流式細胞儀操作流程

1、查看文章流式細胞儀-細胞凋亡檢測I2008-11-01 10:20一 PI單染色法基本原理其原理主要是根據(jù)細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發(fā)生的特征性 改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形 態(tài)的改變等，其中細胞核的改變最具特征性，主要包括以下幾個方面：細胞核的改變：由于凋亡細胞核的改變，造成各種染色體熒光染料對凋亡細 胞DNA可染性發(fā)生改變。研究表明，用各種染色體熒光染料對經(jīng)固定的凋亡細 胞進行染色，其DNA可染性降低。許多學者把這種DNA可染性的降低認為是 凋亡細胞的標志之一。光散射特性：凋亡細胞形態(tài)上的改變影響它們的光散射特性。在流式細胞儀 上，前散

2、射光與細胞的大小有關，而側散射光反映的是光在細胞內(nèi)的折射作用， 與細胞內(nèi)的顆粒多少有關。在細胞凋亡時，細胞固縮，體積變小，故前散射光降 低，這一特性往往被認為是凋亡細胞的特點之一。此外細胞凋亡時由于染色體降 解，核破裂形成，細胞內(nèi)顆粒往往增多，故凋亡細胞側散射光常增加。細胞壞死 時，由于細胞腫脹，其前散射光增大；側散射光在細胞壞死時也增大，因此可根 據(jù)前散射光和側散射光區(qū)別凋亡細胞和壞死細胞。但需要注意的是，根據(jù)前散射 光和側散射光判斷凋亡細胞的可靠性受被檢測細胞形態(tài)上的均一性和核胞漿比 率影響很大。因此在某些淋巴細胞凋亡中，用光散射特性檢測凋亡的可靠性較好， 而在腫瘤細胞凋亡中，其可靠性就較

3、差。根據(jù)光散射特性檢測凋亡細胞最主要的 優(yōu)點是可以將光散射特性與細胞的表面免疫熒光分析結合起來，用以區(qū)別經(jīng)這些 特殊處理發(fā)生選擇性凋亡的淋巴細胞亞型。也可用于活細胞的分類。試劑與儀器l PBS溶液（配制方法見附錄）；l PI染液：將PI溶于PBS （pH7.4）中，終濃度為100ug/ml。用棕色瓶4C避光 保存。l 70%乙醇l 400目篩網(wǎng)l 流式細胞儀實驗步驟1.收集細胞數(shù)目約（15）X106個/mL，5001000 r/min離心5min，棄去培養(yǎng)液。3ml PBS 洗滌 1 次。離心去PBS,加入冰預冷的70%的乙醇固定，4C, 12小時。離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。4

4、00目的篩網(wǎng)過濾1次，500一1000r/min離心5min，棄去PBS。用1ml PI染液染色，4C避光30min。流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為488nm，發(fā)射光波 波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對 側散射光的散點圖。結果判斷：在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細 胞相比，前散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析PI 熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎 片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G/G期前出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以G/G 期所在位置的熒光強度為1.0

5、，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒羌 強度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35 和0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。注意事項細胞凋亡時，其DNA可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一，但這種 DNA可染性降低也可能是因為DNA含量的降低，或者是因為DNA結構的改變 使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結果時應該注意。二 Heochst 33342/PI雙染色法基本原理經(jīng)固定的凋亡細胞其染色體熒光染料的DNA可染性性下降。細胞一經(jīng)固定 就不再是活細胞，而且細胞固定過程對細胞膜的通透性也有影響。因此發(fā)展了用 “細胞活性”鑒定染

6、料染色的流式細胞儀檢測方法。這些方法細胞不經(jīng)固定就直 接用DNA染料染色，且染料的濃度要比固定細胞所用的濃度要低得多。流式細 胞儀通常根據(jù)細胞膜完整性將細胞分為“活細胞”和“死細胞”，因此正常細胞 和凋亡細胞歸為活細胞?；罴毎玖先鏗oechst 33342能少許進入正常細胞膜而 對細胞沒有太大得細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正 常細胞中要高，Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度增高的機制與凋亡細胞 膜通透性發(fā)生改變有關，凋亡細胞早期細胞膜的完整性沒有明顯性改變，但細胞 膜的通透性已有增強，因此進入凋亡細胞中的Hoechst 33342比正常細胞的

