《酶學(xué)與酶工程》word版

1、第一章 酶學(xué)與酶工程酶的基本知識有人估計(jì)： E.coli約有3000種蛋白質(zhì)，高等真核生物約有5000種以上蛋白質(zhì)， 其中絕大部分是酶，但真正認(rèn)識的只是極少數(shù)，剛開始酶極少，一二個(gè)不用命名，編號，都可以認(rèn)識，也不會(huì)混淆。 酶一多，會(huì)產(chǎn)生一酶多名，或一名多酶，則會(huì)引起混淆。1961年國際酶學(xué)委員會(huì)提出了給酶進(jìn)行命名和分類。 1961年， 712種， 1964年，870種， 1972年， 1770種， 1975年，1974種， 1978年， 2120種， 1984年，2470種， 1990年, 3000種， 1992年，3200種， 1997年，3700種，酶的命名 1961年國際酶學(xué)委員會(huì)（En

2、zyme Committee, EC）根據(jù)酶所催化的反應(yīng)類型和機(jī)理，把酶分成6大類： 各大類再分亞類，亞亞類酶的命名有兩種方法：系統(tǒng)名、慣用名。系統(tǒng)名：包括所有底物的名稱和反應(yīng)類型。乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+乳酸：NAD+氧化還原酶慣用名：只取一個(gè)較重要的底物名稱和反應(yīng)類型。乳酸脫氫酶乳酸：NAD+氧化還原酶對于催化水解反應(yīng)的酶一般在酶的名稱上省去反應(yīng)類型。系統(tǒng)命名特點(diǎn)： 1. 表達(dá)確切 2. 太繁，使用不便 單底物：底物 + 反應(yīng)類型 + 酶D-氨基酸 + 氧化還原 + 酶-D-氨基酸氧化酶 雙底物：底物：底物 + 反應(yīng)類型 + 酶醇+NAD+氧化還原+酶-醇:NAD+

3、 氧化還原酶習(xí)慣命名特點(diǎn)： 1.非常簡便 2.不精確，容易產(chǎn)生誤會(huì)， 但人們還是喜歡用1）以底物命名( 淀粉酶，蛋白酶) 2）以反應(yīng)性質(zhì)命名( 轉(zhuǎn)氨酶，脫氨酶)3）結(jié)合以上兩者(乳酸脫氫酶 ) 4）或再加酶的來源或性質(zhì)特點(diǎn)(胰蛋白酶；堿性磷酸酯酶)提示：習(xí)慣命名使用中要注意混淆；如激酶，往往指磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的一類酶，水解酶也叫激酶，但無磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移(鏈激酶，尿激酶)用四個(gè)數(shù)字（標(biāo)碼）標(biāo)記每一種酶EC-Enzyme Commision EC 1.1.1.1 醇脫氫酶 第一大類， 作用CHOH， 以 NAD+ ，NADP+為受體 編號 酶委員會(huì)建議，發(fā)表論文時(shí)，論題有關(guān)的主要酶在第一次提到時(shí)寫出它的

4、標(biāo)碼系統(tǒng)名稱、習(xí)慣命名和來源，然后再用系統(tǒng)命名和習(xí)慣命名敘述。二、酶的分類1氧化還原酶 2轉(zhuǎn)移酶 3水解酶4裂合酶 5異構(gòu)酶 6連接酶（合成酶）7核酸酶（催化核酸）酶用于生物催化的概況核酸類酶（R酶）的分類 1982年以來，被發(fā)現(xiàn)的核酸類酶越來越多，對它的研究越來越廣泛和深入。但對于分類和命名還沒有統(tǒng)一的原則和規(guī)定。根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，可將R酶分為剪切酶，剪接酶和多功能酶等三類。根據(jù)R酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)不同，可分為錘頭型R酶，發(fā)夾型R酶等。根據(jù)酶催化的底物是其本身RNA分子還是其它分子，可以將R酶分為分子內(nèi)催化（in cis）和分子間催化（in trans）兩類。 其他習(xí)慣歸類命名：1、單體酶 2

5、、寡聚酶 3、多酶復(fù)合體4、同工酶 5、誘導(dǎo)酶單體酶：一條多肽鏈，分子量13,00035,000，不能再解離成更小單位，不需輔助因子，如一些水解酶，往往以無活性狀態(tài)合成，需要時(shí)水解去除部分成活性酶。寡聚酶(多數(shù)為寡聚酶)：具相同或不同亞單位組成，以多條肽鏈組成，一般2-4個(gè)亞單位組成，分子量35,000以上，往往是代謝中的關(guān)鍵酶，如乳酸脫氫酶。多酶復(fù)合體：幾個(gè)酶鑲嵌而成的復(fù)合物，這些酶催化將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的一系列順序反應(yīng)。集不同催化活性于一身。1）調(diào)節(jié)功能，在不同條件時(shí)，催化功能不同2）催化多個(gè)連續(xù)反應(yīng)的酶活性于一身 丙酮酸+CoA+NAD+=乙酰CoA+CO2 +NADH 丙酮酸脫氫酶 具三

6、種酶活性，有60多條肽鏈組成，分子量4,600,000丙酮酸脫氫酶系（E.coli）：丙酮酸脫氫酶（E）、硫辛酰轉(zhuǎn)乙酰酶（E）和二氫硫辛酰脫氫酶（E）。同工酶：存在于生物的同一種屬或者同一個(gè)體的不同組織，甚至同一組織或者同一細(xì)胞催化相同反應(yīng)，但結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)、催化特性有所不同的一類酶。誘導(dǎo)酶：當(dāng)細(xì)胞中加入特定誘導(dǎo)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶，含量在誘導(dǎo)物存在下顯著增高，這種誘導(dǎo)物往往是該酶底物的類似物或底物本身。三、酶的組成和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1、酶的化學(xué)性質(zhì)1926年首次從刀豆制備出脲酶結(jié)晶，證明其為蛋白質(zhì)，并提出酶的本質(zhì)就是蛋白質(zhì)的觀點(diǎn)。1982年T.Cech發(fā)現(xiàn)了第1個(gè)有催化活性的天然RNA-ribozyme

7、，以后Altman和Pace等又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了真正的RNA催化劑。核酶的發(fā)現(xiàn)不僅表明酶不一定都是蛋白質(zhì)，還促進(jìn)了有關(guān)生命起源、生物進(jìn)化等問題的進(jìn)一步探討。單純酶酶的組成（全酶）= 酶蛋白 + 輔因子結(jié)合酶酶 與酶蛋白結(jié)合得比較松的小分子有機(jī)物。輔酶 與膜蛋白結(jié)合得緊密的小分子有機(jī)物。金屬激活劑輔基輔因子 金屬離子作為輔助因子。酶的催化專一性主要決定于膜蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學(xué)基團(tuán)的載體?；钚圆课缓捅匦杌鶊F(tuán)必需基團(tuán)：這些基團(tuán)若經(jīng)化學(xué)修飾使其改變，則酶的活性喪失?；钚圆课唬好阜肿又兄苯优c底物結(jié)合，并和酶催化作用直接有關(guān)的部位專一性結(jié)合基團(tuán)活性部位必需基團(tuán)催化性質(zhì)催化基團(tuán)接觸殘基：

