葡聚糖凝膠測(cè)蛋白質(zhì)分子量

1、葡聚糖凝膠測(cè)蛋白質(zhì)分子量 目的要求：1、學(xué)習(xí)凝膠過(guò)濾法的操作方法2、學(xué)習(xí)使用凝膠過(guò)濾法測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量 實(shí)驗(yàn)原理： 凝膠層析法（即凝膠過(guò)濾法，gelfiltration）是以具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒作為固定相，葡聚糖凝膠是由線性葡聚糖和交聯(lián)劑組成的有不同孔隙度的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)物質(zhì)在凝膠顆粒的微孔中擴(kuò)散的速率進(jìn)行分離，大分子移動(dòng)的速度快，先被洗脫出來(lái)，而小分子物質(zhì)移動(dòng)的速度慢，后被洗脫出來(lái)。 不同規(guī)格型號(hào)的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯?dāng)?shù)為凝膠得水值的10倍。例如，G-25為每克凝膠膨脹時(shí)吸水克，同樣G-200為每克干膠吸水20克。因此，“G”反映，凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分部

2、范圍。 在洗脫過(guò)程中，大分子不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部而沿凝膠顆粒間的空隙最先流出柱外，而小分子可以進(jìn)入凝膠內(nèi)部，流速緩慢，以致最后流出柱外，從而使樣品中分子大小不同的物質(zhì)得到分離。 將凝膠裝柱后，柱床體積稱為“總體積”，以Vt（totalvolume）表示。Vt是由三部分組成，包括內(nèi)水容積Vi、外水體積V0 和凝膠本身的體積Vg 。內(nèi)水容積Vi是凝膠孔隙所占的體積，即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水后的重量求得。外水體積V0指凝膠顆粒間的自由空間所占的體積，即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相體積。利用有顏色以便于觀察的蛋白質(zhì)，分子量約200萬(wàn)的藍(lán)色葡聚糖-2000通過(guò)實(shí)際測(cè)

3、量求出 。 當(dāng)樣品流經(jīng)凝膠柱時(shí)，大于孔隙的大分子完全不滲入到凝膠內(nèi)部，只需V0體積的洗脫液便可將其由一端洗脫到另一端；相反，如果樣品體積小于孔隙，則需要V0Vi體積的洗脫液，才能將它們由一端洗脫到另一端。中等分子（分子大小在上述兩種極限之間）所需洗脫液體積介于兩者之間，VeV0KdVi（0Kd1）， Kd為分配系數(shù)，它表示一種物質(zhì)在孔隙內(nèi)的滲透程度，相當(dāng)于這種物質(zhì)在孔隙內(nèi)所占體積和孔隙總體積的比值。 對(duì)某一凝膠介質(zhì)，如果兩種分子全排出，即Kd都等于零，雖然分子大小有差別，但沒有分離效果。同樣兩種分子如都能進(jìn)入內(nèi)部空隙，即Kd都等于1，它們雖然分子大小有不同，但也沒有分離效果。因此不同型號(hào)的凝膠

4、介質(zhì)，有它一定的使用范圍。 實(shí)際工作時(shí)，有時(shí)Kd1，表示凝膠對(duì)組分有吸附作用，此時(shí)VeVo+Vi，例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)超出理論計(jì)算的最大值。 不同大小分子量的蛋白質(zhì)，進(jìn)入凝膠篩孔的程度不同，其洗脫體積決定于分子大小，蛋白質(zhì)在葡聚糖凝膠柱上層析的洗脫體積和分子量的對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系。若用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在一定型號(hào)葡聚糖凝膠柱上層析，精確測(cè)其洗脫體積，并以洗脫體積Ve對(duì)分子量的對(duì)數(shù)logMW作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下層析，根據(jù)其洗脫體積即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。 試劑和材料洗脫液：0.05M Tris-HCl緩沖液（），0.1M KCl溶液：稱取12.

5、12g Tris，15g KCl，先用少量去離子水溶解，再加入濃HCl，用去離子水定容至2L。 藍(lán)色葡聚糖2000(10mg/ml)；Sephsdex G-100；牛血清白蛋白（2mg/ml)（Mr 67 000);細(xì)胞色素c（Mr 12 800） 器材 層析柱 蠕動(dòng)泵 核酸蛋白檢測(cè)儀 自動(dòng)部分收集器 記錄儀 實(shí)驗(yàn)步驟： 一、溶脹凝膠 取Sephadex G-100 3g，加200mL蒸餾水，沸水浴中溶脹5小時(shí)。待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無(wú)細(xì)顆粒為止。溶脹平衡和漂洗凈的凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。 二、裝柱 層析柱

6、必須粗細(xì)均勻，通常柱愈長(zhǎng)，分離效果愈好，但柱過(guò)長(zhǎng)，反而分離效果不好。 裝柱時(shí)，將柱垂直至于鐵架上。在柱中加約1/3柱容積的洗脫液，并趕凈尼龍膜下方氣泡，完全使柱子底部充滿液體，將柱的出口關(guān)閉。將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出。把已經(jīng)溶脹好的凝膠調(diào)成薄漿，傾入柱內(nèi)，膠粒逐漸擴(kuò)散下沉。當(dāng)沉積的膠床至23cm高時(shí)，打開柱的出口，并注意控制流速均勻直到膠裝完。待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口，再以洗脫液平衡柱層，直至層析的膠床高不變。 柱裝得是否均勻，可用藍(lán)色葡聚糖上柱檢驗(yàn)；如果色帶均勻下移，說(shuō)明柱子已裝好，可以使用。 三 上樣 保持床面的穩(wěn)定，打開柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表

7、面12mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將樣品慢慢地至柱床表面，打開出口，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口，加入少量洗脫液，再打開柱的出口，使床表面的樣品也全部滲入柱內(nèi)。這時(shí)在床表面再加洗脫液，使高出床表面35cm。 四 洗脫和收集 用L-1氯化鉀溶液以每管3ml/10min流速洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集流出液。 將各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)測(cè)得的洗脫體積Ve對(duì)它們的分子量對(duì)數(shù)作圖，則應(yīng)獲得一線性的標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 洗脫體積與分子量關(guān)系的示意圖 思考題： 凝膠層析的定義是什么？凝膠層析又稱凝膠過(guò)濾，是一種按分子量大小分離物質(zhì)的層析方法。該方法是把樣品加到充滿著凝膠顆粒的層析柱中，然后用緩沖液洗脫。大分子不能進(jìn)入凝膠