7、多。 此外，還與凋亡細胞的染色體DNA的結構發(fā)生了改變從而使該染料能更有效地 與DNA結合以及凋亡細胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將 Hoechst 33342排出到細胞外使之在細胞內(nèi)積累增加等有關。既然Hoechst 33342 進入凋亡細胞中比正常細胞更容易，而EB、PI或7-AAD等染料是不能進入細 胞膜完整的活細胞中，即正常細胞和凋亡細胞在不經(jīng)固定的情況下對這些染料是 拒染，壞死細胞由于膜完整性在早期即已破損，可被這些染料染色。根據(jù)這些特 性，用Hoechst 33342結合PI或EB等染料對凋亡細胞進行雙染色，就可在流式 細胞儀上將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞區(qū)別開來。在

8、雙變量流式細胞儀的散 點圖上，這三群細胞表現(xiàn)分別為：正常細胞為低藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+)，凋亡細胞為高藍色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+)，壞死細胞為低 藍色 / 高紅色(Hoechst 33342+/PI+)。試劑與儀器l Heochst 33342染液：用PBS配成10ug/ml的儲存液濃度，4C避光保存;l PI染液：用PBS配成5ug/ml濃度，4C避光保存。l 400目的篩網(wǎng)l 流式細胞儀實驗步驟懸浮生長的細胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入Heochst 33342，終濃度為1ug/ml；37C 孵育 710min。低溫500 1000r/min離心5

9、min棄去染液。加入1.0ml PI染液，4C避光染色15min。400目的篩網(wǎng)過濾1次。流式細胞儀分析：Heochst 33342用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長 為352nm，發(fā)射光波波長為400 500nm，產(chǎn)生蘭色熒光；PI用氬離子激光激發(fā) 熒光，激發(fā)光波波長為488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產(chǎn)生紅色熒光。分析 蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。結果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結果為：正常細胞為低藍光/ 低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。注意事項1.在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的 軌跡，可能是凋亡細

10、胞的DNA進一步降解的緣故。2.用Heochst 33342染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在20min之內(nèi)為 宜。如果太長可引起Heochst 33342的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色 熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。血流式細胞儀實驗方法點擊次數(shù)：1184發(fā)布日期：2008-5-13僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負一、實驗準備標本制備：最小化非特異性結合：二、凋亡1 .凋亡的檢測方法：網(wǎng)站和其它PI染色法Annexin V 法TUNNEL 法三、細胞因子激活的細胞因子CBA四、血小板活化活化檢測網(wǎng)織血小板五、紅細胞網(wǎng)織紅細胞PNH胎兒紅細胞六、腫瘤學DNA細胞周期

11、蛋白多藥耐藥微小殘留白血病第一部分標本處理一、流式細胞術常規(guī)檢測時的樣品制備（一）直接免疫熒光標記法取一定量細胞（約1X106細胞/ml），在每一管中分別加入50 M l的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分 鐘以上（），再直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應（如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同 熒光素的抗體同時加入），。孵育20-60分鐘后，用PBS（pH7. 2-7. 4 ）洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機 檢測。本方法操作簡便，結果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標抗體試劑成 本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。

12、（二）間接免疫熒光標記法取一定量的細胞懸液(約1X106細胞/ml),先加入特異的第一抗體，待反應完全后洗去未結合抗體，再加 入熒光標記的第二抗體，生成抗原一抗體一抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的 熒光。本方法費用較低，二抗應用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性 較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結果。所以標本制備時應加入陰性或陽性對照。另外，由于間 標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數(shù)較少的標本。二、最小化非特異性結合的方法熒光標記的抗體的濃度應該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。在使用第一抗體之

13、前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白(BSA)，脫脂干奶酪，或來自 于同一寄主的正常血清來作為標記的第二抗體。這個步驟通過阻斷第一抗體和細胞表面或胞內(nèi)結構的非特 異性的交互作用來降低背景。在使用第一抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標記的第二抗體一起培育。 這個步驟會減少不必要的第二抗體與第一抗體、細胞表面或胞內(nèi)結構之間的交互作用。通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它 也會導致已標記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復合體的形成。這種復合體會優(yōu)先與一些細 胞結構進行結合，或者它們最終會導致期望得

14、到的抗體活性的丟失。使用F(ab)2片段會使背景決定于第一或第二抗體與FC受體的全分子結合。大多數(shù)的第二抗體的 F(ab)2片段容易利用。而第一抗體的F(ab)2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的 條件下，將新鮮組織或細胞與正常血清一起培育應選擇優(yōu)先加入第一抗體。在此情況下，即使在隨后的步 驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。其它：已標記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應也可能會有 背景影響。為了降低背景，在多重標記過程中，所有的已標記的抗體應被吸附，避免其他種類蛋白的交叉 反應。第二部分細胞因子細胞內(nèi)細胞因子的流式細胞