8、R1、R2、R6、R8、R9、R163輔助殘基：R3、R4、R5、R164、R165結(jié)構(gòu)殘基：R10、R162、R169非貢獻(xiàn)殘基：其它維持酶的空間結(jié)構(gòu)酶活性中心的特點(diǎn)a. 酶的活性中心只有幾個(gè)氨基酸組成，多為極性氨基酸。b. 酶的活性中心是一個(gè)三維實(shí)體結(jié)構(gòu)，活性中心的幾個(gè)氨基酸殘基在一級結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，甚至位于不同肽鏈上，通過肽鏈的盤繞折疊而在空間結(jié)構(gòu)上相互靠近，形成一個(gè)能與底物結(jié)合并催化底物形成產(chǎn)物的位于酶蛋白分子表面的特化的空間區(qū)域。c. 酶的活性中心與底物的結(jié)合通過次級鍵。d. 酶的活性中心具有柔性，可與底物誘導(dǎo)契合發(fā)生相互作用。e. 酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴“中，為非極

9、性環(huán)境。四、酶的作用原理及酶活性調(diào)節(jié)(一)、酶的專一性及活性部位中間產(chǎn)物學(xué)說的內(nèi)容：酶與底物先結(jié)合成一個(gè)中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物分解成產(chǎn)物和游離的酶。 E+S ES E+P發(fā)展的中間產(chǎn)物學(xué)說：酶先與底物結(jié)合成酶-底物復(fù)合物(ES)，然后轉(zhuǎn)變成過渡態(tài)(ES*)，再形成酶-產(chǎn)物復(fù)合物(EP)，最后分解釋放出酶，并生成產(chǎn)物。 E+S ES ES* EP E+P 中間產(chǎn)物學(xué)說的證據(jù)：電子顯微鏡觀察到了核酸聚合酶與核酸結(jié)合而成的復(fù)合物；根據(jù)酶和底物反應(yīng)前后的光譜變化，可證明中間產(chǎn)物的存在；D-氨基酸氧化酶與D-氨基酸結(jié)合而成的復(fù)合物已被分離、結(jié)晶出來。1890年，Emil Fischer提出“鎖鑰學(xué)說”

10、：底物的結(jié)構(gòu)和酶活性部位的結(jié)構(gòu)非常吻合，就象鎖和鑰匙一樣，這樣它們就能緊密結(jié)合形成中間產(chǎn)物。酶(E)底物（S）1958年，Koshland提出“誘導(dǎo)契合學(xué)說”：酶活性部位的結(jié)構(gòu)與底物的結(jié)構(gòu)并不特別吻合，但活性部位具有一定的柔性，當(dāng)?shù)孜锱c酶接近時(shí)，可以誘導(dǎo)酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，使之成為能與底物分子密切結(jié)合的構(gòu)象 。、降低反應(yīng)活化能反應(yīng)活化能：酶降低活化能的方式（形成ES，經(jīng)歷與一般反應(yīng)不同的途徑）如過氧化氫分解，無催化劑時(shí)的活化能為75.31KJ/mol，膠態(tài)鉑催化為46.02KJ/mol，而過氧化氫酶催化為20.92KJ/mol?；罨艿慕档吞岣吡嗣傅拇呋?。 (三)、 影響酶高催化效率

11、（降低活化能）的有關(guān)因素： 1. 鄰近與定向：底物有聚集在活性中心的趨勢，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明活性中心的底物濃度是溶液中其他部位的6000倍；底物與活性中心是定向結(jié)合。鄰近與定向的結(jié)果：使酶活性部位的底物濃度大大提高。2. 底物敏感鍵扭曲變形：這種效應(yīng)是說底物與酶結(jié)合以后，其電子云要發(fā)生重排，產(chǎn)生電子張力，使敏感鍵更加敏感，更易反應(yīng)。3. 酸堿催化： 狹義酸堿：酸 H+ 堿 OH 廣義酸堿：酸 能釋放質(zhì)子的化合物 堿 能接受質(zhì)子的化合物在這些基團(tuán)中，咪唑基是最重要的酸堿催化基團(tuán)，這是因?yàn)樗趐H時(shí)的酸堿強(qiáng)度大，因?yàn)槠鋚Ka為6.0，即在生理?xiàng)l件下，一半為酸，一半為堿，第二是釋放質(zhì)子的速度快，其質(zhì)子結(jié)合的

12、半衰期只有10-10秒。4. 共價(jià)催化：是指酶在催化過程中，酶與底物形成共價(jià)中間復(fù)合體的催化方式。 如酯酶催化酯的水解就是如此。酶分子上可以形成這種復(fù)合體的基團(tuán)有兩類，即親核基團(tuán)和親電基團(tuán)。 親核基團(tuán)有組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的硫氫基、絲氨酸的羥基，另外還有一些輔助因子， 如TPP、CoA等。親電基團(tuán)有金屬離子、NH3+等底物中的親電基團(tuán)包括磷?；?、?；吞腔?. 疏水微環(huán)境：酶在催化過程中，其活性中心為疏水環(huán)境，在這種環(huán)境中，電荷之間的作用力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于高電介環(huán)境，大大加強(qiáng)了酶的催化基團(tuán)與底物分子間的作用力，因而有利于降低反應(yīng)活化能。有機(jī)物的電介常數(shù)為7-10，而水的電介常數(shù)為80。影響酶的催

13、化作用： 廣義的酸堿催化 b. 共價(jià)催化 c. 鄰近效應(yīng)及定向效應(yīng) d. 變形或張力 e. 酶的活性中心為疏水區(qū)域酶催化反應(yīng)機(jī)理舉例溶菌酶（E .C. 3. 2. 1. 17. Lysozyme）結(jié)構(gòu)特性：129個(gè)氨基酸， Mr 14.6 kD, 四對-S-S-鍵活性中心： Glu35 和 Asp52水解功能： 催化某些細(xì)菌細(xì)胞壁多糖的水解。N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）和N 乙酰氨基葡萄糖乳酸（NAM）組成的共聚物-是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分。生物體內(nèi)的存在：雞蛋清和動(dòng)物的眼淚中專一性專門水解NAMc1和NAG c4之間的 -1,4 糖苷鍵（A-B-C-D-E-F）最適底物： NAG 和NAM交替

14、的6糖。催化機(jī)理：廣義酸堿催化，糖從穩(wěn)定的椅式結(jié)構(gòu)變成不穩(wěn)定的半椅式結(jié)構(gòu)2. 胰凝乳蛋白酶（E.C. 3. 4 .4. 5 , chymotrypsin）結(jié)構(gòu)特性：241個(gè)氨基酸，三條多肽鏈， Mr 25 kD， 分子間二對-S-S-鍵，分子內(nèi)二對二硫鍵?；钚灾行模?Ser 195, His57, Asp102水解功能： 水解肽鍵斷裂。專一性： 對芳香性和較大疏水基團(tuán)氨基酸有專一性水解。 催化機(jī)理：靠三個(gè)氨基酸Ser 195，His57， Asp102之間構(gòu)成的電荷傳遞體系（催化三聯(lián)體），起到酸堿催化和親和催化，使肽鍵斷裂。 酶作為催化劑的顯著特點(diǎn) 催化劑（catalyst）：是一類能改變反應(yīng)

