的可靠性，讀數(shù)應(yīng)當(dāng)在0.1 到 1.0之間 .注：吸光度測定不克不及區(qū)別 DNA 和 RNA.RNA 凈化物會導(dǎo)致DNA濃度高估.但是，純凈RNA的A26o/A280比值在2.0擺布，而純凈的 DNA

6、 大約為1.8.是以，如果這個值為1.95，那么說明樣本里面有RNA 雜質(zhì) .注：苯酚在270- 275 nm的波長范圍內(nèi)有最大的吸光度，非常接近于 DNA. 是以苯酚能提高樣本在260 nm 附近的吸光度，從而導(dǎo)致高估DNA 的產(chǎn)量和純度.熒光法熒光法使用熒光染料測定DNA 的濃度，具有特異性和靈敏性.Hoechst 33258結(jié)合到DNA 上后，能增大 458 nm波長附近的發(fā)光強(qiáng)度，除此以外，也能夠使用一些更加靈敏的熒光染料，比方 PicoGreen 染料 .基于 PicoGreen 染料的實驗，比紫外吸光光度法靈敏10， 000倍，而比使用 Hoechst33258染料的方法至多靈敏4

7、00倍.和紫外吸光光度法分歧，PicoGreen 實驗對雙鏈DNA 的選擇性要遠(yuǎn)高于 RNA 和單鏈DNA.DNA 尺度品和樣本與熒光染料混合，而且使用熒光計檢測將樣本的測定結(jié)果與尺度品的測定結(jié)果比擬較，以確定DNA 的濃度 .Real-time PCR可以使用real-time PCR技術(shù)來測定DNA樣本的數(shù)量和質(zhì)量多重 PCR 技術(shù)使用引物集在多個位點擴(kuò)增分歧大小的片段，是檢測 DNA 損傷和片段化的無效質(zhì)控手段.此類技術(shù)試驗專門測定可經(jīng) PCR 擴(kuò)增，適于二代測序的 DNA 分子 .上 述提到的這些慣例方法，通常不克不及測定的樣本中擴(kuò)增得到的 DNA 的量，或者會高估了 DNA 的量 .

8、與它們比擬，real-time PCR更加適用于猜測 DNA樣本是否適合于二代測 序.文庫制備對于大多數(shù)商業(yè)化的二代測序平臺，使用諸如橋式擴(kuò)增或者乳液 PCR 方法，對文庫中的 DNA 片段進(jìn)行克隆擴(kuò)增，以發(fā)生足夠拷貝數(shù)量的測序模板非常須要 .通過將平臺特異性的適配子與感愛好的 DNA 源（比方基因組DNA 、雙鏈cDNA 或者 PCR 擴(kuò)增子等所發(fā)生的 DNA 片段）退火，得到片段文庫 .適配子序列的存在，使得我們可以對文庫分子進(jìn)行選擇性的克隆擴(kuò)增.是以，這類方法不須要像傳統(tǒng)的方法那樣，在微生物兩頭體中，對基因組片段進(jìn)行微生物克隆 .另外，適配子序列中，還含有平臺特異性的測序引物的結(jié)合位點

9、.通常情況下，一個慣例的 DNA 文庫構(gòu)建方案包含四步：片段化 DNA對 DNA 片段進(jìn)行末端修復(fù)連接適配子序列（不適用于單分子測序）對可選的文庫進(jìn)行擴(kuò)增目前有四種方法用于發(fā)生基因組DNA 碎片：酶消化法、超聲波法、噴霧法和水動力剪切法.這四種方法都可以用于文庫構(gòu)建，但是每一種方法都有其長處和局限性 .核酸內(nèi)切酶消化的方法快速而且容易，但是難以精確的控制片段長度的分布.另外這類方法可能會對基因組DNA 的呈遞引入偏倚另外三種技術(shù)使用物理的方法將DNA 的雙鏈打斷，這類斷裂是隨機(jī)的，是以能在文庫中對DNA 進(jìn)行無偏的呈遞.可以使用瓊脂糖凝膠電泳或者主動化的 DNA 分析方法，對DNA 片段的尺寸

