本科《食品生物技術(shù)導(dǎo)論》課件第二章（1） 基因工程的基本原理及基本過程-

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第二章基因工程的基本原理及基本過程主講教師： 朱本忠2002 年 9 月中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室食品生物技術(shù)對(duì)人類的作用解決食品短缺，緩解由于人口增長(zhǎng)帶來的壓力。豐富食品種類，滿足不同層次消費(fèi)人群的需求。（全球人口膨脹，“中國(guó)威脅論”）（提高生活質(zhì)量）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室開發(fā)新型功能型食品，保障人類健康。生產(chǎn)環(huán)保型食品，保護(hù)環(huán)境。開發(fā)新資源食品，拓寬食物來源。食品生物技術(shù)對(duì)人類的作用（保健食品，功能食品）（減少環(huán)境污染，降低腐爛率）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室生物工程下游技術(shù)現(xiàn)代分子檢測(cè)技術(shù)酶工程發(fā)酵工程蛋白質(zhì)工程

2、細(xì)胞工程倫理學(xué)電子學(xué)分子生物學(xué)微生物學(xué)生物化學(xué)免疫學(xué)食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)化學(xué)工程基因工程食品生物技術(shù)研究?jī)?nèi)容關(guān)系樹中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室本章應(yīng)掌握的主要內(nèi)容基因工程的概念和主要內(nèi)容基因工程的原理和關(guān)鍵技術(shù)反義基因技術(shù)的概念、原理基因工程在食品中的應(yīng)用中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第一節(jié)基因工程的基本原理和內(nèi)容DNA（脫氧核糖核酸）RNA（核糖核酸）基因中心法則一、基本概念中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1、DNA（脫氧核糖核酸）由兩條極性相反并互補(bǔ)的多聚核苷酸鏈圍繞中心軸的雙螺旋結(jié)構(gòu)。2.兩條鏈中的堿基之間按照A配T,G配C的互補(bǔ)原則，以氫鍵連接。 其中A為：腺嘌

3、呤 T為：胸腺嘧啶 G為：鳥嘌呤 C為：胞嘧啶 U為：尿嘧啶 (RNA)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室DNA雙螺旋堿基配對(duì)圖中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4.DNA有自我復(fù)制的能力。DNA（脫氧核糖核酸）DNA線性排列于染色體上，存在于細(xì)胞核中。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室DNA自我復(fù)制示意圖中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、RNA（核糖核酸）存在于細(xì)胞質(zhì)中分別有三種功能不同的RNA mRNA tRNA rRNAmRNA包含遺傳密碼，由DNA轉(zhuǎn)錄而來中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室RNA蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄DNA翻譯3、中心法則自我復(fù)制中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采

4、后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4、有關(guān)基因的概念基因是含有一定功能的DNA片段，是遺傳的基本單位。獲取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆。找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色體上的位置叫基因定位。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定出某段有一定生理功能的DNA片段的堿基序列叫基因測(cè)序。按照一定的堿基序列，以核苷酸為原料，合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成。4、有關(guān)基因的概念中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室二、基因工程是生物技術(shù)的核心內(nèi)容是現(xiàn)代高新技術(shù)的標(biāo)志之一是世界科學(xué)技術(shù)革命的重要組成部分Genetic Engineering中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室解決人類生

5、存和發(fā)展的重要手段科學(xué)技術(shù)發(fā)展的火車頭1、基因工程（意義）帶動(dòng)農(nóng)業(yè)科學(xué)，醫(yī)學(xué)，環(huán)境科學(xué)，信息科學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展。解決食品保證安全，揭開生命的奧秘，治療疾病。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室強(qiáng)大的社會(huì)倫理沖擊力涉及復(fù)雜的政治、外交斗爭(zhēng)手段人類思想進(jìn)步的推動(dòng)者1、基因工程（意義）遺傳物質(zhì)的傳遞打破倫理限制物種間的平等，解釋宇宙生命現(xiàn)象，破除迷信和邪教黨派斗爭(zhēng)，國(guó)際貿(mào)易爭(zhēng)端中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、基因工程概念 用人工的方法把不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）分離出來，在體外進(jìn)行剪切、拼接、重組，形成重組體，然后把重組體引入寄主細(xì)胞或個(gè)體中，使其得到高效表達(dá)，最終得到人們所需要的基因