15、速度，但不能改變反應(yīng)的性質(zhì)、反應(yīng)方向和反應(yīng)平衡點(diǎn)，而且本身在反應(yīng)前后不發(fā)生變化的外在因素。酶與一般的化學(xué)催化劑的區(qū)別更高的催化效率 酶催化的反應(yīng)速率是相應(yīng)的無催化反應(yīng)速率的1081020倍，并且至少高出非酶催化反應(yīng)速率幾個(gè)數(shù)量級。更高的反應(yīng)專一性 酶分子特定的空間結(jié)構(gòu)決定了其特定的底物專一性。溫和的反應(yīng)條件 一般的化學(xué)催化往往需要高溫、高壓和極端的pH條件。具有調(diào)節(jié)能力 許多酶的催化活性可受到多種調(diào)節(jié)機(jī)制的靈活調(diào)節(jié)，如別構(gòu)調(diào)節(jié)、酶的共價(jià)修飾調(diào)節(jié)、酶合成與降解的調(diào)節(jié)。酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì) 易變性和降解。酶作為催化劑的顯著特點(diǎn)（1）專一性強(qiáng) （2）效率高、條件溫和 （3）調(diào)節(jié)性H2NCONH2 + H

16、2O = 2NH3 + CO2絕對專一性：一種酶只催化特定的底物發(fā)生反應(yīng)，如：脲酶只催化尿素分解：相對專一性：基團(tuán)專一性即酶對反應(yīng)鍵一端的基團(tuán)有絕對要求，而對另一端的基團(tuán)則無特殊要求， 如葡萄糖苷酶，可以催化水解糖苷鍵，并且要求鍵的一端為葡萄糖，而另一端可以是任意糖。鍵專一性：酶對反應(yīng)鍵兩端的基團(tuán)都沒有特殊要求，如酯酶只要是酯鍵就可水解。立體專一性：順反異構(gòu)專一性，如琥珀酸脫氫酶只催化產(chǎn)生反式結(jié)構(gòu)的丁烯二酸即延胡索酸。旋光異構(gòu)專一性：L-氨基酸氧化酶只催化L-氨基酸氧化，而對D-氨基酸無作用。催化效率催化轉(zhuǎn)換數(shù)：每個(gè)酶分子每分鐘催化底物轉(zhuǎn)化的分子數(shù)。一般為103min-1，碳酸酐酶最高為3.6

17、* 107min-1有酶加入比無酶參加反應(yīng)速度一般要高107-1013酶為何有如此驚人的催化能力呢？ 酶可極大地降低反應(yīng)所需的活化能條件溫和 ：常溫、常壓、pH近乎中性調(diào)節(jié)性正常情況下生物體并不要求每個(gè)酶處于最有效的催化狀態(tài)，而是要求有快有慢。在長期的進(jìn)化、選擇過程中，生物體為適應(yīng)外界環(huán)境變化，滿足生理功能的需要，形成了一整套調(diào)節(jié)機(jī)制。（酶合成水平上的調(diào)節(jié)和酶結(jié)構(gòu)活性水平上的調(diào)節(jié))多種調(diào)節(jié)方式：濃度調(diào)節(jié)（合成降解調(diào)節(jié))； 生理調(diào)節(jié)(激素調(diào)節(jié))；反饋調(diào)節(jié)（別構(gòu)調(diào)節(jié)）； 共價(jià)修飾調(diào)節(jié)（可逆，不可逆)； 寡聚酶的聚合、解聚調(diào)節(jié)； 存在方式調(diào)節(jié)（多酶體系）；抑制劑調(diào)節(jié)；1、別構(gòu)調(diào)節(jié)和別構(gòu)酶:別構(gòu)效應(yīng)：

18、調(diào)節(jié)因子與別構(gòu)酶調(diào)節(jié)中心結(jié)合后，使酶分子的構(gòu)象得到穩(wěn)定或發(fā)生變化，從而使酶的活性得到穩(wěn)定或發(fā)生變化，這種效應(yīng)叫別構(gòu)效應(yīng)。已知?jiǎng)e構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 有多個(gè)亞基、有四級結(jié)構(gòu)； 除了有可以結(jié)合底物的酶的活性中心之外，還有可以結(jié)合調(diào)節(jié)物的別構(gòu)中心，而且，這兩個(gè)中心位于酶蛋白的不同部位上，或處在不同的亞基上（如ATCase），或處在同一個(gè)亞基的不同部位上。調(diào)節(jié)物：底物同促效應(yīng) 其它分子異促效應(yīng) 多數(shù)別構(gòu)酶具同異促效應(yīng)協(xié)同效應(yīng)：底物與一個(gè)亞基結(jié)合后，會(huì)影響后續(xù)亞基對底物親和力的現(xiàn)象。正協(xié)同效應(yīng)：底物與一個(gè)亞基結(jié)合后，會(huì)增加后續(xù)亞基對底物的親和力，即酶對底物的親和力是迅速增加的。負(fù)協(xié)同效應(yīng)：底物與一個(gè)亞基結(jié)合

19、后，會(huì)減小后續(xù)亞基對底物的親和力，即酶對底物的親和力是迅速減小的。別構(gòu)調(diào)節(jié)動(dòng)力學(xué)大部分變構(gòu)酶的初速度-底物濃度的關(guān)系不符合典型的米氏方程，即不是簡單的雙曲線，而是呈S型的v-S曲線。變構(gòu)酶作用特點(diǎn)：正協(xié)同效應(yīng)的變構(gòu)酶其速度-底物濃度曲線呈S形，如大腸桿菌的天冬氨酸轉(zhuǎn)甲?；福ˋTCase）對底物天冬氨酸的結(jié)合表現(xiàn)為正協(xié)同效應(yīng)。負(fù)協(xié)同效應(yīng)的變構(gòu)酶其速度-底物濃度曲線為類似雙曲線。如3-磷酸甘油醛脫氫酶對NAD+的結(jié)合為負(fù)協(xié)同效應(yīng)。別構(gòu)酶性質(zhì)（動(dòng)力學(xué)性質(zhì)）生理意義：這種S型的反應(yīng)體現(xiàn)為當(dāng)?shù)孜餄舛劝l(fā)生較小變化時(shí)，別構(gòu)酶可以極大程度的控制著反應(yīng)速度，這就是別構(gòu)酶可以靈敏地調(diào)節(jié)酶反應(yīng)速度的原因所在，即正

