第8章.色譜法概論（新）

1、第9章 色譜法概論 （Chromatography） 9-1 色譜法的起源、歷程及分類9-2 色譜過程與術(shù)語色譜法是什么樣的方法呢？ 類似于經(jīng)典的分離方法，如 1.沉淀法：利用各組分溶解度的差異而進(jìn)行分離。 2. 蒸餾法：利用各組分沸點(diǎn)的差異進(jìn)行分離。 3. 萃取法：利用各組分在水相和有機(jī)相（互不相溶） 的兩相）中分配系數(shù)的差異進(jìn)行而分離。 定義：色譜法是一種物理或物理化學(xué)分離分析方法。 它是利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)的不同，在流動(dòng)相流經(jīng)固定相時(shí)，由于各組分在兩相間的吸附、分配或其它親和力的差異而產(chǎn)生不同速度的遷移，最終達(dá)到相互分離的目的。 色譜法已廣泛用于各個(gè)領(lǐng)域，是多組分混合物首選的分離分析方

2、法。以中國藥典2005版為例，一部收載中藥1146個(gè)品種，用薄層色譜進(jìn)行鑒別或含量測定的有1523項(xiàng)，用高效液相色譜進(jìn)行定量分析的有479種518項(xiàng)，用氣相色譜進(jìn)行檢測的有47種。二部收載的有1967個(gè)品種，采用高效液相色譜法的品種有848種?，F(xiàn)在色譜法已形成一門專門的科學(xué)。 9-1 色譜法的起源、歷程及分類一、色譜法的起源 1903年3月21 日俄國植物學(xué)家茨維特 Michael Tswett（1872-1919）他為了分離植物色素，將植物綠葉的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣粉末的玻璃管中，并用石油醚自上而下淋洗，由于不同的色素在碳酸鈣顆粒表面的吸附力不同，隨著淋洗的進(jìn)行，不同色素向下移動(dòng)的速度

3、不同，形成一圈圈不同顏色的色帶，使各色素成分得到了分離。他將這種分離方法命名為色譜法（chromatography）。石油醚(流動(dòng)相)色譜帶碳酸鈣粉末(固定相)植物葉提取液碳酸鈣粉末（固定相）色素混合液石油醚 (流動(dòng)相）色譜柱色帶色譜色：顏色譜：圖譜1903年，Tsweet發(fā)明的色譜法植物色素分離圖示二、色譜法的歷程1938年：Izmailov等人將糊狀A(yù)l2O3漿液在玻璃板上鋪成均勻薄層，用于分離植物中的藥用成分，即今日用的薄層色譜。（用于薄層的材料已發(fā)展至多種：如硅酸、聚酰胺等）。 1931年 Kuhn 等用氧化鋁和碳酸鈣分離了 -,- ,-胡蘿卜素 等60 多種植物色素1944年：Con

4、sden，Gordon和Martin將纖維（濾紙）作固定載體，以水吸附在濾紙上作溶劑，根據(jù)組分在兩相中溶解度不同，即滲透率（速率）不同而使各組分彼此分離，稱之為紙色譜法。1952年：Martin和Synge又研究成功了在惰性載體表面涂漬一層均勻的有機(jī)化合物膜作為固定相，并以氣體為流動(dòng)相，用來分離脂肪酸混合物即今日的氣液色譜。1941 年 Martin 和 Synge建立了液液分配色譜法并 提出氣相色譜的設(shè)想 在色譜發(fā)展史上占有重要地位的英國人A.J. P. Martin(馬丁)和R.L.M. Synge(辛格)，他們提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣體可作為流動(dòng)相（即氣相色譜）。