6、產(chǎn)物。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、基因工程的要點(diǎn)切接貼檢中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品基因工程基本過程酶切酶切連接轉(zhuǎn)化表達(dá)重組體（目的基因）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4、基因工程基本過程 利用重組DNA技術(shù)，在體外通過人工“剪切”（cut）和“拼接”（splice）等方法，對(duì)生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，使重組基因在受體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出人類需要的基因產(chǎn)物。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室在供體細(xì)胞中用限制性內(nèi)切酶切割基因，以分離出含有特定基因片段或人工合成的目的基因并制備載體。把獲得的目的基因與制備好的載體用DNA連接酶連接

7、組成重組體。5、基因工程主要內(nèi)容1.2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室把重組體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。篩選、鑒定出含有外源目的基因的菌體和個(gè)體。3.4.基因工程主要內(nèi)容中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室目的基因的獲得 載體的選擇6、基因工程的一般操作步驟轉(zhuǎn)基因生物的鑒定轉(zhuǎn)基因重組體的獲得導(dǎo)入目標(biāo)生物體細(xì)胞內(nèi)重組質(zhì)粒的構(gòu)建中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室7、所用的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)原核生物細(xì)胞中克隆載體的提取真核生物細(xì)胞中外源DNA的提取目的基因克隆如質(zhì)粒提取如基因組DNA的提取如PCR技術(shù)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室所用的技術(shù)基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)表達(dá)載體的構(gòu)建基因轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)基因鑒定技術(shù)如D

8、NA酶切、連接、轉(zhuǎn)化如農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化如Southern雜交中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室8、所采用的基本工具切接貼檢限制性內(nèi)切酶DNA連接酶載體雜交切割DNA分子連接DNA分子基因轉(zhuǎn)化基因鑒定中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室9、食品基因工程定義 利用基因工程的技術(shù)和手段，在分子水平上定向重組遺傳物質(zhì)，改良食品的品質(zhì)和性狀，提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、貯藏加工性狀以及感官性狀的技術(shù)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室10、基因工程的特點(diǎn)可以大大縮短育種年限。生物的基因可以在人類、動(dòng)物、植物和微生物四大系統(tǒng)間進(jìn)行交流。對(duì)物種定向改造。（常規(guī)育種，輻射育種，航天育種）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品

9、學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室11、基因工程研究的對(duì)象 研究生物大分子，如：蛋白質(zhì)、核酸、多糖等調(diào)節(jié)生命過程的物質(zhì)，包括它們的功能、性狀、代謝。 如Bt蛋白，反義抑制基因表達(dá)，油脂改良，植物疫苗。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室12、基因工程的發(fā)展概況1972年,Berg等首次用限制性內(nèi)切酶Eco RI切割病毒SV40DNA和噬菌體DNA,組成重組DNA分子。這是首次DNA重組實(shí)驗(yàn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1973年，Cohen將傷寒沙門氏菌抗鏈霉素質(zhì)粒與大腸桿菌抗四環(huán)素質(zhì)粒在體外重組，獲得異源的重組質(zhì)粒DNA，并把重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌中，建立了抗四環(huán)素和抗鏈霉素的重組質(zhì)粒DNA，

10、標(biāo)志著基因工程的出現(xiàn)。12、基因工程的發(fā)展概況中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室12、基因工程的發(fā)展概況1986年，美國(guó)和英國(guó)科學(xué)家首次進(jìn)行了抗除草劑轉(zhuǎn)基因煙草的田間實(shí)驗(yàn)。此后，基因工程技術(shù)迅猛發(fā)展，已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室12、基因工程的發(fā)展概況2000年全球的轉(zhuǎn)基因作物種植面積有4420萬hm2，為1996年的25倍。轉(zhuǎn)基因作物種植面積最大的前4個(gè)國(guó)家是美國(guó)、阿根廷、加拿大、中國(guó)，占全球的99.9%。我國(guó)商品化的轉(zhuǎn)基因植物為：轉(zhuǎn)基因耐貯番茄，轉(zhuǎn)查爾酮合成酶基因矮牽牛，抗病毒甜椒，抗病毒番茄，抗蟲棉和保齡棉等。中國(guó)農(nóng)業(yè)