20、協(xié)同效應(yīng)使得酶的反應(yīng)速度對底物濃度的變化極為敏感。另有一類具有負(fù)協(xié)同效應(yīng)的酶，在這種曲線中，在底物濃度較低的范圍內(nèi)酶活力上升很快，但繼續(xù)下去，底物濃度雖有較大提高，但反應(yīng)速度升高卻較小，也就是說負(fù)協(xié)同效應(yīng)可以使酶的反應(yīng)速度對外界環(huán)境中底物濃度的變化不敏感。變構(gòu)調(diào)節(jié)的機(jī)制：變構(gòu)酶一般是多亞基構(gòu)成的聚合體，一些亞基為催化亞基，另一些亞基為調(diào)節(jié)亞基。當(dāng)調(diào)節(jié)亞基或調(diào)節(jié)部位與變構(gòu)劑結(jié)合后，就可導(dǎo)致酶的空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而導(dǎo)致酶的催化活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變而致酶活性的改變。 別構(gòu)酶調(diào)節(jié)的兩種模型:齊變模型（MWC）： 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。 SSSSSSSSSST狀態(tài)

21、（對稱亞基）R狀態(tài)（對稱亞基）SSSS對稱亞基對稱亞基齊步變化序變模型（KNW）：1966年由Koshland、Nemethy和Filmer 提出。SSSSSSSSSSSSSS亞基全部處于R型亞基全部處于T型依次序變化ATCase的三維結(jié)構(gòu)典型的別構(gòu)酶-天冬氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶 ATCase，同時(shí)具有同促和異促效應(yīng)12條亞基組成: 6條催化亞基，6條調(diào)節(jié)亞基酶結(jié)合構(gòu)象：每3個(gè)催化亞基形成2個(gè)二聚體；每2個(gè)調(diào)節(jié)亞基形成3個(gè)而聚體。產(chǎn)物：CTP 激活劑：ATP 抑制劑：CTP酶原激活概念：在酶的催化下，無活性的酶的前體（酶原）轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚悦傅倪^程。如：胰蛋白酶原的激活過程。激活機(jī)理：在酶的催化下，切去酶

22、原多余的肽段，使之成為有活性的酶原因：形成酶的活性中心生物學(xué)意義：保護(hù)產(chǎn)生酶原的組織，是生物自我保護(hù)的一種方法；也是酶活性的一種調(diào)節(jié)方式。 消化系統(tǒng)其它蛋白水解酶原的激活胃蛋白酶原 由胃壁細(xì)胞分泌出來，在胃酸H+作用下，低于pH5時(shí)，酶原自動(dòng)激活，失去44個(gè)氨基酸殘基，轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨人嵝缘?，有活性的胃蛋白?。胰蛋白酶原 進(jìn)入小腸后，在有Ca2+的環(huán)境中受到腸激酶的激活，賴氨酸-異亮氨酸之間的肽鍵被打斷，水解失去一個(gè)6肽，使構(gòu)象發(fā)生一定變化后，成為有活性的胰蛋白酶胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作用。胰蛋白酶對各種胰臟蛋白酶的激活作用3、共價(jià)修飾調(diào)節(jié) 酶分子在別的酶的催化下共價(jià)結(jié)合或脫去一個(gè)基團(tuán)，使

23、酶分子的活性產(chǎn)生或者喪失，這種調(diào)節(jié)方式叫共價(jià)修飾調(diào)節(jié)，這種酶叫共價(jià)修飾調(diào)節(jié)酶。 第一種類型是磷酸化酶及其他的一些酶，它們通過接受ATP轉(zhuǎn)來的磷酸基的共價(jià)修飾，或脫下磷酸基，來調(diào)節(jié)酶活性： 酶的無活性形式 酶的有活性形式 如：糖原磷酸化酶催化的反應(yīng)為： 糖原 + Pi G1P第二種類型是大腸桿菌谷氨酰胺合成酶及其他一些酶，它們受ATP轉(zhuǎn)來的酰苷酰基的共價(jià)修飾，或酶促脫酰苷?；?，而調(diào)節(jié)酶活性： 酶的活性較高形式 酶的活性較低形式 谷氨酸 + ATP + NH3 谷氨酰胺 + ADP + Pi如：大腸桿菌谷氨酰胺合成酶，它催化的反應(yīng)為：真核生物的共價(jià)修飾方式主要是磷酸化/脫磷酸化，修飾以后有的酶為活

24、性狀態(tài)，而有的酶為無活性狀態(tài)。糖原磷酸化酶是磷酸化后有活性，丙酮酸脫羧酶是脫磷酸化有活性。原核生物的共價(jià)修飾方式主要為腺苷化/脫腺苷化。同工酶 概念：催化反應(yīng)相同，結(jié)構(gòu)性質(zhì)不同的一類酶 如：過氧化物酶催化的反應(yīng)，該酶是一組數(shù)目較多的同工酶 AH2 + H2O2 A + 2H2O 產(chǎn)生原因：不同的基因產(chǎn)生不同的肽，如酶是單體酶，則每個(gè)肽就是一個(gè)同工酶，或者酶是多亞基的，不同亞基相互組合，就形成了不同的同工酶，如：乳酸脫氫酶，由兩個(gè)基因（H、M）指導(dǎo)合成，則有H、M兩種亞基，他們之間相互組合，就會(huì)出現(xiàn)五種同工酶。5、通過聚合（結(jié)合）解離進(jìn)行的調(diào)節(jié) 寡聚酶聚合（結(jié)合）解離對酶活性的調(diào)節(jié)作用 例如：（

25、乙酰CoA羧化酶） 第三節(jié) 酶活力的測定 定性鑒定提取物中某一酶是否存在，一般是根據(jù)此酶引起的化學(xué)反應(yīng)來判斷，如檢驗(yàn)在提取物中是否存在淀粉酶。則用提取物與淀粉反應(yīng)，一段時(shí)間以后，用碘-碘化鉀與反應(yīng)液反應(yīng)，若變藍(lán)，說明提取物無淀粉酶活力；反之，提取物有淀粉酶的活力。 酶活力的測定：實(shí)際上是酶定量測定的方法，酶制劑因含雜質(zhì)多易失活等原因，故不能用稱重或測量體積來定量。（一）酶活力的概念： 指酶催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小通常用在一定條件下酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。 速度表示法常用-dS/dt或dP/dt，測初速度，多用后者。因?yàn)榉磻?yīng)初期底物過量，底物的減少量不容易測定，而產(chǎn)物從無到有，

26、易測定。 （二）酶的活力單位： 酶的國際單位（IU）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度25）下，每分鐘內(nèi)催化1微摩爾（mol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或1分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為1標(biāo)準(zhǔn)單位。 測定條件：最佳的反應(yīng)條件，如最適的T（或25）、最適pH、S E、初速度下。 Katal(Kat)：在最適溫度下，每秒鐘能催化1摩爾底物轉(zhuǎn)化的酶量定義為 1 Kat。1 Kat=60106 IU 酶的比活力： 每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。 對固體酶：用活力單位/mg酶蛋白或活力單位/mg酶蛋白氮來表示； 對液體酶：用活力單位/ml酶液來表示。 很明顯，比活力越大，酶越純。、回收率和純化倍數(shù)

27、 每次總活力 每次比活力回收率 第一次總活力 100 純化倍數(shù) 第一次比活力 酶的回收率和純化倍數(shù)的測定常在酶分離過程中的每個(gè)環(huán)節(jié)中進(jìn)行。一個(gè)正常、合理的純化程序，隨著純化的進(jìn)行，總蛋白量逐漸減少，比活力不斷增加，純化倍數(shù)提高了，但回收率降低。（五）酶活力的測定方法1、分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì)或產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法。2、測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。3、滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。4、熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑，反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。5、旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。 除了以上方法外，還可根據(jù)產(chǎn)物的性質(zhì)采用其它方法。酶活力測