10、分布進(jìn)行控制片段化 DNA 以后，須要將DNA 修復(fù)，發(fā)生5 磷酸化的 TOC o 1-5 h z 平末端 DNA ，以便能夠和測序平臺特異性的適配子相連接.文庫構(gòu)建的效力直接依附于 DNA 末端修復(fù)的效力和精確性末端修復(fù)混合溶液將5 或者3 的粘性末端轉(zhuǎn)釀成5 磷酸化的平末端DNA. 在大多數(shù)情況下，末端修復(fù)通過T4DNA 聚合酶的5 3聚合酶活性和3 5 的核酸外切酶活性完成.而 T4 多聚核苷酸激酶確保平末端的 DNA 片段5 端的磷酸化，以便進(jìn)行后續(xù)的適配子連接.根據(jù)所使用的測序平臺，平末端DNA 片段可以直接與適配子連接，或者須要在其片段的3 端添加一個單獨的突出的腺苷酸 A ，以便

11、與平臺特異性適配子上突出的胸苷酸T 彼此配對 .通常情況下，使用 Klenow 片段（具有最低的 3 到5端的核酸外切酶活性），或者使用其它具有末端轉(zhuǎn)移酶活性的聚合酶催化這一步調(diào) .T4 DNA 連接酶將雙鏈的適配子與文庫片段修復(fù)過的末端相連，然后使用回收反應(yīng)或者根據(jù)DNA 的尺寸，選擇性去除文庫中未連接的適配子和適配子二聚體.大小篩選方法包含使用瓊脂糖凝膠電泳分離，使用磁珠或者使用高等的基于柱的純化方法.在連接過程中可能出現(xiàn)適配子的二聚體，它們會和與適配子連接的文庫片段共同擴(kuò)增，從而降低測序平臺對真注釋庫片段測序的能力而且降低測序的質(zhì)量，是以在測序之前，必須將它們從文庫中除去 .一些測序平臺

12、請求文庫片段的長度分布在比較窄的范圍內(nèi)，以得到最好的結(jié)果，很多時候，這只能通過去除凝膠電泳上的響應(yīng)的片段條帶實現(xiàn).這類方法也能夠用來去除適配子二聚體.完成這一步調(diào)以后，應(yīng)當(dāng)對DNA 片段文庫的質(zhì)量進(jìn)行檢測，并進(jìn)行定量檢測.根據(jù)濃度和測敘文庫的適配子設(shè)計，既可以直接濃縮溶液并用于測序，也能夠?qū)ξ膸爝M(jìn)行選擇性擴(kuò)增 .在文庫擴(kuò)增階段，使用高保真的 DNA 聚合酶，合成完好的適配子序列，通過與PCR 引物的堆疊，用于后續(xù)的克隆擴(kuò)增和與測序引物結(jié)合，或者提高 DNA 文庫的產(chǎn)量.為了得到最好的文庫擴(kuò)增結(jié)果，請求DNA 聚合酶具有高保真性和最小的序列偏倚.文庫質(zhì)量評估方法，拜見 NGS 文庫質(zhì)控 .為了充

13、分利用測序能力，分歧樣本得到的測敘文庫可以放在一路，在同一輪實驗中一同測序 .通過將 DNA 片段與具有分歧特征的適配子相連接，可以實現(xiàn)這一過程，即對于每一個樣本使用分歧的短核苷酸序列作為適配子 .有一些其它的方法可以用于簡化文庫構(gòu)建.有一種新方法使用轉(zhuǎn)位酶 /DNA 的復(fù)合物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)座，以便在同一個試管中同時將DNA 片段化并標(biāo)識表記標(biāo)幟.通過對所標(biāo)識表記標(biāo)幟的DNA片段進(jìn)行無限次數(shù)的PCR擴(kuò)增，可以構(gòu)建完好的測敘文庫，這節(jié)省了操縱步調(diào)和時間 .但是，使用體外轉(zhuǎn)座構(gòu)建的文庫，與傳統(tǒng)方法構(gòu)建的文庫比擬，具有更高的序列偏倚.NGS 文庫質(zhì)控高質(zhì)量的文庫是成功進(jìn)行第二代測序的關(guān)鍵.文庫構(gòu)建包含復(fù)