11、大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第二節(jié) 工具酶和基因載體一、基因工程的工具酶種類：限制性內(nèi)切酶連接酶核酸酶堿性磷酸酶逆轉(zhuǎn)錄酶中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（一）限制性內(nèi)切酶1、發(fā)現(xiàn)：60年代初W.Arber等首次發(fā)現(xiàn)。大腸桿菌E.coli BE.coli BE.coli K噬菌體中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室限制和修飾系統(tǒng)限制作用：一定類型的細(xì)菌可以通過限制性酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA，導(dǎo)致其侵染受到限制。修飾作用：寄主本身的DNA由于合成后通過甲基化酶的作用得到甲基化，使DNA得到修飾，從而免遭自身限制性酶的破壞。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室限制和修飾系統(tǒng)通常，

12、用于基因轉(zhuǎn)化的菌株為：（2）缺乏限制和修飾功能的菌株。（1）缺乏限制功能而具有修飾功能；中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、限制性內(nèi)切酶的定義在細(xì)菌中有一種能夠在特定位置上切割DNA分子的酶，這種酶就被稱為限制性內(nèi)切酶。Restriction enzyme, 簡(jiǎn)稱RE中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、限制性內(nèi)切酶的分類(I,II,III)I型：多聚體蛋白質(zhì)。作用時(shí)需要ATP、Mg2+、SAM。與DNA上未修飾的識(shí)別序列相互作用，然后沿DNA分子移動(dòng)，在1000-5000個(gè)核苷酸距離后隨機(jī)切割單鏈DNA。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、限制性內(nèi)切酶的分類(I,II,III

13、)II型：分子量較小的單體蛋白質(zhì)。作用時(shí)僅需要Mg2+即可維持活性。能在特殊位點(diǎn)切割DNA，產(chǎn)生具有粘性末端或其他形式的DNA分子片段。廣泛應(yīng)用于基因工程。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、限制性內(nèi)切酶的分類(I,II,III)III型：一些具有獨(dú)特識(shí)別方式和切割方式的內(nèi)切酶。如Mbo II5-GAAGANNNNNNNN-35-CTTCTNNNNNNN-3 識(shí)別位點(diǎn) 切割位點(diǎn)N：指任意一個(gè)堿基中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4、II型限制性內(nèi)切酶的命名和作用特點(diǎn)命名原則:用具有某種限制性酶的有機(jī)體學(xué)名縮寫來命名。用有機(jī)體屬名第一個(gè)字母（大寫，斜體）和種名的前兩個(gè)字母（小寫，斜體）

14、構(gòu)成基本名稱。如果酶存在于特殊菌株中，則還加上菌株名稱的符號(hào)。最后的羅馬數(shù)字表示從該菌株中發(fā)現(xiàn)此酶的先后順序。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室命名舉例：Hae II從Haemophilus aegypticus中提取的，并且是從中發(fā)現(xiàn)的第二種限制性酶。Hin fI從Haemophilus influenzae菌株f中純化而得的。Eco RI從大腸桿菌Escherichia coli中分離出來的，R表示這種酶的基因在R質(zhì)粒上。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室作用特點(diǎn)：識(shí)別位點(diǎn)序列一般是4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)或8個(gè)堿基對(duì)。識(shí)別位點(diǎn)一般都是回文結(jié)構(gòu)。5GAATTC35CTTAAG3Eco RI

15、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室作用特點(diǎn)：產(chǎn)生粘性末端或平齊末端。粘性末端平齊末端5GAATTC33CTTAAG55G AATTC3 3CTTAA G5Eco RI酶切(Cohesive ends)5GTTAAC35CAATTG35GTT AAC35CAA TTG3(blunt ends)Hpa I酶切中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室作用特點(diǎn)：同裂酶 是指來自不同有機(jī)體但識(shí)別和切割相同DNA序列的酶。 如Hin d III與Hsu I就是同裂酶。同尾酶 指來自不同有機(jī)體，并且不同識(shí)別序列的酶，但在切割DNA分子后，產(chǎn)生相同的末端，這種酶稱為同尾酶。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)

16、驗(yàn)室作用特點(diǎn)：消化條件必須堅(jiān)持應(yīng)用推薦的反應(yīng)條件。當(dāng)反應(yīng)條件改變時(shí)酶的專一性可能降低，以至同一種酶可識(shí)別和切割更多的位點(diǎn)，酶活性發(fā)生這種改變，常常在酶上加上星號(hào)，簡(jiǎn)稱為酶的星活性。如Eco RI* 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室5、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的終止適用于大多數(shù)限制性內(nèi)切酶。65 ，溫浴5分鐘。變性劑：如尿素或SDS。耐熱的酶如Bam HI和Hae III。DNA純化：酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室6、限制性內(nèi)切酶的主要用途在特異性位點(diǎn)上切割DNA，產(chǎn)生特異性限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段。建立DNA分子的限制性內(nèi)切酶物理圖譜。構(gòu)建基因文庫。用限制性內(nèi)