28、定的注意事項(xiàng)：測定的酶反應(yīng)速度必須是初速度。底物濃度、輔因子的濃度必須大于酶濃度。反應(yīng)必須在酶的最適條件下進(jìn)行。第四節(jié) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究酶促反應(yīng)的速度以及影響酶反應(yīng)速度的各種因素的科學(xué)。意義：1）研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系及作用機(jī)制。2）發(fā)揮酶催化反應(yīng)的高效率，尋找最有利的反應(yīng)條件。3）了解酶在代謝中的作用和某些藥物的作用機(jī)制。酶的動(dòng)力學(xué)研究包括哪些內(nèi)容 ? 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)以化學(xué)動(dòng)力學(xué)為基礎(chǔ)，通過對酶促反應(yīng)速度的測定來討論諸如底物濃度、抑制劑、溫度、pH和激活劑等因素對酶促反應(yīng)速度的影響。 溫度、pH及激活劑都會(huì)對酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生十分重要的影響，酶促反應(yīng)不但需要最適溫度和最適

29、pH，還要選擇合適的激活劑。而且在研究酶促反應(yīng)速度以及測定酶的活力時(shí)，都應(yīng)選擇相關(guān)酶的最適反應(yīng)條件。酶催化反應(yīng)速度如果我們以產(chǎn)物生成量(或底物減少量)來對反應(yīng)時(shí)間作圖，便可得到如圖所示的曲線圖。影響酶催化的各種因素： 酶的催化作用受到底物濃度、酶濃度、溫度、pH值、激活劑濃度、抑制劑濃度等諸多因素的影響。 引起酶促反應(yīng)速度隨反應(yīng)時(shí)間延長而降低的原因很多，因此在測定酶活力時(shí)，應(yīng)測定酶促反應(yīng)的初速度，從而避免各種復(fù)雜因素對反應(yīng)速度的影響。一、底物濃度對反應(yīng)速度的影響 中間絡(luò)合物學(xué)說（E+S=ES=E+P） 在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖實(shí)驗(yàn)研究化學(xué)反應(yīng)中底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，

30、當(dāng)酶濃度不變時(shí)，可以測出一系列不同底物濃度下的化學(xué)反應(yīng)速度，以該反應(yīng)速度對底物濃度作圖，可得到如圖所示的曲線。酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程式-米氏方程米式方程的導(dǎo)出：首先假設(shè)：1. 反應(yīng)在最適條件下進(jìn)行；2. pH、溫度和酶的濃度是固定的，變化的是底物濃度；3. 反應(yīng)在起始階段，逆反應(yīng)可忽略 ；4. 反應(yīng)體系處在穩(wěn)態(tài)。米氏常數(shù)的意義1）物理意義： Km值等于酶反應(yīng)速度為最大速度一半時(shí)的底物濃度。2）Km 值愈大，酶與底物的親和力愈小；Km值愈小，酶與底物親和力愈大。酶與底物親和力大，表示不需要很高的底物濃度，便可容易地達(dá)到最大反應(yīng)速度。如己糖激酶的兩個(gè)底物Km分別是葡萄糖1.510-4，果糖： 1.51

31、0-3，這樣葡萄糖為該酶的最適底物。（3）Km 值是酶的特征性常數(shù)，只與酶的性質(zhì)，酶所催化的底物和酶促反應(yīng)條件(如溫度、pH、有無抑制劑等)有關(guān)，與酶的濃度無關(guān)。酶的種類不同，Km值不同，同一種酶與不同底物作用時(shí)，Km 值也不同。各種酶的 Km 值范圍很廣，大致在 10-110-6 M 之間。Km在實(shí)際應(yīng)用中的重要意義鑒定酶：通過測定可以鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段、不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶。（2）判斷酶的最佳底物：如果一種酶可作用于多個(gè)底物，就有幾個(gè)Km值，其中Km最小對應(yīng)的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解(Km=28mmol/L)，也可催化棉子

32、糖水解(Km=350mmol/L)，兩者相比，蔗糖為該酶的天然底物。（3）計(jì)算一定速度下的底物濃度：如某一反應(yīng)要求的反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度的99%，則S=99Km（4）了解酶的底物在體內(nèi)具有的濃度水平：一般地，體內(nèi)酶的天然底物的S體內(nèi)Km，如果S體內(nèi) Km，那么V Km，那么VVmax，底物濃度失去生理意義，也不符合實(shí)際狀態(tài)。5）判斷反應(yīng)方向或趨勢：催化正逆反應(yīng)的酶，其正逆兩向的反應(yīng)的Km不同，如果正逆反應(yīng)的底物濃度相當(dāng)，則反應(yīng)趨向于Km小對應(yīng)底物的反應(yīng)方向。（6）通過測定某些物質(zhì)對Km的影響判斷這些物質(zhì)可能的生理效應(yīng)： Km升高，競爭性抑制；Km不變，非競爭性抑制；Km降低，反競爭性抑制；

33、米氏常數(shù)的求法：雙倒數(shù)作圖法Ev二、酶濃度對酶促反應(yīng)速度的影響： E 與 v 成正比在一定溫度和pH下，酶促反應(yīng)在底物濃度大于100 Km時(shí)，速度與酶的濃度呈正比。溫度對酶促反應(yīng)速度的影響 最適溫度不是酶的特征常數(shù)，因?yàn)橐环N酶的最適溫度不是一成不變的，它要受到酶的純度、底物、激活劑、抑制劑、酶反應(yīng)時(shí)間等因素的影響。因此，酶的最適溫度與其它反應(yīng)條件有關(guān)。溫度對酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1. 溫度影響反應(yīng)體系中的活化分子數(shù)：溫度增加，活化分子數(shù)增加，反應(yīng)速度增加。2. 溫度影響酶的活性：過高的溫度使酶變性失活，反應(yīng)速度下降。四、pH對酶促反應(yīng)速度的影響pH對酶促反應(yīng)速度的影響機(jī)理：1、pH影響酶和底

34、物的解離: 酶的活性基團(tuán)的解離受pH影響，底物有的也能解離，其解離狀態(tài)也受pH的影響，在某一反應(yīng)pH下，二者的解離狀態(tài)最有利于它們的結(jié)合，酶促反應(yīng)表現(xiàn)出最大活力，此pH稱為酶的最適pH；當(dāng)反應(yīng)pH偏離最適pH時(shí)，酶促反應(yīng)速度顯著下降。2、pH影響酶分子的構(gòu)象：過高或過低pH都會(huì)影響酶分子活性中心的構(gòu)象，或引起酶的變性失活。五、激活劑對酶促反應(yīng)速度的影響1. 概念：凡能提高酶活性的物質(zhì)為激活劑2.種類 （1）無機(jī)離子 作用機(jī)理：a. 穩(wěn)定構(gòu)象，如Ca是淀粉酶的激活劑，它緊密地與酶分子結(jié)合，從而穩(wěn)定了酶的高活力構(gòu)象。b. 結(jié)合底物，如Mg是ATP酶的激活劑，它可以將ATP的磷酸鏈結(jié)合于酶分子。c.