14、雜的步調(diào)，比方片段化樣本、修復(fù)末端、將末端腺苷?；?、連接適配子和擴(kuò)增文庫.根據(jù)使用的平臺和文庫類型，這些步調(diào)也會發(fā)生變更.監(jiān)控每一個步調(diào)非常須要，包含在片段化樣本以后檢查片段的尺寸，和連接適配子以后檢查片段的大小和濃度.文庫驗證過程中，須要分析文庫中片段的大小和數(shù)量，這是質(zhì)控的最初步調(diào) .評估文庫中片段的大小瓊脂糖和 PAGE 凝膠電泳是傳統(tǒng)的檢測片段大小的方法，它們比較耗時.比來，基于微流技術(shù)的電泳或者毛細(xì)管電泳愈來愈廣泛的用于檢測片段的大小和濃度.即買即用的芯片和膠盒省去了配置凝膠的步調(diào)，使用方便.它們具有更高的通量，而且省去了很多的手動操縱時間. 除此以外，它們的靈敏度更高（對于檢測的限

15、制更少），而且能完好主動化的獲取數(shù)據(jù)和輸出電子化的數(shù)據(jù)材料.這些儀器能同時檢測片段的大小和濃度 .測定文庫中的片段數(shù)量分光光度法和熒光法拜見分光光度法和熒光法電泳設(shè)備如前所述，基于微流技術(shù)的電泳和毛細(xì)管電泳除了提供片段大小的信息以外，還提供了定量檢測數(shù)據(jù).但是，電泳、分光光度法和熒光法的一個共同的局限性是，都只檢測總的核苷酸的濃度，而非與適配子連接的分子的濃度.Real-time PCR將適配子連接到文庫分子的兩端，使得可以在平行的 PCR擴(kuò)增步調(diào)中擴(kuò)增上百萬個獨立的DNA分子（乳液PCR或者橋式PCR） .在有些儀器中，乳液PCR 可以將一個DNA分子擴(kuò)增到數(shù)百萬個不異序列的拷貝，并全都結(jié)合

16、在同一個珠子上.在另一種平臺上，橋式PCR能夠?qū)⒁粋€DNA分子轉(zhuǎn)釀成一個包含不異序列的多個拷貝的 DNA 簇 .是以，兩端連接了適配子的擴(kuò)增以后的分子，決定了乳液PCR 中模板和珠子的比例和橋式 PCR 中發(fā)生的最好DNA 簇 .對擴(kuò)增后的文庫中的分子進(jìn)行精確的定量檢測，對于確保片段的質(zhì)量和高效的獲得數(shù)據(jù)是非常次要的 .低估擴(kuò)增文庫中的分子數(shù)量，會導(dǎo)致混雜的旌旗燈號和難以解析的數(shù)據(jù)；相反地，高估分子的數(shù)量會降低結(jié)合模板的珠子或者DNA 簇的產(chǎn)量，而且沒有充分利用測序能力 .Real-time PCR能夠特異性的定量檢測兩端結(jié)合有適配子的DNA 分子，是以能夠?qū)U(kuò)增文庫中的分子進(jìn)行高度精確的定量