17、切酶切出相同的粘性末端，以便重組DNA。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（二）DNA連接酶能將兩段DNA拼接起來的酶叫DNA連接酶。POHPOHPOHOHP催化DNA相鄰的5磷酸基和3羥基末端形成磷酸二酯鍵。粘性平端中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1、種類大腸桿菌連接酶需要NAD+（煙酰胺單核苷酸）只能連接粘性末端DNA片段T4連接酶需要ATP能連接粘性末端，也能連接平齊末端中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、影響連接反應(yīng)的因素溫度，離子濃度，DNA末端特性，DNA末端的濃度和分子量。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（1）粘性末端的連接最適連接溫度是粘性末端Tm值和DN

18、A連接酶作用最適溫度的折中，常用溫度為14 。使外源DNA片段濃度比載體DNA高10-20倍，可減少載體自連現(xiàn)象。用堿性磷酸酶預(yù)處理質(zhì)粒載體。（無磷酸基不能連接，而外源DNA片段帶有磷酸基）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（2）平齊末端的連接最適連接溫度應(yīng)接近反應(yīng)中最小片段的Tm值，但不要超過37。高濃度的ATP會(huì)抑制平齊末端的連接。連接反應(yīng)復(fù)雜，速度顯著減慢。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（三）DNA聚合酶：負(fù)責(zé)DNA的復(fù)制或合成聚合酶I聚合酶II聚合酶III特性分子量結(jié)構(gòu)基因合成速度3外切活性5外切活性pol Apol Bpol C19000120001400016-20/s

19、2-5/s250-1000+-+大腸桿菌中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室基因工程常用聚合酶1、大腸桿菌DNA聚合酶I特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性5-3外切核酸酶活性切口平移法標(biāo)記DNA5-3外切活性降解核酸作為cDNA合成引物3端標(biāo)記進(jìn)行序列分析中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室基因工程常用聚合酶2、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性隨機(jī)引物法標(biāo)記DNA3端末端標(biāo)記3端標(biāo)記進(jìn)行序列分析補(bǔ)平粘性末端cDNA第二條鏈的合成雙脫氧法DNA測(cè)序中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室基因工程常用聚合酶3、T4噬菌

20、體DNA聚合酶特性用途5-3DNA聚合酶活性3-5外切核酸酶活性標(biāo)記3突出端DNA分子將雙鏈DNA末端轉(zhuǎn)化為平端使結(jié)合于模板的誘變引物延伸補(bǔ)平或標(biāo)記粘性末端5-3外切核酸酶活性中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4、T7噬菌體DNA聚合酶特性用途已知DNA合成酶中持續(xù)合成能力最強(qiáng)。3-5外切核酸酶活性為Klenow的1000倍用于長(zhǎng)片段模板的引物延伸反應(yīng)通過補(bǔ)平和交換反應(yīng)進(jìn)行快速末端標(biāo)記基因工程常用聚合酶中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室5、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）特性用途從噬熱菌中純化而來。5-3外切核酸酶活性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對(duì)DNA片段進(jìn)行體外擴(kuò)增DNA測(cè)序基因工程常用聚

21、合酶耐熱的DNA聚合酶中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室6、末端轉(zhuǎn)移酶特性用途在DNA分子3端加上多個(gè)脫氧核苷酸（A或G或T或C）不需模板，需要Co2+給載體或cDNA加上互補(bǔ)的同聚尾巴DNA片段3末端的放射同位素標(biāo)記基因工程常用聚合酶中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室(四）堿性磷酸酶一種是大腸桿菌的BAP一種是牛小腸的CIP催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5磷酸基，產(chǎn)生5羥基。去除DNA和RNA的5磷酸基，經(jīng)過標(biāo)記后進(jìn)行序列分析。去除載體DNA的5磷酸基，防止載體自連。用途特性中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（五）S1核酸酶是特異性單鏈核苷酸外切酶，能降解單鏈DNA