15、儀檢測一、簡介隨著研究的進展，僅僅對細胞進行定量和活性的檢測已不能滿足需要。在單細胞水平研究細胞因子的表達 能力對研究細胞因子在疾病中的作用越來越顯的重要無比。目前檢測單個細胞特定細胞因子的表達手段包 括：ELIspot、原位雜交、免疫細胞化學、限制性稀釋分析(limiting dilution analysis，LDA)和單細 胞PCR，應用原位雜交技術和免疫組化方法觀察細胞因子蛋白表達及mRNA表達可以識別Th1和Th2細胞， 此方法可獲得較強的細胞內(nèi)信號，但此方法工作量大、主觀性強，難以進行大樣本檢測，且人肉眼識別能 力有很大的局限性，而ELISPOT及單細胞PCR技術，技術性強、勞動強

16、度大，難以進行廣泛推廣。隨著多 標記及胞內(nèi)細胞因子標記流式細胞技術的出現(xiàn)，使對細胞內(nèi)細胞因子的研究推向了一個新的階段。下面主 要對胞內(nèi)細胞因子流式細胞技術作以介紹。)與TH2(IL 4，IL-5，IL10)，但這些研究很難外推，因為T細胞克隆與體內(nèi)T細胞功能相關性還未被 揭示。早期細胞因子表達與細胞功能相關性研究是基于特定克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1(IL 2, IFN 近來，Jung與Picker采用了 monensin、PMA等藥物預孵，用Brefeldin(BFA)、Monensin阻斷了胞內(nèi)高爾 基體介導的轉運的方法使得細胞因子聚集，蓄積

17、，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。因為自然狀態(tài) 下，T淋巴細胞產(chǎn)生少量的細胞因子，通常要對T淋巴細胞體外活化進行研究。在體外刺激過程中，T淋巴 細胞產(chǎn)生的細胞因子已釋放出來，胞內(nèi)細胞因子信號較弱，難以進行檢測。這一方法可檢測單個細胞內(nèi)多 個細胞因子，并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在 1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞 亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞(T、B、NK)不能分泌細胞因子。胞內(nèi)流式分析法是用抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內(nèi)特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因 子

18、的分泌，同時采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。具有其它 方法難以比擬的優(yōu)點：0快速：流式定量檢測細胞內(nèi)細胞因子可在一天內(nèi)完成，實驗流程需6-8小時，實際操作時間為1-2小時， 快速簡便；0簡便：無需組織培養(yǎng)，可以全血分析，無需分離PBMCs；0靈敏度高：高度靈敏的熒光標記與檢測系統(tǒng)；0高效：可以在同一個細胞內(nèi)同時檢測兩種或更多種細胞因子，也可根據(jù)細胞免疫表型區(qū)分分泌細胞因子 的細胞的亞型，進行多參數(shù)相關分析；0安全：減少樣本處理與生物源性污染0接近生物體的分析條件：全血檢測保留細胞及生化微環(huán)境更準確反映了體內(nèi)狀況。二、所需儀器流式上樣管及細胞培養(yǎng)皿或板2.2

19、5%CO2，37C 孵箱混勻振蕩器離心機加樣器、Tips流式細胞儀三、常用的標本類型和處理方法全血：使用肝素鈉抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素鋰、EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內(nèi)分析， 超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內(nèi)檢測，應將真空采 血管水平室溫放置。自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)：使用肝素鈉抗凝的采血后，分離PBMCs，24小時內(nèi)分析。組織培養(yǎng)基中的外周血單個核細胞(PBMCs)：用Ficoll分離PBMCs，將細胞重懸于含10%熱滅活胎牛血清(FBS) 的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)細胞濃度為2X106細胞/ml。細胞系

20、與T細胞克?。赫{(diào)節(jié)細胞濃度2X106細胞/mL于新鮮培養(yǎng)基中。冰凍全血與PBMCs:使用1X紅細胞裂解液處理活化的外周血或者PBMCs，用PBS漂洗，并用含1%的BSA及 10%的DMSO的PBS重懸，一70C凍存。溶化后細胞置于染色管中，加上23mL的洗液，離心5分鐘后，用 破膜劑對細胞進行破膜和染色。四、所需試劑1、細胞表面染色的熒光標記的單抗試劑依據(jù)實驗需要選擇特殊表面標志CD45圈定所有淋巴細胞CD3圈定T淋巴細胞CD4圈定T輔助淋巴細胞亞群CD8圈定T抑制淋巴細胞亞群CD19/或CD20圈定B淋巴細胞CD56圈定NK淋巴細胞CD14圈定單核細胞2、熒光標記的細胞因子抗體：R&D提供F