17、檢測.Real-time PCR的靈敏性非常高，可以對濃度非常低的文庫分子進(jìn)行定量檢測，即使其濃度低于傳統(tǒng)方法可以檢測的閾值.是以，這類方法能盡量減少對文庫的擴(kuò)增，降低可能的偏倚用于決對定量檢測的數(shù)字 PCR數(shù)字 PCR 能夠?qū)Χ鷾y序的文庫進(jìn)行絕對定量檢測，而不須要尺度品 .這個技術(shù)對文庫進(jìn)行無限的濃縮，并進(jìn)行大量獨立的 PCR 反應(yīng)；是以，大多數(shù)反應(yīng)沒有模板，得到陰性的結(jié)果.一個單獨的陽性 PCR反應(yīng)統(tǒng)計為一個單獨的模板分子.通過統(tǒng)計所有陽性PCR 的數(shù)量，能夠確定文庫分子的絕對數(shù)目 .數(shù)字 PCR 的次要長處在于：單分子的敏感性與 PCR 擴(kuò)增的效力有關(guān)，因為成功的擴(kuò)增被統(tǒng)計為一個分子，

18、而與終極產(chǎn)品的數(shù)量有關(guān)但是，這類技術(shù)須要特殊的儀器，而且花費較高，是以尚未廣泛用于文庫定量檢測 .宏基因組學(xué) MetagenomicsDNA 測序的利用領(lǐng)域之一是宏基因組領(lǐng)域，即從環(huán)境樣本. 宏基因組學(xué)是指一個 環(huán)境樣本中所包含的所有微生物基因組的功能和序列分析 .這個詞匯起源于“ meta ”（在這里指對于基因多樣性的零碎性理解）和“ genomics ”（對一個物種的遺傳物資的綜合分 析）宏基因組不是一個新的學(xué)科，但因為二代測序技術(shù)所帶了的諸多可能性，宏基因組的利用經(jīng)歷了巨大的提升 .據(jù)估計，微生物中僅有1%擺布是可培養(yǎng)的，是以宏基因組學(xué)的研討能極大的拓展我們對于環(huán)境的認(rèn)識 .很多年以來，

19、“宏基因組”這個詞匯僅與環(huán)境樣本的分析有關(guān)，比方，分析從極端的生存環(huán)境下分離得到的 DNA ，以便發(fā)現(xiàn)能用于工業(yè)的新的生物催化劑 .但是，通量的極大提高，和所花費的費用和時間的降低，將這個領(lǐng)域的利用擴(kuò)展到了很多其他方面.宏基因組學(xué)可分成幾個領(lǐng)域，包含：病理基因組學(xué) / 感染基因組學(xué)微生物組分析環(huán)境宏基因組學(xué)注：這其實不是全面的分類，研討者可以選擇其他的分類尺度 .病理基因組學(xué) / 感染基因組學(xué)和疾病的診斷相干，用于確定有疾病癥狀的患者體內(nèi)未知的病原體.這通常是極具挑戰(zhàn)性的過程，因為微生物的數(shù)量可能非常少(每毫升血液中大概有1 -10個細(xì)胞).與之相反，微生物組分析則涉及到數(shù)量巨大的微生物，比方

20、口腔或者直腸拭子中的微生物.此時，我們的目標(biāo)是分析這些菌群的構(gòu)成 .考慮到人體僅包含1% 的人類細(xì)胞而其它99%都是微生物細(xì)胞，微生物組分析在將來的診斷技術(shù)中有潛在的巨大利用 .更多細(xì)節(jié)，請見人類微生物組工程().環(huán)境宏基因組學(xué)的目標(biāo)除了包含傳統(tǒng)的尋覓新的生物催化劑以外，還包含研討和鑒定棲息環(huán)境.從理論上來講，環(huán)境宏基因組學(xué)有兩種分歧的研討方法：全基因組分析：對所有存在的 DNA 進(jìn)行測序16S分析：僅對16S rRNA DNA進(jìn)行測序第一種方法只是簡單的對樣本中存在的所有 DNA 進(jìn)行測序 .這可以完好地描繪所有出現(xiàn)過的微生物，而且可能發(fā)現(xiàn)新的酶或者酶家族，和抗生素的抗性.另一方面，這類方法