22、和單鏈RNA。去除DNA片段的單鏈突出端，使DNA成為平端。去除cDNA合成時(shí)形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。用S1核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因表達(dá)分析內(nèi)含子在基因組DNA中的定位。修整漸進(jìn)性刪除突變的末端特點(diǎn)用途中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（六）逆轉(zhuǎn)錄酶催化以單鏈RNA為模板生成雙鏈DNA的反應(yīng)。RNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)DNA指導(dǎo)的DNA合成反應(yīng)RNA的水解反應(yīng)特性用途中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室RNA蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄DNA翻譯自我復(fù)制中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室二、基因工程載體(vector)能在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行獨(dú)立和穩(wěn)定的DNA自我復(fù)制。易于從宿主細(xì)胞中分離，并進(jìn)行純化。在其DN

23、A序列中有適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶單一酶切位點(diǎn)。具有能夠直接觀察的表型特征。理想載體應(yīng)具備的特征中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（一）質(zhì)粒載體 質(zhì)粒(plasmid)是一種小的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)胞中能獨(dú)立于染色體外進(jìn)行自我復(fù)制，并包含各種功能的基因。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建質(zhì)粒載體應(yīng)考慮的方面分子量盡可能的小。了解載體上基因的位置、限制性內(nèi)切酶的作用位點(diǎn)。在理想寄主中，載體應(yīng)該容易繁殖。載體應(yīng)包含一個(gè)可供選擇的標(biāo)記性狀，從區(qū)別轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。應(yīng)最大限度地具有各種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室舉例：pBR332大小為4363bp。

24、含有抗氨芐青霉素基因和抗四環(huán)素基因。抗四環(huán)素基因基因里有單一Bam HI,Hind III,Sal I酶切位點(diǎn)。抗氨芐青霉素基因里有單一的Pst I酶切位點(diǎn)。帶有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，在大腸桿菌里高拷貝存在。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室舉例：pUC19多克隆位點(diǎn)。含有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因藍(lán)白斑篩選重組體。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室舉例：酵母質(zhì)粒載體 它既可在大腸桿菌中復(fù)制與擴(kuò)增，又可以在酵母系統(tǒng)中復(fù)制與擴(kuò)增，故又可稱為穿梭質(zhì)粒(shuttle vector)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室選擇酵母載體應(yīng)考慮的因素：有適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌和酵母遺傳標(biāo)志?？紤]在酵母中的復(fù)制方

25、式。在酵母和大腸桿菌中的拷貝數(shù)。簡(jiǎn)單易行的篩選插入物的方式。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室酵母質(zhì)粒載體種類酵母整合型質(zhì)粒(Yeast intergrating plasmids,YIp)酵母附加體質(zhì)粒(Yeast episomal plasmid,YEp)酵母的復(fù)制型質(zhì)粒(Yeast replicating plasmid,YRp)酵母著絲粒質(zhì)粒(Yeast centromere plasmids,YCp)酵母絲狀質(zhì)粒(Yeast linear plasmid,YLp)酵母表達(dá)載體(Yeast expression vector)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室酵母表達(dá)載體通過酵

26、母表達(dá)載體，使外源基因在酵母內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生人們所需的蛋白質(zhì)。載體包括有效的啟動(dòng)子序列（誘導(dǎo)性或組成性）、目的基因cDNA和轉(zhuǎn)錄終止子）產(chǎn)品：乙肝疫苗，胰島素，水蛭素等。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室舉例：農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體1、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒一般特性： 是土壤微生物根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 中的天然質(zhì)粒，通過植物傷口，可以侵染廣泛的雙子葉植物，最終誘導(dǎo)植物傷口組織的增生形成冠癭瘤，并在冠癭瘤里合成冠癭堿。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)桿菌誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒誘導(dǎo)冠癭瘤的形成植物DNAT-DNA農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA冠癭瘤中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生

27、物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室冠癭瘤是農(nóng)桿菌唯一的碳源和氮源，其他生物不能利用。冠癭堿包括章魚堿和胭脂堿。Ti質(zhì)粒也分為章魚堿型和胭脂堿型中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室Ti質(zhì)粒的重要區(qū)域：1.T-DNA（transfer DNA）區(qū)域2.vir區(qū)域：毒性區(qū)3.吸收和利用冠癭堿的區(qū)域4.其他區(qū)域中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室Ti質(zhì)粒改造原則：保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能。取消T-DNA的致瘤性，使之不干擾植株細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化。通過簡(jiǎn)便的手段可使外源DNA插入DNA之中，并隨T-DNA整合到植物染色體上。Vir區(qū)域和T-DNA區(qū)域可以不在一個(gè)質(zhì)粒上。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室表達(dá)載體pB