35、 調(diào)節(jié)作用（2） 有機(jī)分子 作用機(jī)理：a.保護(hù)作用，如谷胱甘肽可以-SH的還原狀態(tài)， EDTA可以絡(luò)合重金屬離子。2GSH + SS GSSG + 2SH b. 調(diào)節(jié)作用，如ADP是多種需能、放能反應(yīng)中酶的調(diào)節(jié)劑（3） 蛋白分子 調(diào)節(jié)分子 六、抑制劑對酶促反應(yīng)速度的影響 可以降低酶活性的物質(zhì)稱為抑制劑第五節(jié) 酶的抑制作用一 、降低酶催化反應(yīng)速度的因素 1、失活作用 失活作用是指由于一些物理因素和化學(xué)試劑部分或全部破壞了酶的三維結(jié)構(gòu)，即引起酶蛋白變性，導(dǎo)致部分或全部喪失活性。 2、抑制作用 抑制作用是指在酶不變性的情況下，由于必需基團(tuán)或活性中心化學(xué)性質(zhì)的改變而引起的酶活性的降低或喪失。 3、去激

36、活作用 去激活作用，某些酶只有在金屬離子存在下才有活性，去除金屬離子也會(huì)引起這些酶活性的降低或喪失。4、阻遏作用 阻遏作用指某些因素（如激素或藥物等）使細(xì)胞內(nèi)酶蛋白的合成減少，反應(yīng)速度的降低是由于酶分子數(shù)量的減少，每分子酶的催化效力并無變化。二、抑制程度的表示 一般用反應(yīng)速度的變化來表示。若以不加抑制劑時(shí)的反應(yīng)速度為 Vo，加入抑制劑后的反應(yīng)速度為Vi，則酶的抑制程度有下列幾種表示方法： 1 相對活力分?jǐn)?shù)（殘余活力分?jǐn)?shù)） a=Vi/Vo2 相對活力百分?jǐn)?shù)（殘余活力百分?jǐn)?shù)） a%=Vi/Vo*100%3 抑制分?jǐn)?shù) 指被抑制而失去活力的分?jǐn)?shù) i=1-a=1-Vi/Vo4 抑制百分?jǐn)?shù) i%=(1-a

37、)*100%=(1-Vi/Vo)*100% 通常所謂抑制率是指抑制分?jǐn)?shù)或抑制百分?jǐn)?shù)。 三、 抑制作用的分類 不可逆抑制作用；可逆抑制作用 Vmax v = 1 + Km + KmI + I S Ki S Ki可逆抑制：這類抑制劑與酶分子以弱的作用力（弱離子鍵、氫鍵等）結(jié)合，使酶失活，但抑制劑容易被清除而使酶恢復(fù)活性，故稱為可逆抑制。（一） 競爭性抑制作用1、競爭性抑制作用的含義競爭性抑制：I與S相似，競爭活性中心，增加S去除抑制 。 Vmax Sv = Km ( 1 + I / Ki ) + S特點(diǎn)： 抑制劑I與底物S在化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，能與底物S競爭酶E分子活性中心的結(jié)合基團(tuán)。抑制程度取決于抑

38、制劑與底物的濃度比、ES和EI的相對穩(wěn)定性； 加大底物濃度，可使抑制作用減弱甚至消除。 2、競爭性抑制作用的機(jī)理抑制劑與底物在結(jié)構(gòu)上有類似之處；可能結(jié)合在底物所結(jié)合的位點(diǎn)（如結(jié)合基團(tuán)）上，從而阻斷了底物和酶的結(jié)合；降低酶和底物的親和力3、競爭性抑制作用舉例 舉例某些藥物或體內(nèi)代謝物對酶的競爭性抑制作用磺胺類藥物的抑菌機(jī)理4、過渡態(tài)的類似物作為競爭性的抑制劑 所謂過渡態(tài)底物是指底物和酶結(jié)合成中間復(fù)合體后被活化的過渡形式，一般用S*表示，由于其能障小，和酶結(jié)合就緊密得多。（二）、 非競爭性抑制非競爭性抑制：I和S與E的結(jié)合完全互不相關(guān)，既不排斥，也不促進(jìn)結(jié)合，I可以和E結(jié)合生成EI，也可以和ES復(fù)

39、合物結(jié)合生成ESI。S和E結(jié)合成ES后，仍可與I結(jié)合生成ESI，但一旦形成ESI復(fù)合物，再不能釋放形成產(chǎn)物P。特點(diǎn)： I和S在結(jié)構(gòu)上一般無相似之處，I常與酶分子上結(jié)合基團(tuán)以外的化學(xué)基團(tuán)結(jié)合，這種結(jié)合并不影響底物和酶的結(jié)合，增加底物濃度并不能減少I對酶的抑制。 非競爭性抑制劑的雙倒數(shù)曲線：不影響酶促反應(yīng)的Km值，而使Vmax值變小。非競爭性抑制作用的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)是Vmax變小，而Km不變。2、非競爭性抑制作用的機(jī)理競爭性抑制的機(jī)理抑制劑與底物在結(jié)構(gòu)上可能毫不相關(guān)；不是結(jié)合在底物所結(jié)合的位點(diǎn)上，而是結(jié)合到其它的必需基團(tuán)（如催化基團(tuán)）上，阻止酶的催化作用；不降低酶和底物的親和力。非競爭性抑制舉例（三）

40、、反競爭性抑制反競爭抑制：只有形成ES后I才能作用，該抑制劑與單獨(dú)的酶不結(jié)合。 酶S酶SI酶IS+2、反競爭性抑制作用的機(jī)理反競爭性抑制的機(jī)理抑制劑不能與未結(jié)合底物酶分子結(jié)合；不能通過增加底物來減輕抑制程度3、反競爭性抑制舉例單底物酶：如芳香基硫酸基的肼解 ；氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用多底物：如雙底物乒乓機(jī)制中，任何一個(gè)底物的競爭性抑制劑也是另一底物的反競爭性抑制劑。 （四）、其他可逆抑制1、部分抑制 部分抑制：假如混合型抑制中ESI復(fù)合物也能釋放產(chǎn)物即為部分抑制。 2、底物抑制3、產(chǎn)物抑制 產(chǎn)物對酶反應(yīng)的抑制作用在生物體中較為常見，在細(xì)胞內(nèi)，酶反應(yīng)的產(chǎn)物雖然不斷被另外的酶作用，但S和P總是

41、同時(shí)存在的，因此，考慮產(chǎn)物對反應(yīng)速度的影響，可能具有一定的意義。不可逆抑制：這類抑制劑與酶分子以很強(qiáng)的作用力（共價(jià)鍵、強(qiáng)離子鍵等）結(jié)合，使酶失活，且抑制劑不易被清除而使酶恢復(fù)活性。（一）、非專一性的不可逆抑制作用概念：抑制劑能和酶上的一類或幾類基團(tuán)反應(yīng)，如氨基、羧基、巰基等。如碘代乙酸 : 酶SH + ICH2COOH 酶CH2COOH +HI有機(jī)磷殺蟲劑抑制昆蟲的乙酰膽堿酯酶作用方式非專一性不可逆抑制種類:有機(jī)磷化物(作用于羥基酶)：如 敵敵畏，敵百蟲，有機(jī)汞化物(作用于巰基)：如 對氯汞苯甲酸(PCMB) p375有機(jī)砷化物(作用于巰基) ：如 Lewisite毒氣(CHCl = CHCA