21、須要較高的測序能力，因此，絕對于第二種方法，其通量較低而且花費較高.與此相干的進(jìn)一步的方法正在研發(fā).在宏基因組的利用中，通常須要能提供較高的片段長度的測序儀，這是因為通常沒有參考序列可供參照 .對于 16SrRNA 分析而言，測序儀的讀長須要覆蓋全部區(qū)域（另請參照二代測序儀） .RNA 測序RNA 測序（RNA-seq ）是使用深度測序技術(shù)來研討生物體轉(zhuǎn)錄組的方法.此方法在構(gòu)建合適的文庫以后，對樣本中的RNA 直接測序，得到豐富的數(shù)據(jù)集以進(jìn)行分析.這項技術(shù)的高靈敏度和高分辨率使得它成為研討全部轉(zhuǎn)錄情形的有價值的工具 .數(shù)據(jù)的定量性和測序技術(shù)的高動態(tài)范圍使得其對基因表達(dá)的分析具有高度的靈敏性.數(shù)

22、據(jù)的單個堿基的分辨率提供了關(guān)于單核甘酸多態(tài)性（SNP）、選擇性剪接、外顯子/內(nèi)含子鴻溝、非翻譯區(qū)及其它元件的具體信息 . 除此以外，RNA-seq 不須要事后曉得參考序列，這使得從頭的轉(zhuǎn)錄組分析和新的變異體和突變體的檢測成為可能 .RNA-seq 是研討轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)大、革命性方法，但是使用這類技術(shù)須要非常細(xì)心以獲得最高質(zhì)量的數(shù)據(jù).RNA-seq 中須要考慮的身分第一個須要考慮的身分是樣本富集.總 RNA 通常只包含比例很少的編碼RNA 或者功能 RNA ；樣本中大部分RNA 是核糖體RNA （rRNA :大約占到了總 RNA的80- 90%）和較 少的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA （tRNA）.為了防止將80-

23、90%的測序資本用在 反復(fù)的 rRNA 序列上，通常在測序之前，須要從樣本中去除rRNA. 這通?？梢酝ㄟ^特定的耗費 rRNA 實現(xiàn)，也能夠通過使用寡聚胸腺嘧啶富集技術(shù)選擇性富集Poly A 實現(xiàn) .耗費rRNA 的方法可以同時保存編碼RNA 和非編碼 RNA （一項非常次要的研討內(nèi)容）的信息，而 Poly A 富集則僅保存了編碼 mRNA.Poly A 富集可能會丟掉特定的 RNA 和具有高轉(zhuǎn)換率的 RNA.有一些其他的方法可以防止rRNA 的影響，比方選擇性降解大量轉(zhuǎn)錄物，或者不擴(kuò)增 rRNA 的擴(kuò)增技術(shù).但是這些方法不像 rRNA 耗費或者 poly A 富集那么罕見，而且可能扭曲轉(zhuǎn)錄物

24、表征的正常水平.另外一個須要考慮的身分是要研討的 RNA 的大小 .RNA 轉(zhuǎn)錄物跨越比較大的大小范圍；與慣例的 RNA 分析比擬，關(guān)注小RNA的實驗（比方 microRNA或者長度范圍在15 -35bp 的 RNA ），須要特此外純化和文庫構(gòu)建方案 .大多數(shù)其他大小的 RNA 片段可以同時測序（ RNA 測序的經(jīng)常使用步調(diào)之一是將RNA分割成普通長度，比方200- 300 nt長度的片段） .RNA-seq 測序操縱步調(diào)一旦確定了移除核糖體的方法和要研討的片段大小，就可以將 RNA 構(gòu)建成一個文庫.對于大多數(shù)測序儀器而言，這包含首先將 RNA 打碎成片段，其次通過逆轉(zhuǎn)錄方法構(gòu)建雙鏈cDNA.

