重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞課件

1、第七章 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 載體與目的基因連接后，體系中可能存在下列分子：a. 未連接的載體分子b. 未連接的DNA片段c. 載體的自連d. 含有錯(cuò)誤插入片段的重組DNA分子e. 重組DNA分子 轉(zhuǎn)化過程中，這些分子同時(shí)被轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)。 未連接的分子即使被細(xì)菌攝取，只有在特殊的條件下才能復(fù)制，寄主的酶可降解這些DNA片段。 自連的載體和錯(cuò)誤插入的重組質(zhì)?？梢赃M(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行正常的復(fù)制一、轉(zhuǎn)化方法 自然界中，轉(zhuǎn)化并不是細(xì)菌遺傳信息傳遞的主要方式，實(shí)驗(yàn)室中只有小部分的細(xì)菌可以很容易的轉(zhuǎn)化。 正常條件下，大部分細(xì)菌包括大腸桿菌，只能吸收有限的DNA，為了提高轉(zhuǎn)化效率，建立了一系列的轉(zhuǎn)化方法：

2、 供體菌游離DNA供體菌DNA（轉(zhuǎn)化因子）轉(zhuǎn)化示意圖 a. 熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 b. PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 c. 高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化 d. 顯微注射法轉(zhuǎn)化 e. 接合轉(zhuǎn)化f. 噬菌體轉(zhuǎn)染 大腸桿菌常用轉(zhuǎn)化方法的比較 轉(zhuǎn) 化 方 法轉(zhuǎn) 化 效 率Ca 誘 導(dǎo)107-8原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化105-6噬菌體轉(zhuǎn)化107-8電 穿 孔 法106-9（100Kb）接 合 轉(zhuǎn) 化104-5一）受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 a. 限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、內(nèi)切酶） b. 重組整合缺陷型RecA-（對(duì)于用于基因擴(kuò)增或基因高效表達(dá)的受體） c. 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 d. 具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀

3、 e. 感染與寄生缺陷型 安全角度的要求。 二）大腸桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化 感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells): 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細(xì)胞(competent cells) 。1、熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞2、氯化鈣法轉(zhuǎn)化 在某些情況下，CaCl2只影響DNA的結(jié)合，并不影響細(xì)胞的吸收，當(dāng)DNA分子加到處理的細(xì)胞內(nèi)，仍然吸附在細(xì)胞的外部，并沒有轉(zhuǎn)化到細(xì)胞質(zhì)中，將DNA帶入感受態(tài)細(xì)胞的條件可提高溫度到42。 3、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化4、高壓電穿孔法（1）基本原理在高壓電場(chǎng)的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生臨時(shí)性破裂形成微

4、孔，細(xì)胞外環(huán)境中的核酸分子便會(huì)穿孔而入，并最終進(jìn)到細(xì)胞核內(nèi)部。(2)影響因素脈沖的最大電壓 脈沖持續(xù)的時(shí)間 與DNA濃度則無多大關(guān)系電穿孔轉(zhuǎn)染效率主要取決于所用的細(xì)胞類型。對(duì)于不適合用傳統(tǒng)方法轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，用電穿孔法得到的永久轉(zhuǎn)化的頻率約為10-410-5之間。5、顯微注射法轉(zhuǎn)化在顯微鏡下，用顯微操作裝置對(duì)細(xì)胞進(jìn)行解剖手術(shù)、人工受精、細(xì)胞核移植、基因注入、細(xì)胞內(nèi)微量注射、胚胎切割等的技術(shù)。（1）真正的顯微注射(true microinjection)法 DNA是由注射針直接注入細(xì)胞（2）“穿刺”(pricking)導(dǎo)入法 DNA是處在細(xì)胞周圍培養(yǎng)基中，它通過穿刺形成的小孔進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)部，或是隨穿

5、刺的針頭一道進(jìn)入的。 用顯微注射法轉(zhuǎn)移基因的效率明顯地超出其它方法。顯微注射用的受體細(xì)胞，多數(shù)是沿培養(yǎng)皿貼壁生長(zhǎng)的單層細(xì)胞。顯微注射分為 6、接合轉(zhuǎn)化不需要細(xì)菌細(xì)胞的直接接觸基因重組的范圍更小，只限于更小的一段染色體片段和少數(shù)幾個(gè)緊密連鎖的基因 細(xì)菌的“接合”狀態(tài)接合- F+FF+F-F+F-F+F+F+F+DonorRecipient染色體染色體質(zhì)粒F+菌F- 菌F質(zhì)粒的半保留轉(zhuǎn)移F+菌染色體Hfr質(zhì)粒F+菌F質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的不同結(jié)果F 質(zhì)粒二、phage DNA的轉(zhuǎn)化 兩種方法可以將噬菌體DNA轉(zhuǎn)入細(xì)菌：1） 轉(zhuǎn)染（transfection）：是將純化的噬菌體DNA通過熱激的方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的過程。2） 體外裝配（in vitro packaging）： DNA的轉(zhuǎn)染效率不高，如果將重組的分子裝配成頭-尾結(jié)構(gòu)的病毒粒子，將極大的提高效率。 噬菌體轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法 一） DNA的轉(zhuǎn)染 DNA的轉(zhuǎn)染作用，是一種低效的過程。使用未經(jīng)任何基因操作處理的新鮮制備的 DNA，其典型的轉(zhuǎn)染效率（即每微克DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目），也僅為 105106之間。體外連接的結(jié)果，轉(zhuǎn)染效率便下降到了104103左右。二）噬菌體的體外裝