42、s Cl2)重金屬鹽 ；烷化劑；氰化物、硫化物、一氧化氮（作用于酶中的金屬離子）、 專一性不可逆抑制劑專一性不可逆抑制：這類抑制劑只與一定酶活性中心的特定基團(tuán)起作用，對酶有專一性的抑制作用。1、 Ks型結(jié)合型專一性不可逆抑制劑 Ks型不可逆抑制劑具有底物類似的結(jié)構(gòu)，與酶分子中的必需基團(tuán)結(jié)合抑制酶活性。通過改變酶的親和力對酶進(jìn)行親和標(biāo)記 -稱親和標(biāo)記試劑。舉例： 對甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮抑制胰凝乳蛋白酶2、Kcat型催化型不可逆抑制劑（自殺底物） kcat型不可逆抑制劑 既是天然底物的類似結(jié)構(gòu)，又是酶的底物。專一性高的不可逆抑制劑 。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用 農(nóng)藥殺蟲的機(jī)理-抑制生物體中的靶酶。例

43、如：有機(jī)磷的殺蟲原理主要是：膽堿對生物體神經(jīng)突觸后膜上的乙酰膽堿酶（ACHE）的抑制，造成突觸間隙乙酰膽堿的積蓄，持續(xù)地作用于受體，引起一系列反應(yīng)、使病蟲神經(jīng)過度興奮而死亡 。工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用 食品加工過程中由于多酚氧化酶的作用，發(fā)生酶促褐變，使果蔬類加工食品貨架壽期縮短。多酚氧化酶是含銅金屬蛋白，因而許多金屬螯合劑是其抑制劑。第六節(jié) 酶的分離純化分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)、核酸，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。醫(yī)療的需要：如

44、用豬胰島素治療糖尿病。基因工程的需要分離純化的要求純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、回收率：希望回收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般可分為以下幾個(gè)階段： 材料的選擇和預(yù)處理 破碎細(xì)胞及提取 分離純化：包括粗分級分離和細(xì)分級分離其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處

45、理。酶分離純化的基本原則 A 切記大部分酶是蛋白質(zhì)，防止酶變性失活 a.低溫 b. 一般中性，10不穩(wěn)定，局部酸、堿過高 c.蛋白變性（溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作時(shí)要盡量減少泡沫的形成） d.重金屬，有機(jī)溶劑，微生物及蛋白酶污染 B 選擇有效的純化方法 a.容許在不破壞待純化的“目的酶”限度內(nèi)，手段可激烈一些。 b.首選親和分離法。 C 跟蹤酶分離每一步的總活力和比活力，判別每步方法的可行性一、酶的提取、分離純化技術(shù)路線酶分離純化不同階段粗蛋白質(zhì): 采樣 均質(zhì)打破細(xì)胞 抽出全蛋白，多使用鹽析沉淀法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2) 部分純化 : 初步的純化，使用各鐘 柱層析法

46、。(3) 均質(zhì)酶 : 目標(biāo)酶的進(jìn)一步精制純化，可用制備式電泳或HPLC。酶的抽提幾個(gè)環(huán)節(jié)：預(yù)處理- 抽提-純化-酶的制品1.預(yù)處理 目的：酶從生物樣品中拿出來 動(dòng)、植物組織 絞肉機(jī)切碎， 高速組織搗碎機(jī)，局部高溫 加沙研磨，注意吸附 破壁：均漿器，冷熱破壁法 丙酮干粉：使用0磨碎 加-20丙酮預(yù)冷 過濾低溫干燥研磨過篩 優(yōu)點(diǎn)：破壁，去脂肪和水分，結(jié)酶溶解 缺點(diǎn)：有機(jī)溶劑不穩(wěn)定，小心酶失活，注意低溫 細(xì)菌：量少 -超聲波，溶菌酶 量多-丙酮干粉 自溶法：一定溫度，離子強(qiáng)度下保溫，或加甲苯，使菌體自溶液化 缺點(diǎn)：引入細(xì)胞其他成分，成分復(fù)雜，使分離酶失活破壞 霉菌： 機(jī)械剪切，磨碎，細(xì)胞壁用溶解酶

47、酵母： 自溶法 蝸牛酶 冷凍破壁法溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法 物理破碎化學(xué)破碎酶促破碎 細(xì)胞破碎方法及其原理通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。 有機(jī)溶劑：甲苯、丙酮表面活性劑：Triton、Tween通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎自溶法;外加酶制劑法搗碎法,研磨法,勻漿法 通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。機(jī)械破碎2.抽提 pH： 酸性蛋白- 堿性溶液 堿性蛋白- 酸性溶液 鹽： 低鹽溶液有利于酶蛋白溶解 0.020.05 M磷酸緩沖液，0.15M

48、NaCl 用檸檬酸鈉螯合金屬離子，切斷與其他物質(zhì)結(jié)合 溫度：0 4 之間，有的可以高一些（室溫） 其他：防止氧化- 加CySH， DTT，巰基乙醇； 防蛋白酶水解，加蛋白酶抑制劑(如苯甲磺酰氟)等；防止有機(jī)溶劑的影響。酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇Ｃ傅闹饕崛》椒ǎ禾崛》椒?使用的溶劑或溶液 提取對象鹽溶液 0.020.5mol/L的鹽溶液 提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液 PH26的水溶液 提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液PH812的水溶液 提取在稀堿

49、溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶劑 可與水混溶的有機(jī)溶劑 與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的酶影響酶提取的主要因素：酶所使用的溶劑中的溶解度以及酶向溶劑相中的擴(kuò)散速度。溫度、pH值、提取液體積。提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、縮短擴(kuò)散距離，增大濃度差等都有利于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還要注意控制好溫度、pH值等提取條件。3.濃縮 大體積 小體積A ）蒸發(fā) 減壓蒸發(fā)-加熱把水分蒸發(fā)，產(chǎn)生泡沫，有增色效應(yīng)，效率低 （不能用于穩(wěn)定性差的酶） 超蒸發(fā)-暖空氣流通過冷酶溶液表面，加速蒸發(fā)，效率低，有增色效應(yīng)，用的少。 薄膜蒸發(fā)