25、 在后續(xù)的文庫構(gòu)建過程中，這些雙鏈的 cDNA 被當(dāng)作普通的基因組DNA 來對待.如果想要保存RNA 的直接信息（鏈型），必須使用點竄過的文庫構(gòu)建方案，比方將mRNA 與連接適配子直接相連，或者標(biāo)識表記標(biāo)幟 cDNA的一條鏈以便在測序之前移除.在進(jìn)行測序計劃過程中，須要考慮三個次要的因：測序深度、讀長和是否使用雙端測序數(shù)據(jù).測序深度可以提供RNA轉(zhuǎn)錄物的豐度信息，而且較大的測序深度使得對于罕見轉(zhuǎn)錄物的檢測更加靈敏.讀長也很次要，因為較長的讀段對于檢測剪接事件更加靈敏（內(nèi)含子-外顯子鴻溝，外顯子-外顯子鴻溝）.雙端測序數(shù)據(jù)能提供更多關(guān)于轉(zhuǎn)錄物結(jié)構(gòu)的信息，特別是彼此分隔的較遠(yuǎn)的外顯子.普通而言，從

26、頭分析和尋覓新的結(jié)構(gòu)變異請求較高的測序深度和讀長，而且會得益于雙端測序數(shù)據(jù).典型的測序利用包含100- 200 M片段，長度為2 x 50- 100 bp.與之相反，表達(dá)分析得益于較高 的測序深度，但是讀長和雙端測序數(shù)據(jù)則對結(jié)果的改善感化較小.這方面利用的一個典型實驗包含10- 30 M片段，讀長為 1 x 35- 100 bp.基因調(diào)控研討二代測序技術(shù)也是研討基因調(diào)控收集的強(qiáng)無力的工具. 比方ChIP-seq技術(shù)（染色質(zhì)免疫共沉淀測序）可以用于分析蛋白-DNA 的彼此感化.二代測序技術(shù)也能用于確定基因組的全局甲基化模式.ChIP-Seq染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（ChIP）是用于研討轉(zhuǎn)錄因子和潤色

27、組蛋白基因調(diào)控機(jī)制的強(qiáng)大、多功能方法.這類技術(shù)用于確定活細(xì)胞中染色質(zhì)上那些與轉(zhuǎn)錄因子、共調(diào)節(jié)因子、潤色組氨酸、染色質(zhì)重塑蛋白或者其它的核因子彼此結(jié)合的區(qū)域全部操縱過程非常耗時，包含了很多步調(diào)和變量，每一個步調(diào)都須要研討者根據(jù)本人的模型體系進(jìn)行優(yōu)化 .將細(xì)胞與甲醛交聯(lián)以后，將染色質(zhì)中共價相連的基因組DNA 和核因子復(fù)合物分離出來，然后經(jīng)過超聲波處理，剪切成可以處理的大小 .抗體與目標(biāo)核蛋白特異性免疫共沉淀時，也將與這些核蛋白特異性結(jié)合的基因組DNA 也沉淀上去了 .去除化學(xué)交聯(lián)并經(jīng)過核酸純化處理的這些 DNA 可用于測序、基于微陣列的基因組雜交或者PCR 擴(kuò)增 .ChIP 與二代測序技術(shù)聯(lián)用(C

28、hIP-Seq)可研討與感愛好蛋白相結(jié)合的位點在基因組的范圍內(nèi)的分布.與微陣列分析(ChIP-Chip) 比擬， ChIP-Seq技術(shù)提供了較高的空間分辨率，動態(tài)范圍和基因組覆蓋度，因此它對于 DNA 結(jié)合位點的檢測具有超等的靈敏度和精確度.另外，ChIP-Seq 技術(shù)通常只需很少的起始樣本輸入量，而且不須要雜交探針，具有較高的靈活性，任何測序過基因組的物種都可以使用這類方法進(jìn)行研討 .高效的ChIP-Seq過程須要優(yōu)化幾個關(guān)鍵的變量.首先，甲醛交聯(lián)的溫度和時間須要優(yōu)化.如果蛋白和DNA 交聯(lián)的過于緊密，則在測序之前沒法將染色質(zhì)無效地打碎成片段，而且去除交聯(lián)也會碰到困難.通常情況下，最好以在3