5、1952年，因?yàn)樗麄儗Ψ峙渖V理論的貢獻(xiàn)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1937-1972年，15年中有12個(gè)Nobel獎(jiǎng)是有關(guān)色譜研究的！1955年第一臺(tái)商品GC問世；標(biāo)志現(xiàn)代色譜分析的建立。1957年：Golay首先應(yīng)用小口徑毛細(xì)管柱進(jìn)行色譜分離實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明了它具有高分辨率和高效能 即為今日的高效毛細(xì)管氣相色譜法。1959年：Porath和Flodin提出了使用具有化學(xué)惰性的多孔凝膠作固定相的空間排阻色譜法，根據(jù)固定相孔隙尺寸不同而具有不同的選擇性滲透能力，從而對分子量分布不同的樣品實(shí)現(xiàn)了分離?？捎糜跍y定聚合物的相對分子質(zhì)量的的分布。60年代末，出現(xiàn)了HPLC；80年代，超臨界流體色譜；Jorgeson

6、 發(fā)展了毛細(xì)管電泳90 年代后期毛細(xì)管電色譜21 世紀(jì) ，出現(xiàn)了UPLC；使得色譜柱的分離效率、檢測靈敏度大大提高，分析時(shí)間大大縮短，分離分析的成本大幅下降。 我國在色譜分析領(lǐng)域的研究起于1954年，由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所首先開發(fā)。經(jīng)過幾十年的努力，我國色譜基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用技術(shù)研究方面具有特色，居世界領(lǐng)先行列。色譜法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣”缺點(diǎn)：高選擇性、高效能 、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用范圍廣有效分離的量少對未知物分析的定性專屬性差1按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動(dòng)相 固定相 色譜類型液相色譜液體 固體 液-固色譜液體 液體 液-液色譜氣體 固體 氣-固色譜氣體 液體

7、 氣-液色譜氣相色譜三、色譜法的分類2按分離機(jī)制分：鍵合相色譜法（bonded phase chromatography，BPC）毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）毛細(xì)管電色譜法（capillary electro-chromatography， CEC）吸附色譜法（adsorption chromatography）分配色譜法（partition chromatography）空間排阻色譜法（steric exclusion chromatography，SEC）離子交換色譜法（ion exchange chromatography，IEC）3. 按操作

8、形式分類 紙色譜法（PC） 平面色譜 薄層色譜法（TLC） LLC LSC SEC IEC GSC GLC LSC BPC SEC柱色譜法 GC經(jīng)典液相色譜HPLCSFCCE，CEC色譜法色譜法的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢現(xiàn)狀：理論、技術(shù)和方法趨于成熟發(fā)展：新型固定相和檢測器的研制 色譜新方法的研究 色譜聯(lián)用技術(shù) 色譜專家系統(tǒng) 9-2 色譜過程與術(shù)語一、色譜過程以吸附色譜為例見圖示 吸附 解吸再吸附 再解吸 反復(fù)多次洗脫被測組分分配系數(shù)不同 差速遷移 分離色譜流出曲線和色譜峰二、色譜圖工業(yè)二甲苯中的雜質(zhì)分析從色譜圖上，可以得到許多重要信息： （l）根據(jù)色譜峰的個(gè)數(shù)，可以判斷樣品中所合組份的最少個(gè)數(shù) （2）

9、根據(jù)色譜峰的保留值(或位置），可以進(jìn)行定性分析 (3) 根據(jù)色譜峰下的面積或峰高，可以進(jìn)行定量分析 （4）色譜峰的區(qū)域?qū)挾?，是評(píng)價(jià)色譜柱分離效能的依據(jù) （5）色譜峰兩峰間的距離，是評(píng)價(jià)固定相(和流動(dòng)相)選擇是否合適的依據(jù) 1.基線 在操作條件下，沒有組分流出時(shí)的流出曲線三、常用術(shù)語與測定參數(shù)噪聲和漂移 在沒有樣品進(jìn)入檢測器的情況下，由于檢測器本身及其它操作條件（如柱內(nèi)固定液流失，橡膠隔墊流失、載氣、溫度、電壓的波動(dòng)、漏氣等因素）使基線在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生起伏的信號(hào)，稱為噪聲。（noise，N），單位用mV或pA表示。 基線隨時(shí)間向一個(gè)方向的緩慢變化稱為漂移（drift，d），單位用mVh1或 pAh