50、濃縮-在高度真空條件下將待濃縮的酶溶液變成極薄的液膜，并使之與大面積熱空氣接觸，讓其中的水分瞬時(shí)蒸發(fā)而達(dá)到濃縮的目的。 優(yōu)點(diǎn)：對熱不穩(wěn)定的酶十分有利 缺點(diǎn)：有增色效應(yīng) 工業(yè)上應(yīng)用B）超過濾： 用微孔超濾膜進(jìn)行，水分子和小分子可以透過膜，大分子被阻截。 優(yōu)點(diǎn)：沒有 I 、pH、熱、相的變化問題。起濃縮和粗分作用。 C）膠過濾： 葡聚糖Sephadex G 25， G 50，干粒狀吸水膨脹。小分子及水分子進(jìn)入膠內(nèi)，酶和大分子在膠外，達(dá)到濃縮分離的目的。方法：酶溶液中直接放入干膠，膠吸水膨脹，達(dá)到濃縮分離的目的。優(yōu)點(diǎn)：沒有pH， I 變化，條件溫和。D) 反復(fù)凍融濃縮： 溶液相對純水，會(huì)發(fā)生融點(diǎn)升高

51、，冰點(diǎn)降低。溫度 0時(shí)，水結(jié)冰，移去冰塊，酶不結(jié)冰。冰凍方法：溶液冰凍后，在室溫下緩慢溶化。不含蛋白和酶的冰塊就浮于液面，酶則溶解于下層溶液（酶先溶解1/4體積時(shí)傾出水分）。先讓酶溶液緩緩凍凝，再移去形成的冰塊。E) 聚乙二醇：適合于少量樣品，而且成本高。二、酶的分離方法分離純化實(shí)質(zhì)：在抽提（濃縮）溶液中，其成分多而雜的情況下，要去除需要分離的酶以外的組分，從而獲得高純度的酶液。 分離純化過程中應(yīng)注意的問題工作前應(yīng)對所要純化的酶的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性有一個(gè)全面的了解。判斷選擇的方法和條件是否適當(dāng)，始終應(yīng)以活力測定為準(zhǔn)則。嚴(yán)格控制操作條件，以保證重復(fù)率，防止酶的變性失效。1、沉淀分離沉淀分離是通過改

52、變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。鹽析法： 鹽離子與水分子作用，原來溶液中大部分的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層，暴露出來的蛋白質(zhì)表面疏水性區(qū)域相互結(jié)合，形成沉淀。 在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。1）在鹽析

53、條件下，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液的離子強(qiáng)度間的關(guān)系 ： 鹽析常數(shù): 由蛋白質(zhì)性質(zhì)、鹽種類決定 log S=- KI 蛋白質(zhì)溶解度 蛋白質(zhì)在純水( I = 0 )中的溶解度 鹽析常數(shù)離子強(qiáng)度2）成功的關(guān)鍵 ：pH： = 等電點(diǎn) （pI ） 蛋白質(zhì)濃度： 1000ug/ml， 沉淀快 鹽：K越大，效果越好。就陽離子而言，一價(jià)鹽比二價(jià)鹽好；而陰離子則相反。 溫度：在 4左右進(jìn)行。 鹽析操作：鹽析沉淀至少1小時(shí)，鹽析后沉淀的母液應(yīng)盡量除去。 有機(jī)溶劑沉淀： 降低水溶液的介電常數(shù)，增加蛋白質(zhì)不同電荷之間的靜電引力，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀；有機(jī)溶劑與水作用使蛋白質(zhì)的表面水化層厚度壓縮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫水，蛋白質(zhì)間的疏水

54、作用增強(qiáng)，從而產(chǎn)生沉淀。有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在會(huì)使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20時(shí)水的介電常數(shù)為80，而82乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對于具有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀處理時(shí)應(yīng)考慮的因素：1）溫度 0下操作。常用丙酮，還有甲醇，乙醇等， 有機(jī)溶劑先在-1520下預(yù)冷，沉淀后立即在低溫下離心分離。 2）pH = pI 3）離子和離子強(qiáng)度：中性鹽通常能增大蛋白質(zhì)的溶解度，并能減少變性影響。但鹽濃度不宜超過0.

55、05mol/L，否則沉淀不好，甚至沉淀全無，高耗有機(jī)溶劑。4）有機(jī)溶劑：丙酮分離效果最好，引起失效也較少。優(yōu)點(diǎn):分辯率高且易去除，與pI 同時(shí)使用，用于酶粗分缺點(diǎn)：對有機(jī)溶劑不穩(wěn)定的酶，容易變性。 多價(jià)陽離子效應(yīng)：在向酶溶液中加入有機(jī)溶劑時(shí)，可將溶液的pH調(diào)整到略高于目的蛋白的pI，使之帶負(fù)電荷，然后再添加少量（0.0050.02mol/L）的多價(jià)陽離子，由于這些離子能和陰離子蛋白質(zhì)形成絡(luò)合物，降低其溶解度，從而可減少有機(jī)溶劑的用量，同時(shí)提高分離的分辨率。等電點(diǎn)沉淀 在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度最小，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子會(huì)破壞這些吸引力，使分子散開，溶入水中。

56、等電點(diǎn)沉淀原理： 溶解度隨分子間引力增大而減小，其他條件相同時(shí)，pH在等電點(diǎn)附近時(shí)，分子引力最大，蛋白質(zhì)就沉淀。一般不單獨(dú)使用，配合其他方法使用。 共沉淀法: 利用離子聚合物（SDS），非離子聚合物(聚乙二醇，聚乙烯亞胺，單寧酸) 等，在一定條件下與蛋白質(zhì)直接或間接形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)、酶一起沉淀，再用適當(dāng)方法把酶溶解下來。 PEI（聚乙烯亞胺） + 菌體超聲上清液（酶） 0.2M KCl (DNA）-PEI - 雜蛋白質(zhì)和酶沉淀 0.6M KCl EcoRI(酶)被溶解下來 + (DNA)-PEI -雜蛋白沉淀，不溶解 選擇性沉淀法： 多聚電解質(zhì)，如聚丙烯酸（PAA）等雜多酸，在低濃度時(shí)，選

57、擇性地與某種（某類）酶絡(luò)合沉淀。 聚乙二醇（ PEG ）沉淀： 為水溶性非離子型聚合物，方法同(NH4)2SO4，但與PEG分子量有關(guān)系。2、離心分離 離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。 常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī), 其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，相對離心力（RCF）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。密度梯度(區(qū)帶)離心 高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)

58、速為（12.5）104 r/min ，相對離心力達(dá)到 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中，溫度升高而造成酶的變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置，謂之高速冷凍離心機(jī)。超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá) (2.512)104 r/min，相對離心力可以高達(dá) 5105 g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。蛋白質(zhì)分子在離心時(shí)，其分子量、分子密度、組成、形狀等，均會(huì)影響其沉降速率，沉降系數(shù) 即用來描述此沉降性質(zhì)； 其單位為 S 。每一種的沉降系數(shù)

59、與其分子密度或分子量成正比。不同沉降系數(shù)的蛋白質(zhì)，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。 蛋白質(zhì)顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各種蛋白質(zhì)在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。 密度梯度常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度。蔗糖便宜，純度高，濃溶液(60%，W/W)密度可達(dá)1.28 g/cm3。密度梯度在離心管內(nèi)的分布是管底的密度最大，向上逐漸減小 過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)

60、金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。 非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)過濾 膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。 膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆粒或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。4、層析分離 (1)、層析的原理: 層析技術(shù)是一組相關(guān)分離方法的總稱，當(dāng)待分離的混合物隨流動(dòng)相通過固定相時(shí)，由于各組份的理化