29、7 C 下與1%的甲醛共培育10 分鐘起始，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化有幾種分歧的方法可以將染色質(zhì)打成碎片，比方超聲波和酶消化（比方使用微球菌核酸酶） .如果使用二代測序技術(shù)來分析免疫共沉淀的 DNA ，染色質(zhì)碎片的大小應(yīng)在大約100- 300核昔酸長度范圍內(nèi)，而且每一個測試零碎中（細(xì)胞的類型、組織的類型），將染色質(zhì)打碎成片段的參數(shù)也須要嚴(yán)酷優(yōu)化 .ChIP 實驗的成功與否取決于所使用的抗體的量和特異性.最好選用能從多家抗體廠商處獲得的，經(jīng)過ChIP 實驗驗證的抗體 .為了確定抗體能特異性地沉淀目標(biāo)蛋白，可以使用蛋白印跡技術(shù)檢測核提取物.如果在結(jié)果中，僅能觀察到一條特定大小的條帶，則可認(rèn)為該抗體

30、是特異性的.使用選定的抗體進(jìn)行免疫共沉淀，然后通過蛋白印跡分析技術(shù)確定抗體是否能特異性的沉淀目標(biāo)蛋白.如果如許的實驗失敗了，那么還可以將選定的抗體與培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光試驗.如果僅有細(xì)胞核顯色，則說明抗體至多能特異性的識別一種位于細(xì)胞核內(nèi)并可結(jié)合到 DNA 上面的蛋白 .根據(jù)目標(biāo)蛋白的豐度，經(jīng)過驗證的抗體的量和用于免疫共沉淀的染色質(zhì)的量必須經(jīng)過優(yōu)化，以便獲得足夠的 DNA 進(jìn)行測序 .對于識別組蛋白和組蛋白潤色的抗體而言，每一次免疫共沉淀反應(yīng)大概須要100， 000 到 1 百萬個細(xì)胞中的染色質(zhì) .如果轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合的動態(tài)性較高或者與組蛋白比擬，僅在無限的基因組位點上結(jié)合，那么實驗就

31、須要更多的染色質(zhì).為防止多余的抗體與非目標(biāo)蛋白和染色質(zhì)的非特異性結(jié)合，同時包管能沉淀足夠多的目標(biāo)蛋白，每一次免疫共沉淀反應(yīng)使用的抗體的數(shù)量也非常次要 .通常而言，1 - 10廊抗體即可得到合理的結(jié)果.可以用對照反應(yīng)來比對ChIP 反應(yīng)的特異性.在平行的ChIP反應(yīng)中，使用同樣數(shù)量的染色質(zhì)，可以使用同型的對照抗體或者沒有抗體的珠子用來對比抗體和珠子與蛋白和染色質(zhì)的非特異性的結(jié)合.通過比較陰性對照樣本和 ChIP 樣本中在特定位點沉淀的DNA 的量，能計算這個位點的富集因子但是，在這類免疫共沉淀對照實驗中得到的沉淀物的量通常很少，缺乏以提供足夠的片段進(jìn)行二代測序 .是以， ChIP-Seq實驗通常使用輸入對照樣本作比對.在這類情況下，每個ChIP 反應(yīng)中通常有1%交聯(lián)而且打碎的染色質(zhì)被用來去除交聯(lián)而且與沉淀的樣本一同純化并進(jìn)行后續(xù)的深度測序 .這使得我們可以比對因為打碎染色質(zhì)所惹起的偏移，這些偏移表示在染色質(zhì)的局部結(jié)構(gòu)， DNA 擴(kuò)增，測序，拷貝數(shù)量的 變更，和測定基因組區(qū)域的能力 在沉淀的 DNA 碎片去除交聯(lián)和純化以后，建議使用 realtime PCR技術(shù)確認(rèn)與目標(biāo)蛋白結(jié)合的基因組位點的回收和富集后果.通過比較輸入對照組與 Ch