28、I121-leCTR3示意圖中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化的優(yōu)點(diǎn)：寄主范圍廣。操作簡(jiǎn)單。轉(zhuǎn)化頻率高和可重復(fù)性高。目的基因能完整的轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，整合到植物染色體中，并符合孟德爾定律。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌侵染大多數(shù)雙子葉植物，并在傷口處引起植物細(xì)胞迅速擴(kuò)增，形成大量根毛。 Ri質(zhì)粒在結(jié)構(gòu)和功能上和Ti質(zhì)粒上具有一定的共性。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、植物病毒載體花椰菜花葉病毒(CaMV)雀麥條紋病毒(BMV)雙子座病毒(GV)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（二）噬菌體載體可作為載體，插入10-20k

29、b甚至更大的外源DNA片段，用于構(gòu)建基因文庫，加上很強(qiáng)的增殖能力，有利于基因的克隆。噬菌體是寄生在細(xì)菌中的病毒，又稱細(xì)菌病毒。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（二）噬菌體載體形態(tài)結(jié)構(gòu)頭部蛋白質(zhì)DNA+內(nèi)部蛋白質(zhì)尾環(huán)尾心尾鞘尾盤尾針尾纖絲中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1、 噬菌體生命周期溶菌期溶源期噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)，使宿主細(xì)胞發(fā)生裂解，同時(shí)釋放大約100個(gè)噬菌體顆粒。噬菌體進(jìn)入溶源循環(huán)，注入的DNA整合到大腸桿菌染色體中，與染色體一起復(fù)制，不危害寄主。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室一種線狀雙鏈分子，長(zhǎng)50kb，60多個(gè)基因DNA分子包含3個(gè)部分左臂：構(gòu)成頭部和尾部外殼蛋白

30、基因。中臂：非必需區(qū)，可用于改造。右臂： DNA復(fù)制和溶菌有關(guān)的蛋白編碼基因。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室被改造過的噬菌體載體一種置換型載體，是可被外源DNA置換的噬菌體非必需區(qū)兩側(cè)有一隊(duì)限制性酶切位點(diǎn)的載體。一種插入型載體，是只含有一個(gè)限制性位點(diǎn)可供插入外源DNA的載體。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室噬菌體包裝過程頭前體多連體DNAcos中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、M13載體是一種絲狀的特異性大腸桿菌噬菌體，又叫單鏈?zhǔn)删w載體。含有6kb-7kb的單鏈環(huán)狀DNA基因組。感染細(xì)菌后呈雙鏈復(fù)制型DNA。用途：DNA序列分析。制備雜交探針。定點(diǎn)突變中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)

31、院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室特性：允許包裝大于病毒單位長(zhǎng)度的外源DNA。感染細(xì)菌后，復(fù)制環(huán)狀DNA經(jīng)包裝形成噬菌體顆粒，分泌到細(xì)胞外而不溶菌。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（三）粘粒質(zhì)粒載體 粘粒是一種含有噬菌體cos區(qū)域、抗性基因、單一克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。 它能容納35-45kb的外源DNA，是構(gòu)建真核生物基因文庫的重要載體。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室第四節(jié) 基因工程的基本技術(shù)（一）目的基因的獲得基本概念： 插入到載體內(nèi)的非自身DNA片段稱為“外源基因”(foreign gene)。 目的基因(objective gene)，又叫靶基因(target gene)，是根據(jù)基因的目的

32、和設(shè)計(jì)所需要的某些DNA分子片段，含有一種或幾種遺傳信息的全套密碼。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1、鳥槍法染色體DNA大量基因片段連接到載體轉(zhuǎn)入受體菌基因文庫篩選單一菌落DNA分離和分析基本過程物理化學(xué)繁殖中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、物理化學(xué)法 利用核酸DNA雙螺旋之間存在著堿基G和C配對(duì)、A和T配對(duì)的特性，從生物基因組分離目的的方法。密度梯度離心法：?jiǎn)捂溍阜ǎ悍肿与s交法：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、化學(xué)合成法4、酶促逆轉(zhuǎn)錄合成法利用逆轉(zhuǎn)錄酶有mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成基因的方法。酶促cDNA合成的方法（1，2法見課本，3法用RNA酶H）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生