10、1表示 tC2峰高 色譜峰頂點(diǎn)與基線之間的垂直距離稱為色譜峰高，用表示。如圖9-3中BA段。3色譜峰區(qū)域?qū)挾?色譜峰寬有三種表示方法：（1） 標(biāo)準(zhǔn)差 正態(tài)色譜流出曲線上兩拐點(diǎn)間距離之半，即正常峰0.607倍峰高處峰寬的一半。 的大小表示組分被帶出色譜柱的分散程度。 （2）半峰寬W1/2 即峰高一半處對應(yīng)的峰寬，它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： W1/2 = 2.355（3） 峰寬W 即色譜峰兩側(cè)拐點(diǎn)上的切線在基線上的截距，它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系是： W = 4或 W =1.699 W1/2 h0.882hw=1 0.607h0.50h0.344h0.134h0.044hw=2 (拐點(diǎn))w=2.354 w=3

11、 w=4 w=5 Wb=4 響應(yīng)值或濃度時(shí)間或體積A=1.065(h)(W1/2)第11章113 正常峰（對稱）0.95 T 1.05拖尾因子計(jì)算公式4拖尾因子 T0.95 T1.05非正常峰前沿峰拖尾峰 分配系數(shù)為零的組分，即不被固定相吸附或溶解的物質(zhì)進(jìn)入色譜柱時(shí)，從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值所需的時(shí)間。（1）死時(shí)間 tM (t0)5.保留時(shí)間（2）保留時(shí)間 tR 試樣從進(jìn)樣開始到柱后出現(xiàn)峰極大點(diǎn)時(shí)所經(jīng)歷的時(shí)間。它是色譜法的基本定性參數(shù)。保留時(shí)間的單位分或秒tR = tR tM 組份在色譜柱中的保留時(shí)間tR包含了組份隨流動(dòng)相通過柱子所需的時(shí)間和組份在固定相中滯留所需的時(shí)間，（3）調(diào)整保留時(shí)間 tR

12、所以tR實(shí)際上是組份在柱中固定相停留的時(shí)間 色譜柱在填充后，柱管內(nèi)固定相顆粒間所剩留的空間、色譜儀中管路和連接頭間的空間以及進(jìn)樣器和檢測器的空間的總和當(dāng)后叁項(xiàng)很小而可忽略不計(jì)時(shí)，死體積可由死時(shí)間與流動(dòng)相體積流速Fc（mLmin）計(jì)算： VM = tM Fc （1）死體積 VM6保留體積（2）保留體積 VR 從進(jìn)樣開始到被測組份在柱后出現(xiàn)濃度極大點(diǎn)時(shí)所通過的流動(dòng)相體積。保留體積與保留時(shí)間tR 的關(guān)系如下： VR = tRFC 因?yàn)榱鲃?dòng)相流速大，保留時(shí)間短，但兩者的乘積不變， 因此VR與流動(dòng)相流速無關(guān)。 某組份的保留體積扣除死體積后，稱該組份的調(diào)整保留體積，即 VR= VR - VM（3）調(diào)整保留

13、體積VR 7相對保留值i,s 由于相對保留值只與柱溫、流動(dòng)相及固定相的性質(zhì)有關(guān)，而與柱徑、柱長、填充情況及流動(dòng)相流速無關(guān)，因此，它是色譜法中，特別是GC中，廣泛使用的定性參數(shù)。 必須注意，相對保留值絕對不是兩個(gè)組份保留時(shí)間或保留體積之比 。 某組份i 的調(diào)整保留值與參照（基準(zhǔn)）物質(zhì)S的調(diào)整保留值之比，稱為相對保留值：8. 選擇性因子混合物色譜圖中組分2與組分1的調(diào)整保留時(shí)間之比 如果兩組分的K或k值相等，則=1，兩個(gè)組分的色譜峰必將重合，說明分不開。兩組分的K或k值相差越大，則分離得越好。因此兩組分具有不同的分配系數(shù)或容量因子是色譜分離的前提！項(xiàng) 目相對保留值選擇因子值 域1ris或ris 1