21、ITC、PE和APC標記的細胞因子抗體3、溶血素：用外周全血檢測時需使用溶血素（R&D目錄號WL1000用于人或者WL2000用于小鼠；eBioscience 目錄號00-4333）溶解紅細胞4、激活劑Phorbol 12-Myristate 13 Acetate（PMA）（Alexis，目錄號 ALX-445-004-M001）DMSO中調(diào)節(jié)濃度0.1mg/mLL）,-20r儲存。勿反復凍融pB.分裝（20每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1： 100稀釋儲存液PMA終濃度25ng/mL細胞懸液lonomycin （Alexis,目錄號 ALX-450-006-M001）于乙醇中配制成濃度0.5

22、mg/mL-20r儲存每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1： 10稀釋儲存液g/mL細胞懸液pD.Ionomycin終濃度1Staphylococcal enterotoxin B（SEB） （Sigma,Catalog No.S-4881）無菌無疊氮鈉PBS調(diào)節(jié)濃度0.5mg/mL4C儲存g/mL細胞懸液pC.SEB終濃度10CD3 :包被在培養(yǎng)板中，在蛋白轉運抑制劑存在下活化未稀釋的血液細胞CD28:加速不同刺激劑（包括SEB、CD3等）的活化效應，濃度一般為10ug/ml5、阻斷劑阻斷高爾基體介導的轉運作用，使得刺激細胞表達的細胞因子聚集在胞漿內(nèi)Brefeldin-A（BFA） （eBios

23、cience,目錄號 00-4506）于DMSO中調(diào)節(jié)濃度5mg/mLL）, -20C儲存。勿反復凍融。p分裝（20每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1： 10稀釋儲存液g/mL細胞懸液。p激活最后4-5小時BFA終濃度10注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降Monensin （eBioscience,目錄號 00-4505）6、不含谷氨酰胺的RPMI-16407、固定劑：細胞在體外刺激后需要對細胞進行固定。固定的目的在于通過蛋白的交聯(lián)和變性一方面使細 胞因子固定在細胞內(nèi)，另一方面避免細胞表面抗原丟失。含4%的多聚甲醛PBS溶液（eBioscience,目錄 號 00-8222）8、 破膜劑：含

24、1%皂甙、0.05%疊氮化鈉的Hanks溶液（HBBS）（eBioscience,目錄號00-8333） 將細胞膜穿孔，已利于熒光標記的細胞因子抗體進入細胞內(nèi)，于相應的細胞因子結合9、 其它試劑：無菌無疊氮鈉PBS,乙醇，含1%多聚甲醛的PBS,4C儲存。五、細胞培養(yǎng)和刺激的基本方法細胞活化的最終結果是產(chǎn)生細胞因子，根據(jù)檢測指標和標本的不同，研究人員需要選擇不同的刺激劑和刺 激時間，以獲得最佳的實驗結果。下表提供了檢測一些常用細胞因子的推薦的活化方法。表1、細胞內(nèi)細胞因子流式檢測推薦的陽性對照活化方法檢訓細胞因子陽性對照刺激方法AlFN-g方法衛(wèi)圣4小時)方法5人 TNF-方法7 (6個時).

25、IL-la方法言(&小時IL-1方法3 C24，時成：A.IL-2方法必4里炎時)IL-4方法4方法1A.IL-6單核胞二方法3 (6-12小時)T細胞:：方法6Ail-io方法1Ail-12方法日tA.IL-15方法3:我Fr act alkine/CXCLl方法1XlL-S/CXCLS方法3佟4小時AMCF-1/CCL2方法3 (24小時丈;：MIF-la/CCL3方法3整4小時)A.MIP-lb/CL4方法3整4蘇時)ARAUTES/CCL5方法1+ 鼠 IL-2方法9b 鼠 IL-4方法1口十鼠工L-S方法1D不鼠IL-&方法11鼠 IF1T方法9 or方法1 丁不鼠THF-方法9為防止細胞內(nèi)細胞因子分泌到胞外，在培養(yǎng)的最后4-6個小時，需要使用蛋白轉運抑制劑(如3uMmonensin, 10mg/ml 的 BFA)方法1:只使用轉染細胞檢測方法 2:人的 PBMCs 使用 PMA (10 ng/ml)和 Ionomycin (1 uM)刺激 4-24 小時.方法3:人的PBMC使用LPS (0.5 - 1 ug/ml)刺激24小時.方法4:人的PBMCs或者純化的CD4 +細胞在包被人CD3抗體的培養(yǎng)板中，使用含有重組人的IL-2