33、物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提取組織mRNA互補(bǔ)DNA（cDNA）雙鏈cDNA連接到載體轉(zhuǎn)入受體菌cDNA文庫篩選單一菌落DNA分離和分析中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室5、PCR擴(kuò)增法聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：Polymerase Chain Reaction, PCRPCR技術(shù)由Cetus公司Mullis等人開發(fā)的專利技術(shù)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室快速，簡(jiǎn)便，高度專一性和靈敏度。特點(diǎn)用途生物學(xué)，醫(yī)學(xué)，考古學(xué)，人類學(xué)等。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)體系：引物：20個(gè)堿基Taq酶dNTPDNA模板反應(yīng)buffer：Mg2+中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室PCR反應(yīng)基本過程：變性：

34、高溫下使DNA分子解鏈。退火：降溫使DNA分子重新配對(duì)，引物與模板結(jié)合。延伸：72 下，Taq酶作用，合成DNA分子30循環(huán)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR：錨定PCR反向PCR中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（二）DNA序列測(cè)定 是指對(duì)某一段DNA分子或片段的核苷酸排列順序測(cè)定，即測(cè)定組成DNA分子的A、T、G、C的排列順序。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室測(cè)序方法化學(xué)降解法酶促法自動(dòng)測(cè)序法中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（三）目的基因與載體的連接 所謂基因重組(gene recombination)，就是利用限制性內(nèi)切酶和其他一些酶類，切割和

35、修飾載體DNA和目的基因，并將兩者連接起來的過程。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室目的基因的獲取連接到載體轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化基因克隆基因表達(dá)篩選中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1、亞克隆 把DNA片段從某一類型的載體無性繁殖到另一類型載體，如從重組的 噬菌體克隆到質(zhì)粒，或從某種質(zhì)?？寺〉搅硪环N質(zhì)粒，這種過程稱為亞克隆(sub-cloning)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室亞克隆用到的末端形式改變方法：3凹端補(bǔ)平：3突出端切除：平端加接頭：補(bǔ)成粘性末端完全補(bǔ)平S1核酸酶Klenow大片段中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、粘性末端連接同一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)連接方向隨機(jī)性載體自連多

36、連體的形成中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室不同限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)連接方向的唯一性載體不會(huì)自連沒有多連體現(xiàn)象同裂酶和同尾酶的使用中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、平端連接內(nèi)切酶如Hae III、Hpa I等切割產(chǎn)生平齊末端。特殊情況下補(bǔ)平或切平。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室連接效率低載體自連多連體方向隨機(jī)特點(diǎn)任意兩個(gè)平端均可連接中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4、人工接頭 人工接頭是人工合成的具有特定限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端DNA短序列，將其接在目的基因片段和載體DNA上，使它們具有新的內(nèi)切酶位點(diǎn)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室5、同聚物加尾連接是

37、利用同聚物序列之間的退火作用完成的連接。利用末端轉(zhuǎn)移酶雜DNA3端添加同聚物。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（四）重組DNA向受體的轉(zhuǎn)化基因克隆的實(shí)質(zhì)目的基因重組體受體菌的擴(kuò)增目的基因的大量復(fù)制中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞的方法：1、細(xì)菌轉(zhuǎn)化 是指裸露的（或經(jīng)過純化的）DNA被細(xì)菌吸收而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室 凡是能吸收游離DNA片段的細(xì)胞，稱為感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)，或者說細(xì)胞處于感受態(tài)。正常生長(zhǎng)條件下處于感受態(tài)。經(jīng)過特殊處理才表現(xiàn)為感受態(tài)。對(duì)轉(zhuǎn)化表現(xiàn)為強(qiáng)烈抵制。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)

38、驗(yàn)室2、磷酸鈣沉淀法 利用磷酸鈣-DNA共沉淀，把外源基因與 噬菌體DNA分子的重組體導(dǎo)入大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，簡(jiǎn)稱為磷酸鈣沉淀法。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、體外包裝轉(zhuǎn)染法 用未經(jīng)包裝的病毒DNA所引起的轉(zhuǎn)化，特稱為轉(zhuǎn)染。重組體噬菌體導(dǎo)入細(xì)胞體外包裝浸染細(xì)菌中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室4、共轉(zhuǎn)化 將外源基因與報(bào)告基因共同導(dǎo)入感受態(tài)真核細(xì)胞的方法，稱為共轉(zhuǎn)化。 整合有報(bào)告基因的細(xì)胞極易識(shí)別和篩選出來，可以確定細(xì)胞內(nèi)是否存在外源基因。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室5、電轉(zhuǎn)化法 也稱電穿孔法，即在受體細(xì)胞上施加短暫、高壓的電流脈沖，是質(zhì)膜形成納米大小的微孔，DNA