14、1用 途定性參數(shù)，用于物質(zhì)的定性。通常不用于衡量色譜柱的選擇性。非定性參數(shù)，僅用于衡量色譜柱的選擇性。注意選擇因子與相對保留值的區(qū)別!（ 1）分配系數(shù) K 如前所述，分配色譜的分離是基于樣品組分在固定相和流動(dòng)相之間反復(fù)多次地分配過程，而吸附色譜的分離是基于反復(fù)多次地吸附-脫附過程。這種分離過程經(jīng)常用樣品分子在兩相間的分配來描述，而描述這種分配的參數(shù)稱為分配系數(shù)。它是指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動(dòng)相之間分配達(dá)平衡時(shí)的濃度之比值，即 9.分配系數(shù)與分配比（2）分配比k 分配比又稱容量因子，它是指在一定溫度和壓力下，組分在兩相間分配達(dá)平衡時(shí)，分配在固定相和流動(dòng)相中的質(zhì)量比。即 k 值越大，

15、說明組分在固定相中的量越多，相當(dāng)于柱的容量大，因此又稱分配容量或容量因子。它是衡量色譜柱對被分離組分保留能力的重要參數(shù)。K 值也決定于組分及固定相熱力學(xué)性質(zhì)。它不僅隨柱溫、柱壓變化而變化，而且還與流動(dòng)相及固定相的體積有關(guān)。 Vs為柱中固定相的體積，在各種不同的類型的色譜中有不同的含義。例如：在分配色譜中，Vs表示固定液的體積；在空間排阻色譜中，則表示固定相的孔體積。（3）分配系數(shù)K與容量因子k的關(guān)系 其中稱為相比（率），它是反映各種色譜柱型 特點(diǎn)的又一個(gè)參數(shù)。例如，對填充柱，其值一般為635；對毛細(xì)管柱，其值為60600。 10保留值與容量因子的關(guān)系 當(dāng)物質(zhì)在兩相間的分布達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，從微觀

16、出發(fā)，一個(gè)樣品分子在流動(dòng)相中出現(xiàn)的幾率(即在流動(dòng)相中停留的時(shí)間分?jǐn)?shù))可用 表示。若 =1/3，則表示這個(gè)分子有1/3的時(shí)間在流動(dòng)相，而有2/3的時(shí)間在固定相。 從宏觀出發(fā)，對于大量的溶質(zhì)分子而言，則表示有1/3的量在流動(dòng)相，有2/3（即1- ）的量在固定相中。因此（9-15）整理上式即得 （9-16） 當(dāng) =1時(shí)，溶質(zhì)全部隨流動(dòng)相前移，不能進(jìn)入固定相，不被保留； 當(dāng) =0時(shí)，溶質(zhì)全部進(jìn)入固定相，不隨流動(dòng)相前移?？梢?在0l之間，它可用于衡量溶質(zhì)被保留的情況，所以 又稱保留因子。 也可用于表示溶質(zhì)分子流經(jīng)整個(gè)柱的相對移動(dòng)速度。若 =1/3，則表示溶質(zhì)分子在柱中移動(dòng)的速度相當(dāng)于流動(dòng)相移動(dòng)速度的1/3。因?yàn)閠M表示流動(dòng)相分子流經(jīng)整個(gè)色譜柱的時(shí)間，所以溶質(zhì)分子流經(jīng)同樣路程的保留時(shí)間tR將是tM 的l 倍。即（9-17）