39、能直接通過這些微孔，或者作為微孔閉合時(shí)所伴隨發(fā)生的膜組分重新分布而進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室6、基因槍法 它是將DNA分子吸附在由鎢或金制作的微型子彈（直徑約1m）表面，通過特制的基因槍，將子彈高速射入完整的細(xì)胞和組織內(nèi)。彈藥槍電子槍高壓氣體槍中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室7、顯微注射法 又稱微注射法，是創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的有效途徑。外源基因的制備收集受精卵顯微注射植入母體內(nèi)孕育中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室顯微注射示意圖中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)點(diǎn)：可向任何類型細(xì)胞導(dǎo)入外源基因。DNA用量極少。注入細(xì)胞

40、的DNA分子數(shù)可加以控制。整合效率可達(dá)50%-100%中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室8、脂質(zhì)體導(dǎo)入法 將DNA或RNA包埋于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合，通過融合導(dǎo)入細(xì)胞。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室9、轉(zhuǎn)化酵母菌醋酸鋰法中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（五）植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù) 植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)是指將重組DNA通過生物、物理、化學(xué)的方法導(dǎo)入植物細(xì)胞以獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)。重組DNA載體轉(zhuǎn)化法基因直接轉(zhuǎn)化法中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室載體轉(zhuǎn)化法1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化1983年1月，比利時(shí)的Montagu M. V和美國(guó)的Frally R.首先報(bào)道。是目

41、前應(yīng)用最廣泛、最成功的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、病毒衍生載體轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)載體比較小，便于操作高效率感染植物細(xì)胞高水平表達(dá)外源基因載體容量有限沒有證據(jù)表明是否能整合到植物基因中外源基因遺傳不穩(wěn)定中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、載體轉(zhuǎn)化的具體方法創(chuàng)傷植株感染法原生質(zhì)體共培養(yǎng)法葉盤法中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室植物細(xì)胞外源基因的直接轉(zhuǎn)化法 是指不需要載體，而利用物理、化學(xué)的方法將外源基因?qū)胧荏w植物細(xì)胞的技術(shù)。 在單子葉植物的基因轉(zhuǎn)移中應(yīng)用較多。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室1、電擊法2、基因槍法3、激光微束穿孔法4、細(xì)菌圓球體融合法5、多聚物

42、介導(dǎo)法：PEG法6、花粉管通道法中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（六）重組體的篩選與外源基因的鑒定 區(qū)分轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，淘汰未轉(zhuǎn)化細(xì)胞?？钩輨┗蚩股乜剐曰颍嚎敲顾刂亟M體的篩選中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)基因檢測(cè)1、報(bào)告基因的檢測(cè)法報(bào)告基因和目的基因一起被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞。報(bào)告基因是受體細(xì)胞本身基因組中不存在的。具有易于檢驗(yàn)的表型。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（1）GUS基因大腸桿菌的 葡萄糖苷酶基因D-glucuronidase,GUS5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡萄糖醛酸水解產(chǎn)物酶（藍(lán)色）（無色）中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（2）NPTII

43、基因細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn5的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。-32P-dCTP新霉素-32P中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（3）CAT基因細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。乙酰輔酶A14C氯霉素酶放射性的乙酰氯霉素中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（4）NOS基因農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的胭脂堿合成酶基因。胭脂堿紫外光下直接檢測(cè)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（5）LUC基因和GFP基因熒光素酶基因(luciferase)可轉(zhuǎn)化植株發(fā)出微弱的光，用靈敏儀器或-光片可直接檢測(cè)。水母的綠色熒光蛋白(green fluorescence protein)基因產(chǎn)物經(jīng)一定波長(zhǎng)紫外光照射可激發(fā)出綠色熒光。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室2、PCR檢測(cè)法從待檢植株DNA中是否能擴(kuò)增出目的基因片段。陽性對(duì)照：質(zhì)粒DNA陰性對(duì)照：非轉(zhuǎn)基因植株DNA陰性對(duì)照：空白對(duì)照快速，靈敏，簡(jiǎn)便假陽性多，易污染特點(diǎn)中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院采后生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室3、分子雜交檢測(cè)方法探針的制備 基因探針(probe)是一段與目的基因互補(bǔ)的核酸序列，它可以是DNA，也可以是RNA，通過與待冊(cè)測(cè)樣品DNA或